藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质

摘要

本发明公开了一种重组藏绵羊肌肉生长抑制素蛋白质。包括克隆藏绵羊肌肉生长抑制素编码基因MSTN，以该基因为模板PCR扩增并克隆MSTN生物活性区，构建重组表达载体，并转化到大肠杆菌构建基因工程菌，对工程菌进行IPTG诱导表达并纯化MSTN蛋白质。随后用MSTN蛋白质主动免疫家兔制备多克隆抗体血清，用间接ELISA法检测MSTN蛋白质免疫原性。用重组藏绵羊MSTN蛋白质主动免疫小鼠，检测重组MSTN蛋白质对小鼠生长发育的影响。本发明提供的重组藏绵羊MSTN蛋白质纯度高，免疫原性好，主动免疫MSTN蛋白质可使小鼠肌纤维直径、面积显著增加，且肌纤维数量也有增加的趋势。由此提示，重组藏绵羊MSTN蛋白质可用于藏绵羊主动免疫，有利于加快藏绵羊生长速度，提高产肉性能。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种构建藏绵羊 pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)基因工程菌、重组蛋白质表达纯化、制备多克隆抗体及 免疫性检测的技术。

背景技术

藏绵羊是在高寒生态环境中经长期自然选育形成的地方特有羊种，具有耐寒、耐粗饲、 抗病力强等特点，是我国青藏高原及其毗邻的四川、甘肃、云南等地的优势畜种，也是牧区 人民重要的生产资料和生活资料，于2000年被农业部列入《国家级畜禽品种资源保护名录》， 2006年被农业部列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》。藏绵羊肉营养丰富，肌纤维细嫩、 柔软，蛋白质含量高，富含组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸等多种氨基 酸，胆固醇含量低，膻味小，备受消费者亲睐，市场潜力巨大。然而，众多科学研究数据显 示，藏绵羊产业发展存在诸多不利因素，藏绵羊在周岁以后生长速度缓慢、成年体重小、屠 宰率低、性成熟晚、繁殖率低、繁殖成活率低；同时，品种选育及更新速度较慢，品种老化， 个别地方羊个体变小，生产性能降低；此外，青藏高原气候严寒、生态脆弱，近年来草地鼠 害严重，加之过度放牧等诸多不利因素，使得草场退化严重，草畜矛盾尤为突出；另外，长 期以来，藏绵羊饲养管理粗放，几乎完全靠天养畜，生长发育速度慢，营养水平低。上述诸 多因素使得草地藏系绵羊存栏羊产肉量低、饲养成本高、饲料报酬低、商品率低、经济效益 差。因而，利用先进的育种技术、动物营养调控技术及高效率育肥技术提高藏绵羊产肉性能， 优化品种结构对藏绵羊产业发展及牧区经济发展具有重要的实践价值。

肌肉生长抑制素基因(myostatin，MSTN)又称转化生长因子8(Growth and Differential Factor 8，GDF-8)，是骨骼肌生长的负调控因子，具有抑制骨骼肌生长的作用，其抑制骨骼 肌生长的作用主要通过抑制骨骼肌细胞增殖和分化实现的。此外，MSTN在牛和绵羊的心肌、 猪的乳腺等多种组织中均发现有表达，由此提示，MSTN在调节脂肪积累、参与骨折愈合、调 节排卵、心脏发育及心肌的组织修复、以及乳腺的发生和泌乳等过程中可能具有重要作用。 肌肉生长抑制素是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一员，具有TGF-β超家族的典型特 点，其基因表达产物是成熟糖蛋白，能被分泌到胞外，分泌后形成的前体蛋白在RSRR区被切 除掉N-端266个氨基酸的前肽，剩余的C-端成熟区的109个氨基酸通过其中的9个半胱氨酸 形成二硫键，二聚体化后与细胞膜上的特异性受体发生相互作用，通过三种Smad蛋白的介导 将信号传入细胞核，作用于靶基因的调控区。

