一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌噬菌体及其应用

摘要

本发明涉及一种沙门氏菌噬菌体，特别涉及一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)。本发明还涉及将所述的噬菌体用于控制养殖环境中的鸡白痢沙门氏菌。上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体命名为PSPu-4-116，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2011042。

说明书

技术领域

本发明涉及一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体及其在养殖环境中的应用，尤其是能够特异性的杀灭养殖环境中鸡白痢沙门氏菌的应用。属于微生物工程领域。 

背景技术

在禽类，沙门氏菌可引起鸡白痢、鸡伤寒和副伤寒。其中，鸡白痢沙门氏菌引起鸡的一种常见多发性传染病，严重影响雏鸡成活率，成年鸡多为慢性或隐性感染，一般不表现明显的临床症状。鸡白痢沙门氏菌感染往往是终生带菌的，感染母鸡所产生的蛋，高达1/3带菌。带菌蛋的孵化率低，孵出的雏鸡的成活率也低。所以，鸡白痢所造成的经济损失是巨大的。鸡白痢呈世界性分布，美国和欧洲一些国家基本控制了本病，目前该病主要在发展中国家流行，比如中国等。带菌鸡是本病蔓延与传播的重要方式。感染鸡可通过互啄、啄食带菌蛋及皮肤伤口传播。感染禽的粪便、污染的饲料、饮水及笼具也是鸡白痢的来源。 

控制和解决沙门氏菌污染一直是全世界的难题。养殖场多利用净化手段和饲喂抗生素的方法控制沙门氏菌感染，但由于该病呈垂直和水平两种方式传播，这些控制措施并不理想，并且抗生素的大量使用不仅造成耐药菌株不断出现，而且抗生素残留问题也愈发严重。因此，亟待研究开发一种新型的疗法和产品，以解决和应对细菌对抗生素的耐药性问题，以控制食物细菌性污染。 

噬菌体是依赖细菌的病毒，能特异性地感染并裂解宿主菌，正是噬菌体特异性裂解细菌，而不影响机体或正常菌群这一特性，使得其有广阔的应用前景。噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时非常有效，且杀死细菌的机制与抗生素不同，不易产生耐药性和残留，是一种潜在的新型抗菌剂。噬菌体的裂解谱正在发生变化，某些噬菌体已不再是单一裂解性的噬菌体，其裂解谱正在扩展，比如，Bielke等(2007)分离到的肠炎沙门氏菌噬菌体成功以1株克雷白氏杆菌(Klebsiella)和3株大肠杆菌分离株为宿主菌扩增；徐焰等(2007)分离到的大肠杆菌噬菌体XY对5株大肠杆菌具有裂解作用。广谱噬菌体是今后研究的主要方向，克服了噬菌体裂解细菌具有种和型的特异性的缺点，用这种宽噬噬菌体可以治疗细菌混合感染，具有极好的临床价值。 

发明内容

本发明的目的在于：提供一种宽宿主谱的鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体，它不仅能够 有效地杀灭养殖环境中鸡白痢沙门氏菌临床分离株SPu-116；而且对鸡白痢沙门氏菌其他临床分离株(SPu-115、SPu-27、SPu-95、SPu-905)、副伤寒沙门氏菌ATCC 50073、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、禽沙门氏菌CVCC 2184、大肠杆菌K88或鸡白痢沙门氏菌CMCC 533也具有裂解活性。 

本发明的另一目的是：针对目前禽业养殖中鸡白痢沙门氏菌引起的疾病并没有有效的控制措施，提供一种有效的防治产品。开发对鸡白痢沙门氏菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或与其他噬菌体复配使用，能够有效杀灭养殖场中鸡白痢沙门氏菌，为目前控制养殖环境中鸡白痢沙门氏菌提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体来源。 

本发明的又一目的是：提供一种有效的防治手段，将所述的噬菌体制备成液体、冻干粉或药片形式，单独使用或与其他噬菌体复配后，经口服、喷雾或注射等方式，用于杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的鸡白痢。 

本发明的目的是这样实现的：一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体，其特征在于：保藏号为：CCTCC M 2011042，该噬菌体命名为PSPu-4-116，其对鸡白痢沙门氏菌(SPu-116、SPu-115、SPu-27、SPu-95、SPu-905)、副伤寒沙门氏菌ATCC 50073、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、禽沙门氏菌CVCC 2184、大肠杆菌K88或鸡白痢沙门氏菌CMCC 533均具有裂解活性。 

