靶向CDK1抗EV71、登革、乙脑及流感病毒寡核苷酸的结构和用途

摘要

本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现靶向细胞周期蛋白依赖性激酶1，同时具有抗肠道病毒71型、登革病毒及乙型脑炎病毒的反义寡核苷酸的结构以及这些反义寡核苷酸在制备治疗EV71、登革病毒、乙型脑炎病毒及流感病毒感染及其相关性疾病的药物中的用途。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1， Cyclin-dependent kinases 1)治疗EV71(肠道病毒71型)病毒(Human enterovirus 71)、登革 病毒(Dengue virus)、脑炎病毒或流感病毒感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense  oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。

背景技术

EV71病毒、登革病毒、脑炎病毒、流感病毒同属于RNA病毒，他们感染危害都很 严重。

EV 71病毒感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。该病易于传播， 容易发生流行，预防控制难度大。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利等国家相继暴 发以中枢神经系统疾病为主要临床特征的EV71型手足口病流行，并导致较高的病死率 和致残率。1997年以来，EV71感染为主的手足口病在马来西亚、中国台湾、新加坡等 地大规模暴发流行。1998年中国台湾发生迄今最大的一次主要为EV71型手足口病流行， 共报告129106例手足口病或疱疹性咽峡炎病例，其中重症患1405例，死亡78例。中 国内地自1981年在上海始见本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北 及广东等十几个省市均有EV71型手足口病的发生和流行。特别值得注意的是近年来本 病流行有蔓延增多趋势。2008年3月10日至5月31日短短时间内安徽阜阳共报告手 足口病7470例，共发现111例重症病例，其中死亡23例，病死率0.31％。目前EV71 病毒感染无特殊治疗药物，故临床上对无并发症患者之治疗只能采取支持性疗法，而对 有并发症的患者也只能对症治疗，采取一些降颅压、降温、辅助抗病毒等的治疗。

登革热是世界上分布最广，发病率最高，危害最大的虫媒病毒传染病。近年来，随着全 球气候的变暖和国际旅游交往的增加，DF的流行范围逐渐扩大(目前已存在60多个国家有 DF的流行)，同时发病率和死亡率也呈逐年上升的趋势。每年全球约发生1亿例DF，50万 例DHF，其中25000人死亡。我国自1978年在广东，海南，福建，台湾等省份也多次发生 DF的暴发流行。DF已给全球人类的生命安全带来极大的威胁。登革疫苗研究已有40多年的 历史，但由于登革病毒有4个血清型，当人感染了一个血清型后，再感染其它血清型容易引 起DHF和DSS，至今对其发病机理尚不清楚，因此疫苗的研究难度很大，目前仍无可用于人 体的疫苗及有效的治疗药物。

流行性乙型脑炎是亚洲一种最常见的经虫媒传播的人畜共患的病毒性脑炎，据统计，乙 型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)每年至少造成至少50000例临床病例，其 中多数为十岁以下儿童，导致约10000人死亡，有15000人左右留有神经精神性后遗症。但 是目前还没有针对乙脑的特异性治疗方法，接种疫苗仍是唯一最重要的控制措施，目前临床 尚无特效的治疗药物。

流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲型流 感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的″西班牙流感″在 全球范围内造成了2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致的″亚洲 流感″、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的″香港流感″、1977年由甲型流感病毒(H1N1) 所致的″俄罗斯流感″、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)， 以及2009年出现的甲型流感病毒感染，都严重威胁了人们的健康和正常生活。流感作为急性 呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其 严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。由于 流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉 的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内流感病毒几乎不 起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如：达菲和帕纳米韦)虽效果 较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流 感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒的方法已成当务之急。

根据以上分析，研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及 流感病毒感染的药物对治疗与预防这些病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。

病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其 二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地 通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞 机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者 阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。

经研究已经证实，细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)是抗肿瘤药物的重要靶点之一，目 前，有报道发现CDK1抑制剂有抗带状疱疹病毒、巨细胞病毒、艾滋病毒的作用，但还没有抗 EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的报道。EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及 流感病毒感染都能够引起细胞病变凋亡，抑制CDK1的表达可以减少细胞的凋亡，因此，设想 研究出抑制CDK1表达的核酸药物可能具有抗EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒感 染的作用，从而对EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒等感染相关疾病的治疗起到良 好的效果。

核酸类药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是 近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。

反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱 基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上 的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作 用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企 业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向CDK1阻断EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病 毒复制、抑制这些病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。