MSTN缺失或突变的个体表现出肌肉异常发达的“双肌”现象，McPherron等通过基因打 靶技术敲除老鼠体内MSTN，结果发现突变老鼠的体型显著大于野生型。MSTN的作用是抑制肌 细胞在胚胎发育过程中的分裂和抑制肌细胞在生长阶段的增大。研究发现，动物在生长后期 肌肉生长速度下降的时候，其MSTN的表达量相应升高，这提示了MSTN表达量的升高可能是 造成后期肌肉生长速度下降的原因。因此，如果设法除去MSTN对肌肉生长的抑制作用，就能 促进肌肉的生长并表现出双肌性状。目前已发现有30多个优良肉牛品种的形成与MSTN基因 发生突变有关。由此可知，将MSTN作为靶基因，通过分子生物学手段降低其对肌肉生长的抑 制作用对于藏绵羊高效率育肥及品种改良具有重要的指导意义和实践价值。

研究显示，利用基因敲除、基因打靶、转基因、金属蛋白酶抑制剂、过表达MSTN前肽等 技术破坏机体MSTN结构或降低其活性，都能够降低MSTN对肌肉生长的负调控作用，促进肌 肉生长。MSTN基因发生突变造成牛体重增加，饲料转化率提高，但是，不利的效应是母牛的 生育力下降，犊牛的成活率降低以及性成熟延迟，还会使牛肉的肌间脂肪及结缔组织碱少， 其他器官重量减轻等。由此可见，应用基因敲除、基因打靶、转基因等技术破坏机体MSTN结 构及活性固然能促进肌肉生长，但同时必然会影响动物的心脏负荷，繁殖能力等。并且目前 对于转基因食品的安全问题一直存在很大的争议，所以，由此获得的动物肌肉的食用安全性 也不能保证。

另一种阻断MSTN对肌肉的抑制作用是利用免疫学技术对抗MSTN的生物活性，包括制备 抗MSTN抗体、对动物体外注射抗MSTN抗体以阻断体内MSTN活性；或对动物主动免疫MSTN 蛋白质，刺激机体产生中和抗体，进而阻断MSTN的作用通路，获得同MSTN缺失相类似的表 型。目前，生物免疫技术是MSTN产品开发及高效率育肥技术的重要应用方向。蛋白质抗原的 免疫原性与其分子量大小有直接关系，在一定条件下，相对分子量越大，免疫原性越强。一 般来说，免疫原性良好的物质其相对分子量最低要求在10kDa以上。MSTN成熟肽基因及蛋白 质序列在各物种均高度保守，成熟肽蛋白质分子量约为16.5kDa，虽大于10kDa，但仍然偏小， 这是造成目前MSTN成熟肽抗体血清效价普遍偏低的主要原因。除相对分子量外，蛋白质的分 子结构、化学组成、立体构象的复杂性对免疫效果尤为重要，一般而言，分子结构和空间构 象越复杂的蛋白质免疫原性越强。目前，MSTN重组表达最为常用是大肠埃希氏菌表达系统， 该系统虽具有其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作等优点，但相对于MSTN 所分布的哺乳动物细胞而言，大肠埃希氏菌表达系统仍较为低级，不能完全实现重组蛋白的 高级组装和复杂空间构象的形成，因而表达产物多为溶解性差的包涵体，这正是造成MSTN成 熟肽抗体血清效价较低的另一重要因素。此外，研究表明，在表达纯化时直接应用全长MSTN 编码基因，容易导致前肽过量表达，前肽过量表达的小鼠N-端前肽与C-末端成熟肽不能正常 分离，形成没有生物活性的聚合物。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种含有藏绵羊肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)成熟肽基 因的表达载体、构建该基因表达载体的方法以及利用该表达载体转化的重组基因工程菌。

本发明的第二目的是提供藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质及表达、纯化该重组蛋 白质的方法。本发明的第三目的是提供藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质在藏绵羊繁育 中的应用。

本发明实现上述发明目的采用的技术方案如下：

一种含有藏绵羊myostatin成熟肽基因的表达载体pET28a(+)-MSTN′，包含由序列表中 序列5的3′端330个核苷酸组成的藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′和pET28a(+)载体， 该藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′位于pET28a(+)载体的EcoRI和BamH I限制性内切 酶酶切位点之间。

一种含有上述藏绵羊myostatin成熟肽基因表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据绵羊myostatin基因序列(AF019622)用Vector NTI软件设计myostatin编 码基因引物，引物序列如下：

