PRE-rRNA比率测量分析

摘要

本发明公开了用于检测样品中活细胞的存在的组合物和方法。包括了用于增加核酸扩增检测的灵敏度以测定样品中至少一种靶微生物存在的组合物和方法。还公开了用于检测作为样品中活微生物的动态指示物的核糖体RNA前体(pre-rRNA)的组合物和方法。

说明书

联邦资助的研究或开发

本文公开的组合物和方法是在环境保护局(EnvironmentalProtection Agency)资助的STAR研究协助协议(STAR ResearchAssistance Agreement)#FP91698201-0和#R833011下开发的。因此，政府在本发明中可具有一定权利。

技术领域

本发明涉及检测和测定样品中活细胞的存在。更具体来说，本发明涉及检测样品中以非常少的数量存在的活细胞。包括了用于检测样品中作为活微生物的动态指示物的核糖体RNA前体(pre-rRNA)的组合物和方法。

发明背景

微生物例如细菌病原体可能难以从复杂的临床和环境样品中培养。它们可能存在数量少，或处于铺板效率低下的受伤和衰老的生理状态中。样品常常具有在非选择性培养基上生长超过病原体的竞争性微生物菌群，而选择性培养基可能降低收率并针对某些菌株进行选择。大多数基于培养的检测方法需要1-3天才能产生结果，对于许多情况、特别是威胁生命的情况来说太慢。

细菌培养的一种替代方案是核酸扩增检测(NAAT)。最常用的NAAT类型——聚合酶链反应(PCR)，既快速又灵敏。PCR的局限性是它不能将活的病原体细胞与非活细胞、样品中的游离核酸和检测过程中引入的污染核酸区分开。PCR在机械上也是复杂的，并易受样品中物质的抑制。当PCR被用于评估抗微生物治疗、消毒(例如水处理)和净化方法的效力时，这些限制特别成问题。

为了提高用于活微生物的NAAT的灵敏度和特异性，降低或消除非活微生物和游离DNA的假阳性检测将是有价值的。一种方法是检测微生物的RNA而不是DNA。据认为，RNA在溶液和死细胞中不如DNA稳定。用于核糖体RNA(rRNA)或信使RNA(mRNA)的种特异性探针是已知的。然而，微生物的mRNA由于其不稳定性和低丰度而难以检测(Gedalanga和Olson.2009.开发定量PCR方法用于区分环境水样中的活细菌和非活细菌(Development of a quantitative PCR method todifferentiate between viable and nonviable bacteria in environmental watersamples.)Appl Microbiol Biotechnol.82：587-596)。相反，成熟的rRNA相当稳定，并且能够在死的细菌细胞中坚持长时间。

发明概述

为了提高对活细胞的灵敏度和特异性，可以使用用于微生物rRNA前体(pre-rRNA)的测定方法。Pre-rRNA是rRNA合成中通过多顺反子的rrs-rrl-rrf操纵子转录本的快速溶核切割而产生的中间体。前导和尾部片段随后在与核糖体装配相关的较慢反应中被移除，产生成熟的rRNA亚基。在正在生长的细菌细胞中，pre-rRNA占总rRNA的一个大的部分。Pre-rRNA甚至比细菌中表达最强的mRNA分子都明显更丰富和更容易检测。此外，在营养刺激后，它们的细胞内拷贝数快速增加，这种动态性质有助于解释临界性结果，从而提高了对样品中以非常少的数量存在的细胞进行的检测的功能灵敏度。此外，它们常常具有种特异性序列，便于通过NAAT在复杂样品中对它们进行检测。

正如在本文中所公开的，开发了检测种特异性pre-rRNA分子的NAAT。Pre-rRNA是成熟rRNA合成中的中间体。它们是丰富的细胞组分，具有高度种特异性的核苷酸序列。这使得它们成为在复杂样品中检测微生物病原体的良好的靶。当微生物细胞经历营养刺激时，Pre-rRNA的拷贝数增加几个数量级。这种响应非常快速(＜1个代时)，并且由于受刺激细胞中pre-rRNA的丰富性而易于检测。在受刺激和对照样品中对pre-rRNA进行定量PCR测量得到数值比率。如果为正，这些比率证实了样品中存在完整的、活的病原体细胞。当定量PCR信号非常弱时，正的比率增加了测定结果表示真阳性结果的可靠度。这提高了测定方法的功能灵敏度。

从下面参考附图进行的优选实施方案的详细描述中，其他特点和优点将变得明显。

附图简述

图1显示了在LB肉汤上从静止期开始的生长过程中pre-16S rRNA和成熟16S rRNA的储量(pools)。

图2显示了在静止期的牛分枝杆菌(M.bovis)BCG营养刺激后的pre-16S rRNA储量。

图3显示了在水饥饿的嗜水气单胞菌(A.hydrophila)(A)和鸟分枝杆菌(M.avium)104株(B)细胞中pre-rRNA的营养刺激的时间过程。

图4显示了活的嗜水气单胞菌(A.hydrophila)细胞的存在与pre-rRNA刺激比率(A)或次氯酸盐处理的实验室悬液中通过qPCR定量的基因组DNA(B)之间的相关性。

图5显示了在源自于单一淡水湖样品的配对刺激和对照等份试样上进行的多次RT-qPCR反应的结果。

图6列出了可以被本文公开的RPA方法靶向的靶微生物的属和种的实例。

图7显示了qPCR引物的实例，包括用于所指称生物体的供选的正向、反向和反转录酶引物。

优选实施方案的详细描述

公开了可用于本公开的组合物和方法、可以与本公开的组合物和方法联合使用、可用于制备本公开的组合物和方法或者是本公开的组合物和方法的产物的材料、组合物和组分。在本文中公开了这些以及其他的材料，并且应该理解，当这些材料的组合、亚组、相互作用、组等被公开时，尽管可能没有明确公开地具体提到这些化合物的每个不同的个体和集合性组合和排列，但它们每个都在本文中具体考虑到并描述。例如，如果公开并讨论了寡核苷酸，并且讨论了可以对多个分子包括寡核苷酸进行多个修饰，那么寡核苷酸与可能的修饰的每个和所有组合和排列都被具体考虑到了，除非特别指明不是如此。这一概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用本公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在多种可以执行的其它步骤，应该理解这些其它步骤中的每个都可以与本公开方法的任何特定实施方案或实施方案的组合一起执行，并且每个这样的组合被具体考虑到了并应该被视为已被公开。

