一种肌球蛋白ATP酶活性微量测定方法及其应用

摘要

本发明涉及一种肌球蛋白ATP酶活性微量测定方法，其特征是：以经典钼蓝法的反应方法为基础，控制ATP与肌球蛋白的摩尔比为2000∶1，钼酸铵与氯化亚锡摩尔比为5.5∶1。本发明测定方法简便、快速、响应值高，线性范围宽，并可应用于抑制剂的筛选，本发明还发现鲁斯可皂苷元抑制肌球蛋白ATP酶活性的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌球蛋白ATP酶活性微量测定方法，以经典钼蓝法的反应原理为基础，通过底物浓度、反应体系的pH值、钙离子浓度、反应时间等影响因素考察，确定优化反应条件，该方法简便、快速、响应值高，线性范围宽，并可应用于抑制剂的筛选，发现鲁斯可皂苷元抑制肌球蛋白ATP酶活性的用途。 

背景技术

肌球蛋白最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中，依据来源不同可以分为传统型肌球蛋白和非传统型肌球蛋白。肌球蛋白参与了包括肌肉收缩、胞质分裂、神经突触生长、靶向小泡运输及信号传导等内在的多种细胞活动，是生物体内非常重要的一大类ATP驱动蛋白，肌球蛋白能利用自身的ATP结合位点催化ATP释放能量，并将这些能量转化为机械能而参与诸多细胞活动，在细胞的迁移、黏附、机体的免疫应答以及肿瘤的发生发展等生理病理过程中均发挥着重要的作用，是国际日益关注的热点之一。因此，研究肌球蛋白ATP酶活性既可以探讨肌球蛋白生理特性，也是阐释心血管疾病和肿瘤等疾病的发生发展机制，并筛选发现新型抑制剂的重要途径(宋佳希等.非肌肉肌球蛋白重链II A(NMHC II A)生理病理功能研究进展.现代生物医学进展，2009，9(20)：3964-3979；Manzanares MV et al.Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2009，10(11)：778-790；Wrighton KH.Autophagy：Myosin II moves in on autophagosomes.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2011，12：77)。尽管目前关于测定肌球蛋白ATP酶活性方法的报道很多，如比色法(包括钼蓝法、孔雀绿法和其它方法)、放射性标记法、NADH酶偶联测定法等，后两类方法由于需要特殊的标记物和专用设备而限制了在一般普通实验室推广应用。文献报导的钼蓝法测定肌球蛋白ATP酶活性方法主要步骤(林丽军.肌球蛋白的ATPase活性及热凝胶特性研究[D].南京：南京农业大学，2004：35-44)： 

1)分别取1ml肌球蛋白试液(含1×10^-3mM肌球蛋白)，0.5ml氯化钙溶液(含5.0mM氯化钙)，补加三羟甲基氨基甲烷(Tris)-马来酸缓冲液(25mM，pH 5.5)至终体积为9ml，混匀25℃水浴共孵10min； 

2)加入ATP 1ml(含1.0mM ATP)，补加Tris-马来酸缓冲液至终体积为10ml，混匀25℃水浴孵育10min； 

3)加入10ml 15％TCA(150g.L^-1)，混匀置冰水浴中止反应； 

4)3000g离心5min，取5ml上清液置于100ml容量瓶中，加入8ml钼酸铵溶液(25g.L^-1)，2ml氯化亚锡溶液(100g.L^-1)，分别补加Tris-马来酸缓冲液至终体积为100ml，混匀25℃水浴反应20min； 

5)酶标仪700nm处测定吸光度(OD)值。 

由于测定液中磷酸离子浓度与吸光值成正比，所以最后以吸光值代表肌球蛋白IIATPase活性。 

上述方法由于存在着试剂消耗量和反应体系所需液体量均过大(单管反应体系达到100ml)的问题，不利于进行大规模抑制剂的筛选。 

发明内容

本发明公开了一种肌球蛋白ATP酶活性微量测定方法，其可用于抑制剂筛选。本发明建立一种简便、经济、灵敏度高、线性范围宽的肌球蛋白ATP酶活性微量测定方法，并验证了使用该方法筛选抑制剂的可靠性。 