上游引物P1：5′-ATGCAAAAACTGCAA-3′

下游引物P2：5′-TCATGAGCACCCACAGCGATCTACT-3′

(2)提取藏绵羊大腿骨骼肌RNA，将其作为模板，在引物P1和P2的引导下进行逆转录 PCR(RT-PCR)扩增；

(3)将步骤(2)扩增得到的RT-PCR产物连接到pMD18-T载体，转化到E.coli TOP10 宿主菌进行克隆，用质粒PCR方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中 的Myostatin编码基因测序，测序结果正确的阳性重组质粒为pMD18-T-MSTN质粒；

(4)根据藏绵羊Myostatin编码基因序列，用Vector NTI软件设计其生物活性区即C- 末端成熟肽(109个氨基酸)基因引物，引物序列如下：

上游引物P3：5′-CGGGATCCGATTTTGGGCTTGATTGTGAT-3′

下游引物P4：5′-CGGAATTCTCATGAGCACCCACAGCGAT-3′

(5)以步骤(3)所得pMD18-T-MSTN质粒为模板，在引物P3、P4的引导下扩增藏绵羊 myostatin成熟肽基因MSTN′，将MSTN′基因连接到pMD18-T载体，并转化到E.coli TOP10 宿主菌进行克隆，用质粒PCR方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中 MSTN′基因测序，测序结果正确的阳性重组质粒为pMD18-T-MSTN′质粒；

(6)用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对pMD18-T-MSTN′质粒和pET28a(+)质粒进 行双酶切，分别回收MSTN′片段和pET28a(+)线状载体；

(7)将MSTN′片段连接到pET28a(+)线状载体，转化到E.coli TOP10宿主菌，用质粒 PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到重组表达载体pET28a(+)-MSTN′。

上述含有藏绵羊myostatin成熟肽基因表达载体构建方法的步骤(2)中所述逆转录PCR 扩增包括逆转录和PCR反应，其中所述逆转录的10μL体系为：MgCl₂ 2.0μL，10×RT Buffer 1.0μL，RNase Free dH₂0 3.75μL，dNTP Mixture 1.0μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5μL， RNase Inhibitor 0.25μL，Oligo dT 0.5μL，藏绵羊腿部骨骼肌RNA 1.0μL，逆转录扩增 反应条件为：42℃，45min；99℃，5min；5℃，5min；

所述PCR反应的50μL体系为：藏绵羊cDNA模板1.25ng，10×PCR缓冲液5.00μL， 25mmol/L的MgCl₂2.00μL，2.5mmol/L的dNTPs 2.00μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶 0.50μL，20pmol/μL的上游引物P1 0.50μL，20pmol/μL的下游引物P2 0.50μL，余量 为无菌蒸馏水。为了克隆得到目的片段，防止得到杂带，本发明经反复试验，对PCR扩增条 件进行了优化选择，本发明优化的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35s， 60℃退火35s，72℃延伸90s，共32个循环；72℃延伸10min。

上述含有藏绵羊myostatin成熟肽基因表达载体构建方法的步骤(3)中所述将RT-PCR 产物连接到pMD18-T载体、转化到E.coli TOP10宿主菌进行克隆的5μL连接体系为：目的 片段Myostatin DNA 2.00μL，载体pMD18-T 0.5μL，Ligation Mix2.5μL。

步骤(5)中所述以pMD18-T-MSTN质粒为模板，在引物P3、P4的引导下扩增藏绵羊 myostatin成熟肽基因MSTN′的25μL PCR体系为：MgCl₂2.5μL、dNTP 2μL、Ex Taq 0.2 μL、P30.5μL、P40.5μL、质粒1μL、10×PCR buffer 2.5μL、去离子水15.8μL。

步骤(5)中所述将藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′连接到pMD18-T载体、并转化 到E.coli TOP10宿主菌进行克隆的5μL连接体系为：目的片段藏绵羊myostatin成熟肽基 因MSTN′DNA 2.00μL，载体pMD18-T 0.5μL，Ligation Mix2.5mL。

步骤(6)中所述双酶切的20μL体系为：质粒DNA10μL，10×K Buffer2μL，BamH I 1 μL，EcoR I 1μL，余量为无菌蒸馏水，双酶切的反应条件为，37℃消化3h。