使用不超出常规的实验，本技术领域的专业人员将识别出或能够确定本文所描述的方法和组合物的具体实施方案的等价物。这些等价物打算被所包含的权利要求书涵盖。

应该理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的而不打算限制本发明的范围，本发明的范围只受随附的权利要求书的限制。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语，具有本说明书所属技术领域的专业人员所通常理解的意义。

必须指出，当在本文中和随附的权利要求书中使用时，无具体数量的指称物包括其复数形式，除非上下文明确表明不是如此。因此，例如指称“微生物”包括多个这样的微生物，指称“该(所述)微生物”是指一种或多种微生物及其本技术领域的专业人员已知的等价物，依此类推。

本文中描述的化合物和方法利用pre-rRNA的补充作为对活微生物细胞特异的NAAT的基础。当微生物生长缓慢或停止时，pre-rRNA合成降低但是其加工继续，导致pre-rRNA储量活跃而显著的排空。当生长受限的细胞被提供新鲜营养物时，pre-rRNA储量快速得到补充。这种波动在完整的、活的微生物细胞中始终如一地发生。它们在具有游离核酸或具有其他类型的背景测定“噪音”的死细胞中不能看到。

Pre-rRNA序列具有与成熟rRNA的最高变区相当的特异性。因此，通过pre-rRNA检测可以将给定物种与其他物种的活微生物细胞区分开。此外，通过测量已用营养物短暂刺激过的样品中细胞的pre-rRNA，可以将活微生物细胞与相同物种的死细胞区分开。将刺激过的样品中存在的pre-rRNA水平与未刺激过的对照样品相比较，当刺激过的样品中种特异性pre-rRNA超过对照样品时，表明了活细胞的存在。这种比率测量方法在本文中称为Pre-rRNA比率测量分析(RPA)。

正如本文中所公开的，RPA可以通过将样品分成两份或多份等份试样来进行，其中至少一份等份试样进行营养刺激，并且至少一份等份试样作为未刺激对照进行处理。将营养刺激过的样品中pre-rRNA的水平与对照样品中的pre-rRNA水平进行比较，其中在刺激过的样品中pre-rRNA的补充表明了样品中的活细胞。

在一个实施方案中，RPA可以包括使用样品的两份相等的等份试样，其中一份等份试样进行营养刺激，而另一份保留在未营养刺激的对照中。在＜1个代时的营养刺激后，对种特异性pre-rRNA进行经比率测量进行定量，以确定pre-rRNA刺激比率值。在一个实施方案中，营养刺激可以持续靶微生物的＜1代时、＜1/2代时、＜1/3代时、＜1/4代时和＜1/8代时的时间。营养刺激步骤的持续时间对于微生物数量的甚至有限的扩增来说都是不够的。因此，RPA不会培养物富集。在一个这样的实施方案中，pre-rRNA刺激比率值是刺激过的样品中pre-rRNA水平相对于对照样品的比率。在特定实施方案中，使用pre-rRNA刺激值确定样品中活微生物细胞的存在。例如，当营养刺激过的等份试样中的pre-rRNA值大于未刺激的对照等份试样中的pre-rRNA值时，表明存在活微生物。

已经发现，在特定实施方案中，本文公开的RPA方法可用于检测活的靶微生物，所述活微生物的数量显著低于同物种的失活或死微生物。在一个实施方案中，可以执行RPA以检测样品中的活微生物，在所述样品中约0.01％至99％的靶微生物是活微生物。在一个这样的实施方案中，RPA可用于检测活的靶微生物的存在，所述活的靶微生物在样品中存在的水平为靶微生物总群体(活的+死的)的约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。当在本文中使用时，样品中活的靶微生物的百分率是活的靶微生物数量与活的和失活的两种靶微生物的总数的比较。

本文描述的RPA可以在各种不同类型的特定样品上执行。在一个这样的实施方案中，本文使用的样品可以是从可能潜在地包含目标细胞的任何所需来源或位置收集的样品。在一个实施方案中，样品可以从液体、固体、气体、复合材料、组织或任何其他所需基质获取。样品可以从户外环境或户内环境获取，或者在其他实施方案中，样品可以是从对象获取的组织、流体或拭子样品。在一个这样的实施方案中，组织样品可以是血液、唾液、痰液、粪便、尿液、毛发、皮肤或从对象身体获取的任何其他样品。出于本说明书的目的，术语“对象”是指人类、动物或植物对象。此外，用于采用本文描述的RPA方法进行分析的样品可以从自然环境、工业环境、卫生护理环境、居住环境、农业环境、配水环境、废水处理环境、食品生产或配送环境、娱乐环境或任何所需环境或其组合来收集。样品可以包含无机和/或有机材料，并可以从海水环境或淡水环境收集，并可以包含灰尘、岩石、土壤、植被、空气及其组合。