该噬菌体具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约74.3nm，尾部长约114.2nm；噬菌体在固体培养基上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1.5～2mm；根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类-国际病毒分类委员会第八次报告》为标准，该噬菌体应属于肌尾病毒科。 

一种上述噬菌体的应用，其特征在于：纯化后的噬菌体能够用于抑制鸡白痢沙门氏菌。 

在噬菌体的应用中，其特征在于：用于抑制鸡白痢沙门氏菌是指：将纯化的噬菌体制备成液体、冻干粉或药片形式，单独使用或与其他噬菌体复配后用于控制养殖环境中的鸡白痢沙门氏菌。 

在噬菌体的应用中，其特征在于：养殖环境是指：畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境。 

在噬菌体的应用中，其特征在于，使用方式为口服、喷雾或注射。 

本发明的优点在于：分离到的鸡白痢沙门氏菌噬菌体对好几个血清型的沙门氏菌具有裂解活性，并且具有跨种属裂解的特性，是一种宽宿主谱的噬菌体；而且，是一种新型的防治畜禽养殖中细菌疾病的产品和手段；经雏鸡试验证明，该噬菌体毒副作用甚小，安全性高；由于制备的噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成滴注液、喷洒液或淋洗液，可以方便有效的杀灭养殖环境中鸡白痢沙门氏菌。 

附图说明

图1为噬菌体PSPu-4-116电镜照片； 

图2为噬菌体PSPu-4-116双层平板检测结果； 

图3为噬菌体PSPu-4-116在机体内杀菌结果。 

具体实施方式

实施例1、噬菌体PSPu-4-116的分离制备 

本发明中的粪液污水样品采自南京禄口蛋鸡场粪便池；噬菌体宿主菌为鸡白痢沙门氏菌SPu-116(从发病肉鸡肠道分离，由本实验室按照国标GB/T 4789.4-2008分离、鉴定并保存)。 

将粪液污水样品经双层滤纸过滤，8000rpm离心20min，再分别用0.45μm和0.22μm滤膜过滤上清。取50mL上清，加入500μl噬菌体宿主菌过夜培养物，再加入CaCl₂母液至终浓度2mM混匀后，加入20mLTSB-YE液体培养基，放置于37℃培养12～16h。次日，取上述培养物以12000rpm离心10min，取上清并加入0.3％氯仿，形成噬菌体原液。 

取三块1.5％的TSB-YE琼脂平板，标记为1、2和3，分别吸取宿主菌液0.1mL滴于正中央，用涂棒将菌液均匀地涂开，5min后，平板1滴加0.05mL噬菌体原液，平板2滴加0.05mL0.85％生理盐水，平板3不滴加任何溶液，待自然晾干后，置于37℃温箱培养10h后，观察三块平板的变化。 

对上述鉴定后含有噬菌体的水样(即出现空斑的水样)进行以下操作：取噬菌体原液0.1mL，进行10倍稀释，取10²、10⁴和10⁶稀释液各0.1mL与过夜培养的宿主菌液0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约3.7mL 0.7％LB培养基，混匀后迅速倾倒入TSB-YE琼脂平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。 

实施例2、噬菌体的扩增培养和纯化 

在形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种于3～5mL TSB-YE液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，加入0.3％氯仿。 

取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.1mL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mLTSB-YE液体培养基，再加入CaCl₂母液至终浓度2mM，37℃摇振培养12～16h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，得到大量噬菌体裂解液。 

在裂解液中加入RNaseA、DNase I至终浓度为1μg/mL，37℃温育30min；加9.3g PEG8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm 10min，去上清液；加2mL SM液，充分洗涤管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(图2)。 

纯化的噬菌体命名为PSPu-4-116，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，保藏号：CCTCC M 2011042，分类命名：鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella Pullorum phage)，保藏日期为2011年2月21日。 

实施例3、噬菌体宽宿主谱检测 

试验选择27株细菌(包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌)对噬菌体PSPu-4-116的宿主谱进行分析。具体操作如下：分别取27株细菌的过夜培养物100μl，滴加在1.5％TSB-YE平板(针对沙门氏菌)或1.5％LB平板(针对大肠杆菌和志贺氏菌)中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μl噬菌体PSPu-4-116滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10μl生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12～16h，观察结果。 