本研究的内容是结合抗EV71的人的基因表达谱(表达谱编号GSE16358)和HPRD(人 蛋白相互作用网络)，利用子网辨识的方法设计了一个含100多个节点的核心子网，然后选择 拓扑上的重要节点筛选出基因CDK1。利用网上服务器Soligo设计了5条针对CDK1的反义 寡核苷酸(表1)，从设计的这5条20个碱基长度的反义寡核苷酸序列中进行初步筛选。结 果显示CDK1-4抑制病毒所致细胞病变作用最佳，CDK1-3次之。在RD细胞系中以CDK1-4 为代表进一步评价了抑制EV71病毒复制和致细胞病变的特性。而且，对CDK1-4抑制登革 病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的作用评价结果显示CDK1-4也能剂量依赖且序列特异性地 抑制登革病毒、乙脑病毒及流感病毒的质细胞病变作用，提示CDK1-4也可发展成为治疗登 革病毒、乙脑病毒或流感病毒的新型药物。

表1反义寡核苷酸的分子设计

根据本发明，针对CDK1的反义寡核苷酸能特异性抑制EV71病毒、登革病毒、乙脑病 毒及流感病毒的感染复制，有可能成为治疗及预防EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感 病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。

根据本发明，与人CDK1基因的mRNA互补结合的寡核苷酸能有效的抑制EV71病毒、 登革病毒、乙脑病毒及流感病毒并保护细胞使其免于EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流 感病毒所致细胞病变，是一种特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒、登革病毒、乙脑 病毒及流感病毒的潜在药物。

根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性 等因素相关，CDK1-4的长度根据实验确定，本发明包含了与CDK1-4具有相同序列的任何长 度寡核苷酸。

根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明 包含了CDK1-4的硫代修饰。

根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性 等因素相关，CDK1-4的长度根据实验确定，本发明包含了与CDK1-4具有60％及其以上连 续相同序列的任何长度寡核苷酸。

根据本发明，为了进一步验证CDK1-4的特异性效果，本发明包含了CDK1-4序列的3’ 端及5’端的脂肪链修饰。

根据本发明，本发明的寡核苷酸可按本领域已知方法配成药物制剂。

根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、 给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等， 以适宜的剂量给药。

本发明的实施对严重危害人类健康的EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒感染 的治疗具有重要的社会效益和经济效益。

附图说明：

图1 CDK1反义寡核苷酸序列CDK1-1～CDK1-5抑制EV71病毒致细胞病变作用

图2 CDK1-3、CDK1-4剂量依赖性地抑制EV71病毒致细胞病变作用

图3利巴韦林剂量依赖性的抑制EV71病毒引起的细胞病变作用

图4 CDK1-4对RD细胞的毒性作用

图5 CDK1-4剂量依赖且序列特异性地抑制EV71病毒的致细胞病变作用

图6 CDK1-4剂量依赖性地抑制EV71病毒的RNA

图7 CDK1-4剂量依赖性抑制EV71病毒VP1蛋白的表达

图8脂肪链修饰后的CDK1-4剂量依赖地抑制EV71病毒引起细胞病变

图9不同碱基长度的CDK1-4抑制EV71病毒所致的细胞病变

图10 CDK1-4、CDK1-4-14B、CDK1-4-18A、CDK1-4-18C剂量依赖性地抑制EV71病毒的 致细胞病变作用

图11 CDK1-4剂量依赖且序列特异性地抑制登革病毒致细胞病变作用

图12 CDK1-4剂量依赖且序列特异性地抑制乙脑病毒的致细胞病变作用

图13 CDK1-4对BHK细胞的毒性作用

图14 CDK1-4剂量依赖且序列特异性地抑制流感病毒的致细胞病变作用

图15 CDK1-4对A549细胞的毒性作用

具体实施方式

实施例一：

本实施例主要说明靶向人CDK1基因抗EV71病毒反义寡核苷酸的设计、合成和筛选。

材料与方法

1.反义寡核苷酸CDK1-1～5的设计和合成

结合抗EV71的人的基因表达谱(表达谱编号GSE16358)和HPRD(人蛋白相互作用 网络)，利用子网辨识的方法设计了一个含100多个节点的核心子网，然后选择拓扑上的重要 节点筛选出基因CDK1。所有寡核苷酸均采用8909型自动DNA合成仪合成全硫代修饰的反 义寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro PureⅡ反相纯化柱(Oligo  Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。