适合于本文描述的RPA的样品可以包括目标细胞，其可以是原核细胞或真核细胞。在具体实施方案中，微生物可以是革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或另一种类型的细菌。因此，本文描述的RPA方法可适用于检测在一种或多种情形包括人类和兽医临床情况下具有重要性的一种或多种微生物。例如，在一个实施方案中，本文描述的RPA方法可用于检测食源性和水源性微生物。在另一个实施方案中，本文公开的RPA可用于生物防御和检测用于生物武器的微生物。在另一个实施方案中，本文描述的RPA方法可用于传染病诊断或治疗监测。在另一个实施方案中，本文描述的RPA方法可用于制造过程包括但不限于食品、饮料或医疗装置的质量保证。在另一个实施方案中，本文描述的RPA方法可用于确保在卫生护理中使用的装置和材料的有效灭菌或其无菌性的维持。

如图6中所示，可以对含有一种或多种目标微生物、包括来自许多不同属的许多微生物种进行RPA。本文公开的RPA方法适合于检测种特异性pre-rRNA，并且在具体实施方案中，本文公开的RPA可以检测来自一个或多个属的微生物的种特异性pre-rRNA，所述属选自不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、弓形杆菌属(Arcobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、包特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、阪崎肠杆菌属(Cronobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、真杆菌属(Eubacterium)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、奈瑟球菌属(Neisseria)、巴斯德菌属(Pasteurella)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普氏菌属(Prevotella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、密螺旋体属(Treponema)、韦荣球菌属(Veillonella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、微球菌属(Micrococcus)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。

RPA方法包含将样品分成两份或多份等份试样，其中至少一个等份试样进行营养刺激，至少一个等份试样作为未刺激的对照进行处理。在一个实施方案中，将营养刺激过的等份试样中存在的材料沉淀、清洗并置于所需的微生物培养条件下。本文公开的微生物培养条件是本技术领域的专业人员公知的适合于靶生物体理想生长的环境和营养条件。一般来说，优化的微生物培养条件可以包括适合于靶微生物的营养培养基、温度、湿度、氧张力、存在特定微量或常量营养物、不存在抑制剂、和压力。在一个这样的实施方案中，将营养刺激过的等份试样在对所述等份试样增补适合靶微生物的培养基的条件下温育或培养所需的时间长度。例如，当靶生物体是革兰氏阴性杆菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)时，样品可以用包含营养肉汤培养基的培养基温育。在另一个实例中，靶生物体是鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)，微生物培养条件可以包括将样品用Middlebrook 7H9培养基温育。在另一个实例中，靶生物体是厌氧微生物，营养刺激条件可以包括低氧张力。在另一个实例中，靶生物体是病原体例如生活在铁可用性有限的细胞内环境中的李斯特菌(Listeria)，营养刺激条件可以包括供应铁。在一个实施方案中，将未营养刺激的对照等份试样在被设计用于维持靶微生物状态的对照条件下温育。在一个这样的实施方案中，将对照等份试样在水或缓冲液中温育。在另一个实施方案中，将对照等份试样维持在不利气氛中，例如在厌氧微生物检测的情况下在大气氧浓度下。

本文描述的RPA方法典型地包括对已经从样品的靶微生物中分离的一种或多种pre-rRNA分子进行定量。在一个这样的实施方案中，按照本技术领域的专业人员已知的核酸提取技术从样品分离pre-rRNA。例如，可以裂解样品中的细胞并按照标准方法例如苯酚-氯仿抽提方法提取核酸。核酸提取、包括pre-rRNA提取和定量的示例性方法，公开在Cangelosi等1997年的美国专利5,712,095和Cangelosi等，1996(Cangelosi，G.A.和W.H.Brabant.1997.在饥饿的大肠杆菌细胞中pre-16S rRNA的贫化(Depletion of pre-16S rRNA in starved Escherichiacoli cells)，J.Bacteriol.179：4457-4463；Cangelosi，G.A.，W.H.Brabant，T.B.Britschgi和C.K.Wallis.1996.使用前体rRNA的种特异性测定法检测利福平和环丙沙星抗性的结核分枝杆菌(Detection of rifampin-andciprofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis by usingspecies-specific assays for precursor rRNA)，Antimicrob AgentsChemother.40：1790-1795)中，其每个在此引为参考。

Pre-rRNA分子的定量包括使用核酸扩增技术。在一个这样的实施方案中，核酸扩增技术可以是基于PCR的技术。在另一个这样的实施方案中，核酸可以通过非基于PCR的方法扩增，例如等温扩增方法比如基于核酸序列的扩增(NASBA)。核酸扩增方法的实例由Gill和Ghaemi，2008所公开(Pooria Gill和Amir Ghaemi.2008.核酸等温扩增技术综述(Nucleic acid isothermal amplification technologies-a review)，Nucleosides，Nucleotides，and Nucleic Acids.27：224-243)，在此引为参考。在本文描述的RPA的一个实施方案中，RT-qPCR可用于定量来自样品的种特异性pre-rRNA，以确定pre-rRNA的刺激值。RT-qPCR使用反转录酶将RNA转变成cDNA，然后通过标准定量PCR(qPCR)对所述cDNA进行测量。

本文公开的RPA方法可以使用被设计成靶向靶微生物的pre-rRNA序列的寡核苷酸引物，并且用于RPA的引物可以靶向任何成熟的rRNA序列或任何pre-rRNA序列。在一个实施方案中，引物可以靶向pre-rRNA5’端的前导区。在一个这样的实施方案中，用于本文公开的RPA方法的引物可以靶向紧接成熟16S rRNA 5’端的上游序列，因为这些启动子近端区域在活跃转录pre-rRNA的细胞中将是丰富的。在另一个这样的实施方案中，用于RPA的引物可以靶向16S rRNA基因下游的间隔序列。在其他实施方案中，引物对可以跨过成熟rRNA的5’或3’端，使得扩增需要完整的pre-rRNA作为模板。在本文描述的RPA方法中使用的反向引物可以被设计成识别成熟rRNA内的半保守区，而正向引物可以被设计成识别pre-rRNA内的种特异性序列。或者，在本文描述的RPA方法中使用的反向引物可以被设计成识别pre-rRNA内的种特异性序列，而正向引物可以被设计成识别成熟rRNA内的半保守区。引物的长度和组成对于本发明来说不重要，只要它们被设计成特异性扩增pre-rRNA而不是成熟rRNA或DNA即可。