步骤(7)中所述将MSTN′片段连接到pET28a(+)线状载体后转化到E.coli TOP10宿主 菌的5μL连接体系为：目的片段MSTN′DNA 2μL，pET28a(+)线状载体0.5μL，Ligation Mix2.5μL，连接条件为：16℃连接过夜。

上述含有藏绵羊myostatin表达载体构建方法的步骤(3)、步骤(5)、步骤(7)中所述 转化的方法包括如下步骤：

a、将5.0μL连接体系加入50μL冰上预冷的E.coli TOP10感受态细胞，冰浴30min；

b、42℃水浴热激90s，放入冰浴10min；

c、加入SOC培养基800.0μL，混匀，37℃、120r/min振荡培养60min；

d、5000r/min离心30s，吸去大部分上清液，留下200.0μL上清液，重悬沉淀；

e、将细菌悬浊液均匀涂布在LB平板培养皿上，在37℃培养12～20h，所述LB平板培养 皿含有10mmol/L IPTG、40.0μL 2％X-gal、100.0μg/mLAmp/Kan；

f、用封口胶封住LB平板培养皿，放入4℃冰箱显色30min；

g、挑取单个白色菌落接种于2mL LB液体培养基，37℃、120r/min培养12h后进行质粒 PCR鉴定，所述LB液体培养基含100.0μg/mL Amp/Kan。

上述构建含有藏绵羊myostatin成熟肽基因表达载体构建方法的步骤(3)、步骤(5)、 步骤(7)中所述重组质粒鉴定方法中的质粒PCR 25μL反应体系为：MgCl₂ 2.5μL、dNTP 2 μL、Ex Taq  0.2μL、P30.5μL、P40.5μL、质粒1μL、10×PCR buffer 2.5μL、去 离子水15.8μL，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性35s，60℃退火35s，72℃延伸 90s，共32个循环；72℃延伸10min。

重组表达载体pET28a(+)-MSTN′经转化到宿主菌、IPTG诱导表达、目的蛋白质的纯化与 鉴定、蛋白质复性后得到藏绵羊pET28a(+)-MSTN′重组蛋白质，该重组蛋白质的氨基酸序列 如序列表表6。

具体的，上述藏绵羊pET28a(+)-MSTN′重组蛋白质的制备方法，包括以下步骤：

1)重组载体转化到宿主菌；

2)重组蛋白质的IPTG诱导表达；

3)重组蛋白质的纯化；

4)重组蛋白质的复性；

其中，步骤1)重组载体转化到宿主菌包括：将重组载体pET28a(+)-MSTN′转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌中得到藏绵羊pET28a(+)-MSTN′-E.coliBL21(DE3)工程菌，转化方法同构 建含有藏绵羊myostatin表达载体方法的步骤(7)中所述转化方法相同，所用宿主菌为E.coli BL21(DE3)感受态细胞；

转化得到藏绵羊pET28a(+)-MSTN′-E.coliBL21(DE3)工程菌经质粒PCR、质粒双酶切及 DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到鉴定正确的pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)基因工 程菌；

步骤2)所述重组蛋白质的IPTG诱导表达包括以下步骤：

(1)将经鉴定正确的pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)基因工程菌接种于含卡那霉 素的LB培养基中，37℃、120rpm震荡培养过夜，基因工程菌菌液与LB培养基的体积比为 1∶100；

(2)次日，将过夜培养后的基因工程菌以1∶40的体积比例接种到含Kan的LB培养基 中，于37℃震荡培养；

(3)细菌OD₆₀₀＝0.5～1时，加入1mM IPTG，30℃，诱导表达5-9小时；

(4)4000r/min离心5min，收集菌体，溶于含尿素的PBS缓冲液中，4℃、12000r/min 离心10min，取上清加入等体积2×SDS样品缓冲液，煮沸5min；进行SDS-PAGE电泳，所述 SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为5％；