本发明可使肌球蛋白水解ATP产生的单体磷在10min内显色稳定，克服了经典方法因显色缓慢而导致定量不准确的问题。同时，经方法学考察证明本方法对单体磷的定量具有更宽的线性范围。 

考虑到测定成本，发明人按照文献报道经典钼蓝法(林丽军.肌球蛋白的ATPase活性及热凝胶特性研究[D].南京：南京农业大学，2004：35-44)等比例缩小反应体积至200μl进行测定，发现吸光度值较低，响应值低、显色缓慢、线性范围较窄等不理结果，见表1、图1，不能满足测定要求。为经济、简便、快速的测定肌球蛋白ATP酶活性，发明人通过考察底物浓度、反应时间、pH、钙离子浓度等影响酶促反应的相关因素，优化试剂比例、反应条件，优选到一种肌球蛋白ATP酶活性微量方法，明显减少价格昂贵的肌球蛋白的用量。通过提高底物ATP的相对浓度而有利于提高酶催化的效率，将ATP与肌球蛋白的摩尔比控制为2000∶1，控制显色剂钼酸铵和氯化亚锡摩尔比为5.5∶1，结果发现：显色时间较之经典方法减少了一半，加快了整个反应的进程。本发明方法测得紫外吸收值明显高于经典方法，一方面说明本方法有更高的催化效率，另一方面提高了对单体磷定量的准确性；对单体磷定量的线性范围(50-3200μM.(100ml)^-1明显宽于现有方法(200-1200或100-1600μM.(100ml)^-1)。并以国际通用的肌球蛋白ATP酶特异性抑制剂-blebbistatin为对照药，证明了所建立方法的有效性。 

本发明的肌球蛋白ATP酶活性的微量测定方法，包括：取肌球蛋白试液、氯化钙溶液、Tris- 马来酸缓冲液混匀后水浴共孵；加入ATP液和Tris-马来酸缓冲液，混匀后水浴孵育；加入三氯乙酸(TCA)液，混匀后置冰水浴中止反应；离心后取上清液依次加入钼酸铵溶液、氯化亚锡溶液、Tris-马来酸缓冲液，25℃水浴显色，用酶标仪700nm测定吸光度值，吸光度值高低则代表肌球蛋白II ATPase活性的大小。其中ATP与肌球蛋白的摩尔比为2000∶1，钼酸铵溶液和氯化亚锡溶液摩尔比5.5∶1。 

更为优选的肌球蛋白ATP酶活性的微量测定方法，依次包括： 

a.取浓度为2.5×10^-4mM的肌球蛋白试液2μl、1mM的氯化钙溶液10μl，至终体积为100μl的25mM Tris-马来酸缓冲液，混匀后水浴共孵10min； 

b.加入0.5mM的ATP液5μl，补加Tris-马来酸缓冲液至200μl，混匀后水浴孵育10min； 

c.加入15％ TCA液，混匀后置冰水浴中止反应； 

d.离心后取上清液60μl置于96孔板中，依次加入25g.L^-1钼酸铵溶液20μl，100g.L^-1氯化亚锡溶液8μl，补加Tris-马来酸缓冲液至终体积为200μl，混匀25℃水浴显色10min后，用酶标仪700nm测定吸光度值。 