在一个具体实施方案中，可以设计引物以定量鸟分枝杆菌(M.avium)的pre-rRNA分子。参考图7，在一个这样的实施方案中，可以对正向和反向引物进行设计以产生跨过成熟16S rRNA 5’末端的扩增产物，使得成功的扩增需要完整pre-16S rRNA作为模板。例如，RT-qPCR的cDNA合成可以由成熟rRNA序列5’-GCCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO：3)引发。正向和反向引物可以分别是5’-TTGGCCATACCTAGCACTCC-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GATTGCCCACGTGTTACTCA-3’(SEQ ID NO：2)。反向引物可以在成熟rRNA序列内，而正向引物可以识别外部转录的间隔物-1(ETS-1)中的位点。用于RPA方法的引物的实例显示在图7中，包括正向、反向和反转录酶引物组，以及可用于参比靶微生物的供选引物。

对于本文公开的方法来说，pre-rRNA刺激比率值是刺激过的样品中pre-rRNA水平相对于对照样品中pre-rRNA水平的比率。在具体实施方案中，本文公开的RPA方法包括对样品中的种特异性pre-rRNA经比率测量进行定量的步骤。在一个实施方案中，对种特异性pre-rRNA经比率测量进行定量以确定pre-rRNA刺激比率值。在一个这样的实施方案中，pre-rRNA刺激比率值是营养刺激过的样品中的pre-rRNA水平相对于未营养刺激的对照样品的比率，并且pre-rRNA刺激值被用于确定样品中活靶细胞的存在。例如，当pre-rRNA刺激比率值近似等于或大于存活性阈值时，表明存在活细胞。在一个这样的实施方案中，当营养刺激过的等份试样中pre-rRNA水平大于未刺激的对照等份试样中的pre-rRNA值时，通过存活性阈值指示了靶细胞的存活性。

当在本文中使用时，术语“存活性阈值”是刺激过的样品中pre-rRNA水平相对于对照样品中的pre-rRNA水平的计算比率，其指示样品中活细胞的存在。正如本文所公开的，给定样品的存活性阈值可取决于靶生物体、样品的类型、NAAT的分辨能力以及可能影响样品中pre-rRNA定量的其他条件。在具体实施方案中，样品的存活性阈值可以在约1至100的范围内。阈值的选择可以取决于具体测定方法的要求。例如，要求对病原体的存在具有最高的可能灵敏度的测试(例如医疗装置质量控制)，可以使用阈值为1。或者，要求对活细胞的特异性而不是高度的分析灵敏度的测试例如污水处理监测，可以使用较高的阈值以最小化高代价的假阳性结果的频率。

在一个实施方案中，可以在源自于天然或体内来源的样品上进行RPA。例如，本文描述的RPA方法可以在源自于组织或体液的样品上进行。在一个实施方案中，样品可以从人类或动物对象的组织、血液或痰液收集。与自来水或湖水相比，血液和痰液可能是富含营养物的环境。这种天然样品中的微生物可活跃复制并维持大的pre-rRNA储量。然而，实验室培养基的均衡和优化的营养条件在自然界中是非常罕见的。在天然环境中，微生物生长常常受限于特定营养物的可得性。例如，人类具有限制组织中铁的可得性的先天性免疫机制。因为特定营养物有限，微生物在天然样品例如痰液或全血中可能即便不是完全不分裂，也是分裂较差。在这种意义上，天然环境与含有大量某些营养物但是贫化了其他营养物(通常为碳或氮)的用过的培养基类似。天然样品含有受限于可以是碳、氮、氧或微量元素的特定营养物的微生物，当其在营养刺激下被提供了限制性营养物时，能够经历可测量的pre-rRNA合成的爆发。

在一个实施方案中，为本文公开的RPA而收集的样品可以包括在营养物可利用性、生长抑制剂的存在和宿主防御方面具有空间变化的天然样品。例如，结核杆菌在新感染的巨噬细胞中可以最高速度复制，而在细胞外基质或在具有非常高的杆菌载荷的宿主细胞中可能生长缓慢。在一个这样的实施方案中，对于在对象急性感染期间收集的天然样品来说，为样品中所有潜在的靶生物体提供最适营养物混合物以确保最高细胞生长，可能是不可能的。因此，当在营养刺激条件下温育时，可以预计天然样品中的靶微生物将合成pre-rRNA并显示出pre-rRNA上升。在一个实施方案中，本文公开的RPA方法可以包含收集天然样品，所述天然样品包含生活在营养物受限环境中的靶微生物。在一个这样的实施方案中，本文描述的RPA方法可以包括确定天然样品中的限制性营养物，然后用包含限制性营养物的富营养培养基对天然样品的等份试样进行营养刺激。因此，富营养培养基可以通过向靶微生物提供限制性营养物引起靶微生物中pre-rRNA水平的上升。