步骤3)中所述重组蛋白质的纯化包括以下步骤：

(1)包涵体分离：

经步骤2)IPTG诱导的表达菌，4℃、12000r/min离心15min，收集菌体；

a、按1g菌体湿重加入10mL、pH 7.4的PBS缓冲液洗涤2次；

b、菌体悬液于冰上超声破碎20min，破碎5s、间断9s，4℃12000r/min离心15min， 收集沉淀；

c、按1g菌体湿重加入20mL含0.1％体积比的Triton X-100、pH 7.4的PBS缓冲液， 重悬沉淀，4℃静置20min，反复洗涤5次；

d、按1g菌体湿重加入20mL含2M Urea、pH 7.4的PBS缓冲液，重悬沉淀，4℃静置20min， 反复洗涤5次，收集沉淀；

e、用蛋白质溶解液溶解沉淀，按1g菌体湿重加入10mL蛋白质溶解液，4℃溶解过夜，4℃ 12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤备用，所述蛋白质溶解液包括pH 7.4的PBS缓冲液、8M Urea；

(2)重组蛋白质纯化：

将上述经滤膜过滤后的上清液用Ni²⁺螯合层析柱纯化目的蛋白：将Ni²⁺螯合层析柱接入 低压层析系统，用蛋白质溶解液充分平衡，上样；用洗脱液A洗脱杂蛋白；然后用含500mM 咪唑的洗脱液B洗脱目的蛋白，收集洗脱峰；SDS-PAGE蛋白质电泳检测洗脱效果；所述洗脱 液A包括PBS缓冲液pH 7.4、8M Urea及20mM咪唑，所述洗脱液B包括PBS缓冲液pH 7.4、 8M Urea及500mM咪唑；

(3)重组蛋白质的透析复性：

将上述重组MSTN蛋白质纯化方法步骤(7)纯化得到的包涵体蛋白用尿素浓度梯度法4 ℃透析复性，透析缓冲液依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的PBS缓冲液，最后 以无尿素的PBS缓冲液4℃透析过夜。

纯化后的蛋白质用不连续SDS-PAGE电泳检测，浓缩胶5％、分离胶15％，切取凝胶中的蛋 白质条带进行肽质量指纹图谱鉴定。

上述藏绵羊MSTN重组表达蛋白质在藏绵羊繁育中的应用。包括用藏绵羊MSTN重组蛋白 质对藏绵羊进行主动免疫，使藏绵羊机体内发生免疫学反应，刺激机体产生中和抗体，中和 抗体与外源MSTN蛋白质结合的同时也可与机体内源的MSTN蛋白质相结合，封闭MSTN蛋白质 的活性，降低其对肌肉生长的抑制作用，从而提高藏绵羊生长速度。

本发明提供了一种含有藏绵羊myostatin成熟肽基因的表达载体pET28a(+)-MSTN′及重 组藏绵羊MSTN蛋白质以及以该重组蛋白质在藏绵羊繁育中的应用，包括以该重组蛋白质为抗 原对动物进行主动免疫。在本发明中，根据绵羊MSTN基因序列设计了MSTN编码基因引物， 以藏绵羊骨骼肌RNA为模板，在上述引物到引导下进行逆转录PCR扩增，将扩增产物连接到 pMD18-T载体，得到藏绵羊重组pMD18-T-MSTN质粒；根据藏绵羊MSTN功能区成熟肽编码基 因序列设计引物，在该引物的引导下扩增藏绵羊成熟肽基因MSTN′；以pMD18-T-MSTN载体 为模板，将藏绵羊成熟肽基因MSTN′转化得到pMD18-T-MSTN′质粒；用限制性内切酶分别对 pMD18-T-MSTN′质粒和pET28(+)质粒进行双酶切，连接得到的片段，得到藏绵羊重组表达载 体。上述方法得到的含有藏绵羊myostatin成熟肽基因的表达载体pET28a(+)-MSTN′，包含 序列表中序列5的3′端330个核苷酸的藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′和pET28a(+) 载体，该藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′位于pET28a(+)载体的EcoRI和BamH I限制 性内切酶酶切位点之间。

上述含有藏绵羊myostatin成熟肽基因的表达载体pET28a(+)-MSTN′转化后得到藏绵羊 pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)工程菌，该基因工程菌经IPTG诱导表达、纯化、复性 后得到藏绵羊肌肉生长抑制素重组蛋白质。