其中Tris-马来酸缓冲液的pH优选为7.0。 

以下为具体优化过程： 

1.单体磷回归曲线的绘制 

采用现有测定方法(等比缩小体积至200μl)绘制单体磷曲线，分别取单体磷溶液(0.5mM)0.1、0.2、0.4μl、0.8μl、1.6μl、3.2μl、6.4μl、12.8、25.6μl，依次加入16μl钼酸铵溶液(25g.L^-1)，4μl氯化亚锡溶液(100g.L^-1)，补加Tris-马来酸缓冲液至终体积为200μl，即得终浓度分别为50、100、200、400、800、1600、3200、6400μM.(100ml)^-1的反应体系。混匀25℃水浴反应10min，酶标仪700nm处测OD值。以测得的吸光度值为纵坐标，磷酸根浓度为横坐标作图，经计算，单体磷标准曲线的回归方程为：Y＝0.0001X+0.0221，相关系数为0.995(图1)，表明单体磷浓度在100-1600μM.(100ml)^-1)内，与吸光度值有很好的相关性。采用本发明方法绘制单体磷曲线，结果由图2可见，表明单体磷浓度在50-3200μM.(100ml)^-1)内，与吸光度值有很好的相关性，经计算，单体磷标准曲线的回归方程为：Y＝0.0574X-0.0101，相关系数为0.9992，表明本方法线性范围宽。 

2.底物(ATP)浓度对肌球蛋白ATPase的影响 

底物浓度是影响酶活性测定的重要指标。分别加入ATP溶液(100mM)0.1μl、0.2μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、1.0μl、2.0μl，即得终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、1.0mM、2.0mM的反应体系，其余操作同改进肌球蛋白ATP酶活性测定方法。以测得的吸光度值为纵坐标，ATP浓度为横坐标作图，结果由图3可见，ATP浓度低于0.5mM 时，体系的吸光度值随底物浓度增加而显著增大。底物浓度高于0.5mM时，底物浓度成倍增加，而吸收值仅略有增大。加之ATP自身也是有机磷，浓度过大会给游离磷酸根浓度的测定带来干扰，因此ATP的使用浓度优选0.5mM。 

3.pH值对肌球蛋白ATPase的影响 

文献报道的关于钼蓝法最适pH不尽一致，本实验将Tris-马来酸缓冲液(25mM)使用氢氧化钠溶液(0.1M)分别调节pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，重新考察了pH5.0-8.0范围内反应体系的最适pH。以测得的吸光度值为纵坐标，反应体系的不同pH值为横坐标作图，结果由图4可见，pH对该反应体系下肌球蛋白ATPase影响不显著。肌球蛋白ATPase在pH 7.0时有相对最强酶活性，因此pH 7.0为该体系最适pH值。 

4.氯化钙浓度对肌球蛋白ATPase的影响 

分别加入4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl氯化钙溶液(0.1mM)，即得到钙离子终浓度分别为0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM的反应体系，采用本方法进行ATP酶活性测定。以测得的吸光度值为纵坐标，反应体系的不同氯化钙浓度为横坐标作图，结果由图5可见，氯化钙浓度低于1.0mM时，体系的吸光度值随氯化钙浓度浓度增加而增大；当氯化钙浓度高于1.0mM时，体系的吸光度值反而有较为明显的下降，因此选择，氯化钙的使用浓度优选1.0mM。 

5.孵育时间对肌球蛋白ATPase的影响 

肌球蛋白与氯化钙在孵育过程结合形成活化的钙调蛋白，该蛋白-离子复合物具有催化ATP水解的活性。将孵育时间分别设定为2min、5min、8min、10min、15min、20min，其余操作同前。以测得吸光度值为纵坐标，ATP与氯化钙共孵育时间为横坐标作图，结果由图6可见，肌球蛋白与氯化钙共孵2-10min时间段内时，该复合物的ATP水解活性随时间增加显著增加。但是随着共孵时间继续增加，复合物的ATP水解活性基本无变化。因此，肌球蛋白与钙离子共孵10min即可达到最佳催化活性。 

6.显色时间对肌球蛋白ATPase的影响 

钼蓝法是测定肌球蛋白ATP酶活性经典方法，但是该法显色缓慢而限制了其推广应用。本方法调整钼酸铵和氯化亚锡的比例(5.5∶1)后，重新考察了显色时间对显色结果的影响。将加入显色剂后的反应时间分别设定为2min、5min、8min、10min、20min、30min，其余操作同前。以测得吸光度值为纵坐标，不同显色时间为横坐标作图，结果由图7可见，反应体系加入显色剂10min后，其吸光度值不再有变化，说明此时显色反应已进行完全，并且形成的显色复合物稳定。因此，改进方法在很大程度上克服了经典钼蓝法显色缓慢的缺点。 