在一个具体实施方案中，可以对源自于人类或动物对象的样品中的靶生物体例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)进行RPA。在一个这样的实施方案中，可以从怀疑被结核分枝杆菌感染或正在经历结核分枝杆菌治疗的对象收集痰液。可以将痰液样品分成两份等份试样，其中一份可以用富集培养基例如Middlebrook 7H9肉汤进行营养刺激，而另一份可以保持在PBS或水中作为对照。在一个实施方案中，营养刺激可以在37℃下进行约3-5小时。然后可以将刺激和对照等份试样中的细菌裂解，并可以使用RT-qPCR对pre-rRNA进行定量并计算pre-rRNA刺激比率值。Pre-rRNA刺激值可用于确定天然样品中活的结核分枝杆菌的存在。在一个这样的实施方案中，当营养刺激过的等份试样中的pre-rRNA值大于未刺激的对照等份试样中的pre-rRNA值时，表明了活的结核分枝杆菌细胞的存在。在类似的实施方案中，可以用限制性营养物进行营养刺激，通过RPA检测衣原体属(Chlamydia)、李斯特菌属(Listeria)、军团菌属(Legionella)等的细胞内病原体。靶病原体不需要在体外“可培养”。例如，通过使用RPA可以在阴道拭子中检测转性细胞内病原体例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，在所述RPA中提供了在其天然细胞内环境中受限的特定营养物。病原体在这些条件下可能不能复制，但是它能感应到限制性营养物的存在并在不成功的复制尝试中合成pre-rRNA，因为pre-rRNA合成是细胞生长中非常早的步骤。这样的合成可以通过RPA检测。

公知的手动或自动核酸提取和定量方法可用于执行本文公开的RPA方法。在一个这样的实施方案中，RPA可以包括使用一种或多种技术的核酸提取和/或定量，所述技术例如核酸芯片技术、微阵列、多路技术、芯片实验室(lab-on-a-chip)、卡式实验室(lab-on-a-card)、微流体装置和本技术领域的专业人员已知的其他核酸提取和定量技术。当在本文中使用时，术语“微流体装置”是可用于执行RPA的装置，并可以包括核酸芯片技术、微阵列、多路技术、芯片实验室、卡式实验室和相关技术。例如，核酸提取和分析的方法公开在美国专利7,608,399和美国专利申请11/880,790中，二者在此引为参考。

在一个实施方案中，本文公开的RPA方法可以包括使用核酸卡(Nucleic Acid Card)进行RNA提取和扩增，然后进行比率测量分析。将从样品获取的等份试样进行营养刺激，同时将对照等份试样保持在缓冲液中(步骤A)。在短暂的营养刺激后，将细胞裂解(步骤B)，然后上样到成对的核酸卡上。在完成RNA提取(步骤C)后，对洗脱液进行qPCR。当应用于生长缓慢的分枝杆菌时，包括营养刺激在内的整个过程可能花费6至24小时。相比较而言，分枝杆菌培养需要5-14天。

在一个实施方案中，本文公开的RPA可以包括使用能够快速、简便和可靠地从血液和各种其他生物样品中分离DNA和RNA的平板玻璃或复合材料卡进行核酸分离和定量。在一个实施方案中，本文公开的RPA可以使用合并了细胞裂解、核酸提取和纯化以及测量提取到的核酸的装置来进行。在一个这样的实施方案中，装置可以是用于接收和处理本文所述的生物样品的容器。在一个这样的实施方案中，本文公开的RPA方法可以包含使用流过式玻璃壁核酸卡从样品提取核酸。在这样的实施方案中，卡可用于核酸定量、DNA或RNA提取和浓度测定。在另一个实施方案中，核酸的提取和/或定量可以通过使用插入到位于核酸卡上的载样和洗脱端口中的移液管来手动进行。或者，本文公开的核酸的提取和/或定量可以通过使用流体操纵装置或本技术领域的专业人员已知的其他适合装置来自动进行。

本文公开的RPA方法可以包括预筛选过程例如免疫分离或免疫筛选过程，以提高RPA的特异性。在一个实施方案中，RPA可以包含可在包被有与靶微生物特异性结合的抗体或其他探针或肽的珠子或其他粒子上鉴定或捕获一种或多种目标靶微生物的步骤。在一个这样的实施方案中，通过抗体或探针鉴定到的靶微生物可以进行本文公开的RPA。例如，可以将通过初步免疫分离方法鉴定到的靶微生物分成两份或多份独立的等份试样，其中对一份等份试样进行营养刺激，而另一份等份试样被留作未营养刺激的对照等份试样。然后可以按照本文所述对营养刺激过的样品相对于对照样品的pre-rRNA补充进行定量。在一个实施方案中，本文所述的免疫分离方法可用于分离靶微生物的特定菌株或种群。例如，本文公开的RPA方法可以包含可鉴定靶微生物群体内的特定菌株或分离物的免疫分离步骤。在一个具体实例中，本文公开的RPA方法可以包含将特定大肠杆菌菌株例如大肠杆菌O157与同种的其他微生物分离开的免疫分离步骤。

在一个实施方案中，本文公开的RPA可用于提高靶微生物的检测灵敏度。例如，RPA可与其他测试相结合，用于证实活的靶微生物的存在。作为细胞活性的动态测量，本文公开的RPA与静态DNA检测相比在临界性信号中提供了更高的置信度。这可以提高用于样品中微生物的核酸扩增检测的总体灵敏度、可靠性和稳固性。生物灵敏度的提高源自于RPA的动态本质。就像是在森林中观察动物，其中移动的动物比静止的动物更容易被看出。在RPA中看到的pre-rRNA合成是由营养刺激可靠地诱导的一种细菌“移动”。

此外，RPA与传统的NAAT相比具有其他优点。大多数反转录酶定量PCR(RT-qPCR)方案具有3个步骤：DNA酶消化以除去可能干扰RNA定量的基因组DNA；反转录酶(RT)将RNA转变成cDNA；以及最后qPCR以定量cDNA。在RPA中，DNA酶消化步骤不是必需的，因为细菌细胞中的基因组DNA的量比pre-rRNA低1-3个数量级。还预计基因组DNA以相似的量存在于刺激和对照等份试样中。结果，基因组DNA引起很小的背景信号并且不干扰比率测量分析。