2.RD细胞、病毒和对照药物

病毒通过感染RD细胞进行扩增繁殖，然后混匀、分装并储存在-70℃备用。使用的 病毒株为国际株标准株EV71。RD细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养 液。病毒感染和细胞病变测定时使用含2％胎牛血清的维持液。阳性对照药物为利巴韦林注射 液。

3.反义寡核苷酸的筛选

RD细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)中，于37℃、5％CO2培养箱 中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000～10000个细胞/孔将细胞接 种至96孔细胞培养板中，次日75～80％长满。用DMEM稀释CDK1-1～5至μM。将长满 75～80％RD细胞的含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2％胎牛血清的 维持液备用。分别把CDK1-1～5五条反义寡核苷酸序列以4μM的浓度加入96孔板内，每个 序列设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入 100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo 产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450 表示)，并以如下公式计算药物的病毒抑制率：[(OD试验-OD病毒)/(OD细胞-OD病毒)] ×100。重复试验二次，计算平均值以筛选出最佳的反义寡核苷酸以进一步评价。

4.CDK1-3、CDK1-4抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用

参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％RD 细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CDK1-3、CDK1-4分别设立0.125、0.25、0.5、1.0、 2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对 照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。 利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上 测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

5.利巴韦林抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用

参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。把利巴韦林注射液 分别设立20、40、100、200、400μM五个浓度梯度，每个浓度设三个副孔，并设立病毒阳性 对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒 稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD 产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制 率。

6.CDK1-4对RD细胞的药物毒性作用

将RD细胞铺96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎 牛血清的维持液备用。把CDK1-4分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度，每个浓度设 立三个副孔，并设立RD细胞阴性对照组，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo 产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表 示)，观察CDK1-4对细胞的影响。

结果：

1.用4μM的浓度对CDK1-1～5进行初步抗EV71的致细胞病变作用筛选，结果如图1 所示，CDK1-3和CDK1-4两条序列的抗EV71的致细胞病变作用比较明显，抑制率分别为 100.75％±9.8％和108.43％±8.5％。

2.如图2所示，CDK1-3、CDK1-4抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用筛选显示 CDK1-4可剂量依赖性的抑制EV71病毒的致细胞病变作用，并计算了其IC₅₀为0.214μM。

3.把CDK1-4分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度进行药物毒性试验，浓度 达到20μM时CDK1-4对细胞没有明显的毒性影响，如图4所示。

4.比较利巴韦林与CDK1-4抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用，发现CDK1-4抑 制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用明显比利巴韦林效果好，利巴韦林在4000μM时抑制率 才达到42.93％，而CDK1-4在4μM时就达到抑制率就超过90％，如图3所示。

结论

CDK1可以作为抗EV71病毒宿主靶标，靶向CDK1的反义寡核苷酸药物具有体外抗 EV71病毒引起的细胞病变和抑制EV71病毒的复制作用。

实施例二：

本实施例主要说明经过设计CDK1-4的正义和随机验证CDK1-4的抗EV71病毒的特异 性。

材料和方法

1.CDK1-4正义链和随机链的设计与合成

正义链直接经过与CDK1-4的反义寡核苷酸反义序列的碱基互补得出，其随机链是利 用DNA随机蛋白等的设计软件SMS2(The Sequence Manipulation Suite 2)设计出来的，并通过 与GeneBank联机blast序列比对，不会干扰人类其它正常基因的表达。

2.CDK1-4抗EV71病毒的特异性验证

参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％ 的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CDK1-4、CDK1-4S(正义)、CDK1-4R(随 机)分别设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设 立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71 的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪 (BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的 细胞病变抑制率。

结果

细胞实验验证结果显示(图5)，CDK1-4可剂量依赖性地抑制EV71的致细胞病变作用， 而作为对照的CDK1-4S和CDK1-4R对EV71的致细胞病变作用无显著影响。体外具有很好 的抗EV71病毒的功效，并且特异性很强。

结论

CDK1-4能够序列特异性地抑制EV71的致细胞病变作用。

实施例三

本实施例主要说明CDK1-4可以剂量依赖性地抑制EV71病毒的RNA

材料和方法

CDK1-4抑制EV71病毒RNA的剂量依赖性作用

将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％ 胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的CDK1-4。CDK1-4分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM 四个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。 作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。2d 后收集培养液上清，利用病毒RNA提取试剂盒(TIANGEN产品)提取病毒RNA，进行荧 光定量PCR检测。