因此，本发明与现有方法比较，不仅成本低，并且线性范围宽，表1是本发明方法与现 有测定方法的比较，同时还列出了按现有方法等体积缩小至200μl后的测定结果。 

表1改进的肌球蛋白ATP酶活性微量方法与现有测定方法对比表格 

注：表格中“ATP/肌球蛋白”是指二者分子数目的比值 

由表1可见，如果按现有方法要进行微量测定的话，则其线性范围仅100-1600，并且其吸光度也仅为～0.1-0.2，而本发明通过改变测定中几个参数的配比后，吸光度提高至～0.3-0.5，线性范围扩大至50-3200，并且显色时间缩短了一半。本发明方法为一种快速、经济的测量方法。 

本发明测量方法的准确可靠，下面结合实施例作进一步说明。 

附图说明

附图1是单体磷标准曲线(现有方法等比缩小至200μl法) 

附图2是单体磷标准曲线(本发明方法) 

附图3是底物(ATP)浓度对肌球蛋白ATPase的影响 

附图4是pH值对肌球蛋白ATPase的影响 

附图5是氯化钙浓度对肌球蛋白ATPase的影响 

附图6是孵育时间对肌球蛋白ATPase的影响 

附图7是显色时间对肌球蛋白ATPase的影响 

具体实施方式

实施例1 

blebbistatin对肌球蛋白ATPase抑制率测定实验 

取2μl肌球蛋白，10μl氯化钙溶液，blebbistatin稀释液2μl(分别含1、3、5、7μM)，补加Tris-马来酸缓冲液(25mM，pH 7.0)至终体积为100μl，混匀25℃水浴共孵10min。加入ATP 5μl，混匀25℃水浴孵育10min后加入100μl 15％ TCA中止反应。离心后取60μl上清液置于96孔板中，加入20μl钼酸铵溶液和8μl氯化亚锡溶液显色后，于700nm处测定吸光度。表2结果显示，酶浓度为0.1mg.ml^-1，底物浓度为0.5mM，25℃水浴反应10min，测得blebbistatin对肌球蛋白ATPase活性抑制的IC₅₀为3.07μmol.L^-1，与国外学者的测定数据相近(3.2μmol.L^-1)(Kovacs M et al.Mechanism of Blebbistatin Inhibition of MyosinII.J Biol Chem，2009，279(34)：35557-35563)结果类似。 

表2blebbistatin对肌球蛋白II ATPase的抑制作用 

  组别  浓度(μM)   OD(700nm)   抑制率(％)   溶剂对照组  -   0.311±0.025    Blebbistatin组  1   0.218±0.013^＊  28.97   3   0.175±0.020^＊＊  42.17   5   0.120±0.017^＊＊  59.54   7   0.080±0.018^＊＊  71.91

注意：^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与溶剂对照组比较 

实施例2 

测定方法同实施例1，鲁斯可皂苷元浓度为10、15、20、25μM。 

表3鲁斯可皂苷元对肌球蛋白II ATPase的抑制作用 

注意：^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与溶剂对照组比较 

应用本方法进行肌球蛋白ATP酶活性抑制剂的筛选，首次发现鲁斯可皂苷元具有较强的抑制活性，IC₅₀为22.75μmol.L^-1。鉴于文献报道肌球蛋白ATP酶活性抑制剂具有抑制肿瘤细胞迁移，调节肾功能、抑制视网膜变性、细胞死亡等作用(宋佳希等.非肌肉肌球蛋白重链II A(NMHC II A)生理病理功能研究进展.现代生物医学进展，2009，9(20)：3964-3979；Manzanares MV et al.Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2009，10(11)：778-790；Wrighton KH.Autophagy：Myosin II moves in on autophagosomes.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2011，12：77)，提示鲁斯可皂苷元也具有上述用途。