本发明提供的藏绵羊重组表达载体、重组蛋白质的MSTN编码基因，与其他绵羊相比，存 在2个不同的核苷酸序列。本发明的藏绵羊myostatin成熟肽基因的表达载体pET28a(+)-MSTN ′中，是由序列表中序列5的3′端的藏绵羊成熟肽基因MSTN′与载体pET28a(+)-MSTN′组 成，该表达载体含有6×His Tag序列，Ni²⁺金属螯合层析柱对该序列有特异选择性，有利于 由该重组载体制备得到的重组蛋白质的纯化。MSTN前体蛋白形成后，N-端266个氨基酸的前 肽在RSRR区被切除，生物活性区的C-端109个氨基酸成熟肽通过半胱氨酸残基形成二硫键， 二聚体化后发挥功能。研究表明，前肽过量表达的小鼠N-端前肽与C-末端成熟肽不能正常分 离，二者形成没有生物活性的聚合物。本发明以MSTN编码基因为模板克隆C-末端成熟肽基 因进行表达纯化，而不是直接应用MSTN编码基因，避免了N-端前肽与C-端成熟肽结合形成 没有生物活性的聚合物。

本发明利用基因工程技术构建了高效稳定的重组藏绵羊MSTN成熟肽原核表达系统 pET28a(+)-MSTN′-E.coliBL21(DE3)，在蛋白质纯化方案中设计了包涵体洗涤分离和亲和层 析两步法纯化，确保目的蛋白高纯度、高得率。藏绵羊pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3) 基因工程菌表达的总蛋白经过多次洗涤分离出包涵体蛋白，纯度为80％。此方法所需成本低， 操作简单易行，纯度高，在研究所需蛋白质纯度允许的范围内可用于大规模生产，也可应用 于其他包涵体蛋白质的分离纯化，且在目前的文献中尚未见报道。为进一步提高纯化效率， 本发明选择了带有6×His Tag的pET28a(+)载体，利用Ni²⁺金属螯合层析柱对包涵体蛋白进 行纯化，纯度为92％，纯化效率高，可以满足各种研究要求。

本发明设计了科学高效的免疫程序，用纯化的MSTN成熟肽蛋白对家兔进行主动免疫，为 了降低蛋白质抗原空间结构对免疫原性的影响，本发明用尿素浓度梯度法对纯化的藏绵羊 MSTN成熟肽蛋白质透析复性，严格控制复性温度及程序，最大限度的帮助藏绵羊MSTN蛋白 质组装成高级结构，获得的兔抗藏绵羊MSTN多克隆抗体血清，免疫原性好，效价1∶64000， 在目前报道的以MSTN成熟肽作为抗原的动物免疫研究中效价最高。

本发明设计了动物学实验验证重组藏绵羊MSTN蛋白质的功能及应用的可行性。用重组藏 绵羊MSTN蛋白质主动免疫小鼠，检测体重及日增重，肌纤维面积、数量及直径。二免后15 天，实验组雄鼠日增重显著高于对照组雄鼠，实验组雌鼠日增重略低于对照组雌鼠，差异不 显著。实验组雄鼠肌纤维横截面积高于对照组，但差异不显著；实验组雌鼠肌纤维横截面积 显著高于对照组。实验组雄鼠肌纤维直径显著高于对照组雄鼠，实验组雌鼠肌纤维直径极显 著高于对照组。实验组小鼠肌纤维数量均高于对照组，差异不显著。动物学实验结果从整体 到细胞水平均证实主动免疫重组藏绵羊MSTN蛋白质具有促进肌纤维增殖及肥大，加快肌肉生 长速度的作用，从而表明本发明制备的重组藏绵羊MSTN蛋白质具有应用可行性。

本发明提供的重组藏绵羊MSTN成熟肽蛋白质纯度高，免疫原性好，可应用于藏绵羊MSTN 疫苗制作，用此疫苗对藏绵羊主动免疫，使藏绵羊产生中和抗体，封闭体内MSTN对骨骼肌生 长发育的抑制作用，从而调控机体营养代谢，提高饲料报酬，提高藏绵羊产肉性能，有利于 加速藏绵羊产业发展及畜牧业经济发展。