在一个实施方案中，当初步分析给出的结果是非结论性的、临界性的或难以解释时，RPA可用于提高初步分析结果的置信度。例如，一般来说，循环阈值(Ct)＜30(即在少于～30个扩增循环后出现阳性结果)的RT-qPCR无疑是阳性的。但是，Ct值＞30是临界性的，并可能难以解释。这种信号可能由样品污染或甚至背景噪音产生。在一个实施方案中，RPA可用于在Ct值＞30时验证检测微生物细胞存在的RT-qPCR测试的结果。当进行重复测量并且营养刺激过的等份试样表现出一直强于对照等份试样的RT-qPCR信号时，则该结果非常可能反映出活细胞的存在。背景噪音、DNA污染或临界性阳性结果的其他原因非常不可能引起这样的结果。因此，除了提高对活微生物细胞的特异性之外，RPA能够显著提高NAAT对微生物细胞的功能灵敏度。NAAT的其他实例可以包括非比率测量式rRNA扩增(成熟或前体)和通过直接杂交的非比率测量式rRNA检测。

除了Ct值之外，其他的定量或半定量NAAT测试读数也可用于RPA。其实例包括凝胶电泳结果、荧光或比色信号、热读数、解链曲线和基于核酸探针杂交的读数例如线性探针分析或核酸侧向流(NALF)。在所有情况下，RPA均能够提高对活细胞的特异性以及检测少量存在的微生物细胞的功能灵敏度。

在一个实施方案中，RPA可用于增加初步NAAT、例如被设计用于鉴定样品中微生物存在的DNA检测分析的灵敏度。在一个这样的实施方案中，样品的基因组DNA检测分析可以与用于相同样品的RPA同时进行，或在随后进行RPA，以检测活的靶微生物的存在。在另一个实施方案中，RPA可用于克服可能使得检测靶微生物的方法所产生的临界性结果难以解释的背景噪音或环境DNA污染。

实施例

提供下面的实施例仅仅是出于说明目的，而不打算以任何方式限制本文描述的组合物和方法的范围。应该理解，所公开的组合物和方法不限于本文描述的具体方法、方案和试剂。在每种情况下，除非另有指明，否则使用标准材料和方法来执行所提供的实施例中描述的工作。在本说明书中引用的所有专利和文献参考资料，在此以其全文引为参考。

除非另有指明，否则本发明的实践使用了属于本领域专业技术的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。(参见例如《微生物学中的实时PCR：从诊断到鉴定》(Real-Time PCR in Microbiology：FromDiagnosis to Characterization)(I.M.Makay主编，2007)；Nolan，T.等，(2006)使用实时RT-PCR对mRNA进行定量(Quantification ofmRNA using real-time RT-PCR)，Nature Protocols 1，1559-1582；Maniatis，T.等，(1982)《分子克隆实验室指南》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)(Cold  Spring  Harbor Laboratory，Cold  SpringHarbor，N.Y.)；Sambrook，J.等，(2001)《分子克隆实验室指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第二版(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)；Ausubel，F.M.等(1992)《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(J.Wileyand Sons，NY)；Glover，D.(1985)《DNA克隆》(DNA Cloning)I和II(Oxford Press)；Anand，R.(1992)《复杂基因组的分析技术》(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)(Academic Press)；Guthrie，G.和Fink，G.R.(1991)《酵母遗传学和分子生物学指南》(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)(Academic Press)；Harlow和Lane(1988)《抗体实验室指南》(Antibodies：A LaboratoryManual)(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)；Jakoby，W.B.和Pastan，I.H.主编，(1979)细胞培养(Cell Culture)，《酶学方法》第58卷(Methods in Enzymology，Vol.58)(Academic Press，Inc.，Harcourt Brace Jovanovich(NY))；《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)(B.D.Hames & S.J.Higgins主编，1984)；《转录和翻译》(Transcription And Translation)(B.D.Hames & S.J.Higgins主编，1984)；《动物细胞培养》(Culture Of Animal Cells)(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；《固定化细胞和酶》(ImmobilizedCells And Enzymes)(IRL Press，1986)；B.Perbal，《分子克隆实践指导》(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；《酶学方法专论》(the treatise，Methods In Enzymology)(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells)(J.H.Miller和M.P.Calos主编，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)Vols.154和155(Wu等主编)；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(Mayer和Walker主编，Academic Press，London，1987)；《实验免疫学手册》(Handbook Of Experimental Immunology)，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，1986)；Hogan等主编，(1994)《小鼠胚胎操作实验指南》(Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。除非另有指明，否则本发明的实践使用了化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学和免疫学的常规技术。(参见例如Maniatis等，1982；Sambrook等，2001；Ausubel等，l 992；Glover，1985；Anand，1992；Guthrie和Fink，1991)。

本文中没有一处将被解释为承认本文讲授的主题因为有在先发明而没有资格表明所述公开内容时间居先。没有承认任何参考文献构成了现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者所宣称的内容，并且申请人保留质询所引用文件的准确性和贴切性的权利。应该清楚地理解，尽管本文中参考了大量出版物，但这些参考不表示承认任何这些文件形成了本技术领域的公知知识的一部分。

实施例1-基于Pre-rRNA的细胞存活性检测的设计

细菌在其环境中感应到新营养物而快速补充Pre-rRNA储量。如图1中所示，在大肠杆菌中，在静止期细胞的营养增加后，pre-16S rRNA储量得到补充。继续参考图1，将大肠杆菌的过夜培养物在零时(箭头)在新鲜LB培养基中稀释20倍。在稀释之前和之后的时间点记录光密度，并通过化学发光夹心杂交测定法对样品的pre-rRNA和成熟16S rRNA含量进行分析。空心圆形，培养物的OD600(右侧轴)；空心三角形，按OD600的pre-16S rRNA(左侧轴)；实心三角形，按OD600的成熟16SrRNA。图1中显示了三个平行培养物的平均值和标准偏差。