结果表明(表1)：试验选择的细菌菌液在平板上均生长良好。滴加噬菌体PSPu-4-116的区域在SPu-116生长的平板出现不长细菌的透明区域，并且对所收集的27株细菌中的10株有裂解作用，裂解率为37.04％。说明分离到的噬菌体PSPu-4-116具有跨种属裂解的特性，是一种宽宿主谱的噬菌体。 

表1噬菌体宿主谱测定结果 

实施例4、噬菌体PSPu-4-116安全性实验 

刚孵化出的1日龄小鸡，共20只，购自南京青龙山一个孵化场。随机分为2组，每组10只；其中一组口服噬菌体PSPu-4-11610⁹pfu/0.25mL/只；对照组口服等体积PBS。连续口服7d后，每组杀死5只小鸡，观察内脏、消化道及黏膜变化情况；每组剩余的5只小鸡继续饲喂，每天取其粪便检测噬菌体数量变化。 

结果显示，此剂量噬菌体对小鸡生长没有影响，解剖检查未见异常，且在口服噬菌体结束三天后，在小鸡粪便中检测不到噬菌体。 

实施例5、噬菌体PSPu-4-116体内杀菌实验 

60只一周龄小鸡用于感染实验，共分3组，每组20只。按以下方式建立感染，挑取鸡 白痢沙门氏菌SPu-116单克隆于3ml TSB-YE液体培养基中，培养24h，10000rpm离心10min，倒去上清，连续用PBS洗涤3次，调整浓度为1×10⁸cfu/ml。每只小鸡在攻毒前半小时均口服30％碳酸钙500ul。感染组每只小鸡口服SPu-116 100μl(约1×10⁷CFU)，治疗组在口服细菌的同时，口服噬菌体PSPu-4-116 100μl(约1×10⁹PFU)，对照组则口服100ul PBS，分别在6h、12h、24h和36h，每组处死3只小鸡，取其肠道，测定其宿主菌的数量。 

结果如图3所示，在6h后，由于噬菌体的作用，宿主菌SPu-116大约减少了1000倍(从1.0×10⁷降至1.2×10⁴)，24h后，宿主菌SPu-116降至10²以下。 

实施例6、小鸡腹泻治疗实验 

60只一周龄小鸡用于感染实验。用宿主菌1×10⁵CFU进行口服攻毒实验，第二天全部攻毒小鸡都出现腹泻症状，将感染的60只鸡平均分成3组，分别采用肌肉注射、口服和喷雾噬菌体PSPu-4-116方式对感染并发生腹泻的小鸡进行治疗，给予3个剂量的噬菌体悬液10⁶、10⁷和10⁸PFU，连续24h观察记录腹泻情况。 

结果显示：三种方式均可以减轻小鸡的腹泻症状，其中口服和肌肉注射组能明显快速(小于12h)的控制腹泻症状，喷雾方式效果较慢，但是也是可以用于预防或治疗小鸡的腹泻。 

实施例7、噬菌体PSPu-4-116控制饲料中细菌污染 

挑取宿主菌单克隆，经过夜培养后，调整浓度为10⁵cfu/ml，用小型喷雾器(瓶)将1ml菌液喷在摊开的10g饲料表面，然后将纯化的噬菌体PSPu-4-116以1ml 10⁸pfu/ml的浓度实施喷杀，2h后，检测宿主菌。 

检测结果显示，在以10⁸pfu/ml浓度实施喷杀后2h，饲料中宿主菌的数量降到20cfu/g以下，说明该噬菌体可以有效杀灭饲料中污染的宿主菌。 

实施例8、噬菌体PSPu-4-116控制养殖环境中的细菌污染 

挑取宿主菌单克隆，经过夜培养后，调整浓度为10⁵cfu/ml，用喷雾器喷洒在料槽表面，然后将纯化的噬菌体PSPu-4-116分别以10⁶和10⁸pfu/ml的浓度对料槽实施喷杀，2h后，检测宿主菌。 

检测结果显示，在以10⁶和10⁸pfu/ml浓度实施喷杀后2h，料槽表面宿主菌的数量降到50CFU以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境中污染的宿主菌。 

以上各实施例不是对本发明的限制，本发明也不限于以上实施例。