附图说明

图1为本发明重组载体结构示意图。

图2为藏绵羊腿部骨骼肌总RNA电泳结果。

图3为藏绵羊MSTN的RT-PCR扩增结果。

图4为pMD18-T-MSTN重组质粒PCR鉴定结果。

图5为藏绵羊MSTN基因及氨基酸序列对照图。

图6为藏绵羊MSTN′的PCR扩增结果。

图7为pMD18-T-MSTN′重组质粒PCR鉴定结果。

图8为pMD18-T-MSTN′重组质粒和pET28a(+)载体双酶切结果。

图9为pET28a(+)-MSTN′重组质粒PCR鉴定结果。

图10为pET28a(+)-MSTN′重组质粒双酶切鉴定结果。

图11为pET28a(+)-MSTN′-BL21(DE3)基因工程菌原核表达结果。

图12为MSTN蛋白质纯化结果。

图13为MSTN蛋白质亲和层析洗脱峰。

图14为待检蛋白质样品肽质量指纹图谱。

图15为待检蛋白肽质量指纹图数据库搜寻结果

图16为待检蛋白质样品实验酶解片段与myostatin[Capra hircus]理论酶解片段匹配的 详细信息。

图17为待检蛋白质样品实验酶解片段与myostatin[Capra hircus]相匹配片段的覆盖情 况。

图18为兔抗藏绵羊MSTN多克隆抗体血清效价测定结果。

图19为实验组雄鼠与对照组累计增重的比较。

图20为实验组雌鼠与对照组累计增重的比较。

图21为实验组与对照组小鼠日增重变化折线图。

图22为实验组与对照组雄鼠的平均日增重的比较。

图23为实验组与对照组雌鼠的平均日增重的比较。

图24为小鼠肌纤维横截面积柱形图。

图25为小鼠肌纤维数量柱形图。

图26为小鼠肌纤维直径柱形图。

图中标记：

图2中，1、2、3、4表示藏绵羊腿部骨骼肌总RNA。

图3中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1表示藏绵羊MSTN RT-PCR产物。

图4中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1、2表示pMD18-T-MSTN质粒PCR反应 的产物。

图6中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1表示MSTN′PCR反应的产物。

图7中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1、2、3表示pMD18-T-MSTN′质粒PCR 反应的产物，4表示阴性对照。

图8中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1表示酶切前pMD18-T-MSTN′质粒；2 表示双酶切后pMD18-T-MSTN′质粒；3表示酶切前pET28a(+)质粒；4表示双酶切后pET28a(+) 质粒。

图9中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1、2、3表示pET28a(+)-MSTN′质粒 PCR反应产物，4表示阴性对照。

图10中，M表示DNA marker DL2000分子量标记，1表示酶切前pET28a(+)-MSTN′质粒； 2表示pET28a(+)-MSTN′质粒双酶切产物；3表示MSTN基因阳性对照。

图11中，M表示蛋白质分子量标准，1表示阴性对照BL21(DE3)工程菌表达产物，2表示 阴性对照pET28a-BL21(DE3)工程菌表达产物，3表示未经IPTG诱导的pET28a(+)-MSTN′ -BL21(DE3)工程菌表达产物，4、5、6、7、8、9表示分别经IPTG诱导1h、2h、3h、4h、5h、 6h的pET28a(+)-MSTN′-BL21(DE3)工程菌表达产物。

图12中，M表示蛋白质分子量标准，1表示pET28a(+)-MSTN′-BL21(DE3)工程菌总蛋白，2、 3表示分离的包涵体蛋白，4、5、6表示纯化后的MSTN蛋白质。

图15中，横坐标表示分数，纵坐标表示命中的蛋白数，根据mowse算法和检索数据库的 大小，分数在74分以上才是有意义的(P＜0.05)，即命中的蛋白质处于图中阴影区域以外， 即阴影区之外属于显著区。

图16中，Start-End表示匹配片段在蛋白质中对应的氨基酸序列的位置，Observerd表 示肽片段质量+H，Mr(expt)表示实验获得的肽片段质量，Mr(cale)表示理论肽片段质量，Miss 表示酶解不完全数，Sequence表示匹配的片段对应的氨基酸残基序列。

图17中，粗体下划线部分序列表示与实验酶解片段质量吻合的氨基酸。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用方法如无特别说明，均 为常规方法。所用引物合成由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司完成。