结果

CDK1-4剂量依赖性的抑制EV71致细胞病变作用，利用荧光定量PCR检测病毒RNA结果如图6 所示，CDK1-4在0.5、1.0、2.0μM三个浓度时抑制率分别达到了99.00％、99.54％、99.24％。

结论

CDK1-4可以剂量依赖性的抑制EV71病毒RNA的表达。

实施例四

本实施例主要说明CDK1-4可以剂量依赖且序列特异性地抑制EV71病毒VP1蛋白的表达

材料和方法

CDK1-4抑制EV71病毒VP1蛋白的剂量依赖性作用

将RD细胞铺6cm细胞培养皿，次日细胞长至75％-80％。将长满75％-80％的RD细胞换含 2％胎牛血清的维持液，分别加入不同浓度的CDK1-4。CDK1-4设立0.5、1.0、2.0μM三个浓度 梯度，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组、CDK1-4正义序列(CDK1-4S)2.0μM对 照，CDK1-4随机序列(CDK1-4R)2.0μM对照。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的 EV71的病毒16.7μl，37℃培养2d。利用RIPA裂解液C1053(Applygen产品)和PMSF(Genstar 产品)提取细胞蛋白，进行western blotting蛋白验证。

结果

如图7所示，CDK1-4剂量依赖性的抑制EV71致细胞病变作用，有效的减少甚至完全抑制 了EV71病毒VP1蛋白的表达。而CDK1-4正义序列(CDK1-4S)和CDK1-4随机序列(CDK1-4R) 不能抑制EV71致细胞病变作用，可以看到明显的VP1蛋白的表达。

结论

CDK1-4可以抑制病毒VP1蛋白的表达。

实施例五：

本实施例主要说明经过脂肪链修饰的CDK1-4在体外RD细胞水平抑制EV71致细胞病变活 性的研究。

材料与方法

脂肪链修饰后的CDK1-4抑制EV71病毒复制的剂量依赖作用

参照实施例一将RD细胞铺96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD 细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CDK1-4与CDK1-4-ZF(脂肪链修饰)分别设立 0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和 RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl， 37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号： Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

结果：

CDK1-4-ZF抑制EV71病毒致细胞病变检测结果如图8所示，CDK1-4-ZF在1μM时 对EV71病毒的致细胞病变作用抑制率为42.8％。

结论

脂肪链修饰后的CDK1-4可在一定程度上抑制EV71病毒的致细胞病变作用。

实施例六

本实施例主要说明不同长度反义寡核苷酸CDK1-4抗EV71病毒效果。

材料和方法

1.不同长度的CDK1-4序列对EV71病毒致细胞病变的抑制作用检测

参考人CDK1基因的mRNA序列，将CDK1-4序列进行两端增加或减少碱基，使序列 为22、18、16、14个碱基。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有 很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。参照实施例一进行寡核苷酸合成、硫代 修饰、纯化、干燥和存储。

参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的 RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把每条序列以2uM进行筛选，每个序列浓度设三 个副孔，并设立CDK1-4原序列对照组、病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min 后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting  Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度 (以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

2.CDK1-4-14B、CDK1-4-18A、CDK1-4-18C对EV71病毒致细胞病变作用的剂量依赖关 系检测

参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的 RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。将1中筛选出的较好的序列CDK1-4-14B、 CDK1-4-18A、CDK1-4-18C分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓度梯度，每个序列浓度 设三个副孔，并设立CDK1-4原序列对照组、病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用 60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell  Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞 病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

结果

1.不同长度的CDK1-4序列对EV71病毒致细胞病变的抑制作用

CDK1-4不同长度的序列抑制EV71病毒致细胞病变检测结果，如图9所示，除 CDK1-4-14A，CDK1-4-14D，CDK1-4-14E外，2uM的其他长度的序列对EV71感染致细胞病变 作用均有显著的抑制作用，其中CDK1-4-14B、CDK1-4-18A、CDK1-4-18C三条序列抑制EV71 病毒致细胞病变效果较CDK1-4原序列效果好。

2.CDK1-4-14B、CDK1-4-18A、CDK1-4-18C剂量依赖性地抑制EV71病毒的致细胞病变 作用

将CDK1-4-14B、CDK1-4-18A、CDK1-4-18C分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓 度梯度进行剂量依赖性筛选，如图10所示，四条序列均能剂量依赖性地抑制EV71病毒致细 胞病变。