与每30分钟分裂和倍增并具有高rRNA拷贝数的大肠杆菌相反，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG每～24小时倍增，并具有较少的rRNA拷贝。然而，在该生物体中，在营养增加的一个倍增时间内，清楚地观察到pre-rRNA的补充。图2在牛分枝杆菌(M.bovis)BCG上进行的实验中显示了这一现象，其中使用了狭缝印迹杂交测定法检测pre-rRNA(实心圆)。继续参考图2，在箭头所指的时间点处将静止期牛分枝杆菌BCG细胞在新鲜7H10肉汤中稀释。跟踪营养刺激之前和之后的Pre-rRNA拷贝数和细胞密度。实心圆显示了pre-rRNA与基因组DNA的比率。空心三角形显示了牛分枝杆菌培养物的OD600。因为在细菌细胞中pre-rRNA是丰富的，占总rRNA的4％-20％，因此不用扩增进行直接检测是可能的。结果，pre-rRNA检测的灵敏度超过基因组DNA检测的灵敏度。

实施例2-Pre-rRNA的比率测量分析

开发了用于从饮用水获取的怀疑引起人类疾病的两种细菌病原体的RPA测试。模型种是快速生长的革兰氏阴性杆菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和生长缓慢的放线菌鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)。对于这两个菌种来说，靶向pre-rRNA的5’前导区(紧接成熟16S rRNA 5’端的上游序列)，是基于这些近启动子区域在活跃转录pre-rRNA的细胞中将是丰富的这一假设。引物对跨过成熟rRNA的5’端，使得扩增需要完整的pre-rRNA作为模板。反向引物识别成熟rRNA内的半保守区域。正向引物识别5’前导区内的种特异性序列。

鸟分枝杆菌的正向和反向引物被设计成产生跨过成熟16S rRNA的5’端的预计237bp的扩增产物，使得成功的扩增需要完整的pre-16SrRNA作为模板。cDNA合成由成熟rRNA序列5’-GCCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO：3)引发。正向和反向PCR引物分别是5’-TTGGCCATACCTAGCACTCC-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GATTGCCCACGTGTTACTCA-3’(SEQ ID NO：2)。反向引物在成熟rRNA序列内，而正向引物识别ETS-1中的位点。与从BLAST分析所预测的种特异性相一致，当应用于来自鸟分枝杆菌的15个临床分离物和来自胞内分枝杆菌(M.intracellulare)的4个临床分离物的核酸时，PCR以及凝胶电泳一致地产生了预期大小的产物。这两个密切相关的种包含被称为鸟分枝杆菌复合物(M.avium complex)(MAC)的临床相关分型。当反应应用于结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、地分枝杆菌(M.terrae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、草分枝杆菌(M.phlei)和母牛分枝杆菌(M.vaccae)时，没有观察到产物(数据未显示)。这些观察说明了pre-rRNA分析的有用的系统发育特异性。

嗜水气单胞菌的正向和反向引物产生预计189bp的扩增产物。cDNA合成由成熟rRNA序列5’-CTACAAGACTCTAGCTGGACAGT-3’(SEQ ID NO：6)引发。正向和反向PCR引物分别是5’-ATTGAGCCGCCTTAACAGG-3’(SEQ ID NO：4)和5’-AACTGTTATCCCCCTCGAC-3’(SEQ ID NO：5)。对NCBI非冗余数据库进行的BLAST分析除了嗜水气单胞菌之外没有发现与正向引物的匹配。密切相关的种杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)A449不具有同源序列。

为了评估营养刺激后pre-rRNA补充的时间过程，将静止期早期的嗜水气单胞菌ATCC 7966细胞洗涤，重新悬浮在压热灭菌过的自来水(ATW)中，并在28℃下通气温育7天。对静止期早期的MAH菌株HMC02的细胞进行清洗，重悬浮在ATW中，然后在37℃下通气温育14天。这些条件被设计用于在模拟的供水环境中排出pre-rRNA储量。为了进行RPA，将水饥饿的细菌分成两份等份试样并离心。将一份沉淀重悬浮在培养基中(营养刺激)，另一份重悬浮在ATW中(对照)。最终的细胞密度约为10⁶cfu/mL。营养肉汤用于嗜水气单胞菌的营养刺激，而增补有10％ADC的Middlebrook 7H9培养基用于MAH。在温育不同的时间长度后，通过高能珠研磨将细胞裂解，通过酸化苯酚-氯仿分离RNA，并通过RT-qPCR测量pre-rRNA。在针对基因组DNA标准曲线归一化后，计算营养刺激样品和对照样品中RT-qPCR值的比率。在两种生物体中Pre-rRNA刺激非常快。约15分钟的营养刺激足以使嗜水气单胞菌中pre-rRNA始终上升。在代时＞20小时的生长缓慢的生物体鸟分枝杆菌中，最大的pre-rRNA刺激需要约4小时。对于这两种生物体来说，这些时间长度＜1个代时。

图3显示了在水饥饿的嗜水气单胞菌(A)和鸟分枝杆菌菌株104(B)细胞中pre-rRNA的营养刺激的时间过程。Pre-rRNA刺激比率值是刺激过的样品相对于对照样品中通过RT-qPCR测量的pre-rRNA的比率。值是每个时间点＞两个实验的平均值和SD。为了在提取的RNA上进行RT-qPCR，首先使用Superscript III系统(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)产生了互补DNA(cDNA)，并使用Qiagen PCR纯化试剂盒(目录号28104，Qiagen Inc.，Valencia，CA)进行纯化。使用AppliedBiosystems(ABI)Power SYBR Green混合物(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)进行cDNA的扩增。反应用两种不同的稀释度进行三份平行样以确保定量读数。扩增在ABI Prism RT-7500上，在96孔板中如下运行：10分钟95℃，40个循环的(15s 95℃，30s 60℃，30s 72℃)，使用“9600仿真”设置。使用ABI的SDS软件设定Ct阈值。