结论

不同长度的CDK1-4对EV71病毒的致细胞病变作用同样具有抑制作用。

实施例七

本实施例主要说明反义寡核苷酸CDK1-4在体外BHK21细胞水平抗登革病毒Ⅱ(Dengue virus Ⅱ)的效果

材料和方法

1.CDK1-4抑制登革病毒致细胞病变作用检测

将BHK21细胞铺96孔细胞培养板，次日等细胞长至80％-90％时，在BHK21细胞中加入 100TCID50/0.1ml的登革病毒稀释液(NGC株)，1h后将病毒液吸掉，换含2％胎牛血清的维 持液，并加入不同浓度的CDK1-4。CDK1-4分别设立0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μM五个浓度梯 度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒对照组和BHK细胞对照组。37℃培养4d。利用 Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定 细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

结果

CDK1-4剂量依赖地抑制登革病毒的致细胞病变作用

CDK1-4在BHK细胞中对登革病毒致细胞病变的抑制作用检测结果，如图11所示，CDK1-4 可剂量依赖性地抑制登革病毒致BHK细胞病变的作用，在3.2μM时对登革病毒致细胞病变作 用的抑制率为41.99％。

结论

CDK1-4可抑制登革病毒的致细胞病变作用。

实施例八

本实施例主要说明反义寡核苷酸CDK1-4在体外BHK21细胞水平抗乙脑病毒(Japanase  Encephalitis b virus)的效果。

材料和方法

CDK1-4抑制乙型脑炎病毒(JEV)致细胞病变剂量依赖作用

将BHK21细胞铺96孔细胞培养板，次日等细胞长至80％-90％。将长满80％-90％的BHK细 胞换含2％胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的CDK1-4。CDK1-4分别设立0.125、0.25、 0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和BHK 细胞阴性对照组、CDK1-4正义序列(CDK1-4S)2.0μM对照，CDK1-4随机序列(CDK1-4R) 2.0μM对照。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的JEV病毒稀释液2μl，37℃培养 3.5d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680) 上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

结果

CDK1-4剂量依赖性地抑制JEV致细胞病变作用

CDK1-4在BHK细胞中对脑炎病毒致细胞病变的抑制作用检测结果，如图12所示，CDK1-4 可剂量依赖性地抑制脑炎病毒致BHK细胞病变的作用，在1μM时对乙脑病毒致细胞病变作用 的抑制率为84.63％。

结论

CDK1-4可抑制乙脑病毒的致细胞病变作用。

实施例九

本实施例主要说明CDK1-4对BHK21细胞的毒性作用。

材料与方法：

CDK1-4对BHK21细胞的药物毒性作用

将BHK21细胞铺96孔细胞培养板，次日80～90％长满。将长满80～90％的BHK21细胞换成 含2％胎牛血清的维持液备用。把CDK1-4分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度，每 个浓度设立三个副孔，并设立BHK21细胞阴性对照组，37℃培养3d。利用Cell Counting  Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度 (以OD450表示)，观察CDK1-4对细胞的影响。

结果：

把CDK1-4分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度进行药物毒性试验，浓度达到 20μM时CDK1-4对细胞没有明显的毒性影响，如图13所示。

结论

CDK1-4对BHK21细胞没有明显的毒性作用。

实施例十

本实施例主要说明CDK1-4对流感病毒的致细胞病变的抑制作用作用以及其对A549细胞的 药物毒性作用。

材料与方法

1.CDK1-4抑制流感病毒致细胞病变剂量依赖作用

参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日70～80％长满。将长满70～80％ 的A549细胞换成含0.25％胎牛血清的维持液备用。把CDK1-4设立0.125、0.25、0.5、1.0、 2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和A549细胞阴性 对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒液1μl，37℃培养2d。利 用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测 定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。

2.CDK1-4对A549细胞的药物毒性作用

将A549细胞铺96孔细胞培养板，次日70～80％长满。将长满70～80％的A549细胞换成含 0.25％胎牛血清的维持液备用。把CDK1-4分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度，每 个浓度设立三个副孔，并设立A549细胞阴性对照组，37℃培养2d。利用Cell Counting  Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度 (以OD450表示)，观察CDK1-4对细胞的影响。

结果

CDK1-4剂量依赖性地抑制流感病毒致细胞病变作用

CDK1-4在A549细胞中对流感病毒致细胞病变的抑制作用检测结果，如图15所示，CDK1-4 可剂量依赖性地抑制脑炎病毒致A549细胞病变的作用，在1μM时对登革病毒致细胞病变作用 的抑制率为86.42％。

结论

CDK1-4可抑制流感病毒的致细胞病变作用，同时CDK1-4对A549细胞没有明显的毒性 作用。