实施例3-Pre-rRNA刺激比率与细胞存活性之间的相关性

为了评估RPA对活细胞的特异性，使用次氯酸钠处理来产生具有各种活细胞和失活细胞比率的嗜水气单胞菌细胞悬液。比率通过在暴露于氯后进行活菌铺板来定量，并表示成相对于约1X 10⁶cfu/mL的输入密度的活力百分数。为了在氯处理过和未处理的细胞悬液上进行RPA，将成对等份试样离心，并将细胞沉淀重悬浮于水(对照样品)或营养肉汤(刺激样品)中。在营养刺激1小时后，测定pre-rRNA刺激比率。在一些实验中，也通过qPCR对刺激和对照样品中的基因组DNA进行定量。这允许评估RPA对活细胞的特异性，并与使用传统的DNAqPCR所观察到的特异性进行比较。

表1显示了两个实验的结果，其中测量了基因组DNA以及pre-rRNA。在第一个实验中存活性百分数为96.3％、26.9％和0.02％的样品表现出≥3±1SD的pre-rRNA刺激比率值。没有可检测的活细胞(存活性0％)的样品表现出经统计不超过1.0的pre-rRNA刺激比率。因此，在高达约99.98％的靶微生物死亡的样品中，RPA显示出显著的pre-rRNA刺激比率值。相反，嗜水气单胞菌基因组DNA的qPCR检测在所有样品中都为强阳性，不论细胞是否存活。此外，在营养刺激和对照的等份试样中，DNA信号之间没有差异(未显示)。在第二个实验中看到了相似结果(表1)。本实施例说明了RPA对活细胞的可观灵敏性，即使是如实验1中用2mg/l次氯酸盐处理的样品中当失活细胞的数量高出5000倍以上时。

表1

实验1

实验2

¹相对于估算的1X 10⁶个输入细菌进行归一化。²三个平行样品的平均值±SD。

在使用表1中的方案的四个实验中，将RPA应用于具有不同存活性百分数的总共18个氯处理和未处理样品。在没有可检测的菌落形成单位的样品中观察到Pre-rRNA刺激比率与具有可检测的菌落形成单位的样品中观察到的相比明显更低(p＝0.0026，Mann-Whitney U检验)(图4A)。在两个组之间存在一些交叠，但是交叠明显小于当在刺激或未刺激样品中通过qPCR定量基因组DNA时所看到的交叠(图4B)。在存活性与DNA刺激比率之间没有显著相关性。更具体来说，图4显示了在次氯酸盐处理过的实验室悬液中，活的嗜水气单胞菌细胞的存在与pre-rRNA刺激比率(A)或通过qPCR定量的基因组DNA(B)之间的相关性。Pre-rRNA刺激比率值(A)是通过RT-qPCR测量的刺激过的样品相对于对照样品中的pre-rRNA的比率。值是每个样品3个测量值的平均值。基因组DNA拷贝(B)通过qPCR定量，并相对于基因组DNA标准曲线归一化。测量了营养刺激过的样品(空心正方形)和未刺激样品(空心三角形)中的DNA。

实施例4-RPA测定法的野外测试

作为地表水的常见栖居者，嗜水气单胞菌是用于RPA野外测试的方便的模型。样品从华盛顿州西雅图(Seattle，WA)的淡水和咸水位点收集。将每种样品的一部分压热灭菌以产生失活对照。将压热灭菌和未压热灭菌的样品(各300mL)通过过滤浓缩。在重悬浮后，将等份试样在2X营养肉汤(刺激样品)或水(对照)中稀释两倍。在温育1小时后，通过离心浓缩细菌和颗粒，然后通过RT-qPCR测量沉淀中的嗜水气单胞菌pre-rRNA。样品中的嗜水气单胞菌活细胞计数按照标准方法通过活菌铺板来测定。

表2

¹每个样品≥4个测量值的平均数和标准偏差。

总共分析了3个淡水样品和1个咸水样品。淡水样品产生的嗜水气单胞菌活细胞计数在280至798cfu/mL的范围内。它们都显示出阳性RPA信号(表2)。所有压热灭菌的样品都没有产生cfu，并且在这些样品中没有检测到嗜水气单胞菌pre-rRNA。咸水样品具有6cfu/mL的嗜水气单胞菌，然而在进行或未进行压热灭菌的刺激或未刺激样品中，都没有检测到嗜水气单胞菌pre-rRNA。

结果支持了使用RPA作为特异性检测环境样品中活微生物的手段。RPA方法可用于消除在只含有死细菌细胞和DNA的样品中观察到的假阳性结果。使用RPA也可以减少由样品或PCR试剂的实验室污染所引起的假阳性。此外，RPA是稳固的并建立在所有细菌的生理特点之上，其自身或作为其他工具的辅助可用于食品和水的安全性分析中。

实施例5-RPA的生物灵敏度

RPA可用于提高相对于基因组DNA检测的测定灵敏度。图5显示了在源自于含有280cfu/mL的活嗜水气单胞菌的单一淡水湖样品(表2的样品A2)的配对刺激和对照等份试样上进行的多个RT-qPCR反应的结果。继续参考图5，将源自于华盛顿州西雅图联合湖(Lake Union，Seattle，WA)的样品分成两份等份试样，其中一份用营养肉汤刺激(深色条)，另一份重悬浮在ATW中(浅色条)作为对照。图5中显示的结果表示成通过将循环阈值(Ct)与基因组DNA标准曲线进行比较而计算出的每mL样品的近似pre-rRNA拷贝。在每个这些技术平行样中，刺激样品中的pre-rRNA信号显著超过对照样品的信号。

表2中的Ct值都在32至43的范围内，即信号是临界性和微弱的。这最有可能是由于浓缩的地表水样中常见的PCR抑制剂。尽管具有这些限制，但结果仍无疑是阳性的，因为在刺激过的样品中pre-rRNA信号的一致上升，为存在活的嗜水气单胞菌细胞的结论提供了置信度。