实施例1、藏绵羊pET28a(+)-MSTN′重组载体构建

一、引物设计

根据绵羊myostatin基因序列(AF019622)用Vector NTI软件设计myostatin编码基因 引物，引物序列如下：

上游引物P1：5′-ATGCAAAAACTGCAA-3′

下游引物P2：5′-TCATGAGCACCCACAGCGATCTACT-3′

二、RT-PCR扩增藏绵羊myostatin片段

(1)藏绵羊腿部骨骼肌RNA提取

根据Invotrogen公司提供的总RNA提取方法，按以下步骤提取藏绵羊腿部骨骼肌总RNA：

①取-70℃保存的藏绵羊腿部骨骼肌组织50～100mg，剪碎后移入20mL预先加入1mL Trizol 的匀浆器中进行匀浆，至细胞完全裂解；

②将匀浆所得液体移入2mL离心管，于室温静置10min左右，4℃10000r/min离心15min；

③取上层液体移入另一离心管，加入0.5mL氯仿，振荡摇匀，室温静置10min；

④将离心管置于高速台式冷冻离心机，在4℃10000r/min离心15min；

⑤吸取上层水相置于另一新的无菌离心管中，重新加入0.5mL氯仿，振荡摇匀，室温静置 5min后于4℃，10000r/min离心15min；

⑥吸取上层水相置于另一新的无菌离心管中，加入0.5mL异丙醇，振荡摇匀后于室温静置 15～20min；

⑦4℃10000r/min离心10min，弃上清，加0.5～1mL 75％乙醇洗涤两次；

⑧取40.0μL无RNAase的水重悬干燥后的RNA，置-80℃保存。

上述提取的藏绵羊腿部骨骼肌总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳，由图2可见28S核糖体RNA和 18S核糖体RNA两条带，经紫外分光光度计检测，OD260nm/280nm值在1.85～2.05之间，说明 RNA完整性好，且其纯度高，可用作RT-PCR试验。

(2)cDNA第一条链的合成

以藏绵羊腿部骨骼肌RNA为模板，Oligo dT为引物，按照表1所示配制逆转录反应液，用 AMV反转录酶合成cDNA第一条链。反应体系如下：

表1反转录反应体系

逆转录反应条件为：42℃，45min；99℃，5min；5℃，5min。

(3)PCR扩增

按照表2所示配制PCR反应体系，PCR扩增反应条件为：95.0℃预变性10min；94.0℃变 性35s，50.5℃退火35s，72.0℃延伸90s，共32个循环；72.0℃再延伸10min，扩增产 物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表2PCR反应体系

由图3可知，RT-PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳在约1128bp处可见一特异性条带， 与预期目标片段大小一致。

三、藏绵羊myostatin克隆

将RT-PCR产物连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(E.coli TOP10) 进行克隆，用质粒PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组 质粒中的Myostatin片段测序，将测序结果正确的阳性重组质粒命名为pMD18-T-MSTN质粒， 具体按如下操作步骤进行：

(1)连接反应

将RT-PCR产物连接到pMD18-T载体进行克隆，按照表3所示，配制连接10.0μL反应体 系，将连接反应体系放入置于16℃的低温水浴连接过夜。

表3连接反应体系

(2)转化

①取一管大肠杆菌TOP10感受态细胞，置于冰浴中，待融化后用预冷的枪头吸取30～ 50.0μL到一个新的预冷的无菌离心管中，加入连接产物5.0μL，轻轻旋转以混合内容物， 在冰中放置20～30min。

②42℃水浴热激90s，不要摇动管子，然后迅速放入冰浴10min；

③加入SOC培养基800.0μL，轻轻混匀，37℃、160r/min振荡培养45min～90min；

④5000r/min离心2min，轻轻吸去上清液，留下约100.0μL上清液，重悬沉淀将菌混 匀，分两次涂板；

⑤涂布预先已准备好含有100.0μL 100mmol/L IPTG、40.0μL 2％X-gal、100.0μg/mL Amp的LB平板，在室温吸收后，然后倒置培养皿37℃培养12～20h；

⑥然后用封口胶封住，放入4℃冰箱显色30min。

(3)用质粒PCR法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中的Myostatin 测序，将测序结果正确的阳性重组质粒命名为pMD18-T-MSTN质粒。具体如下：

取5mL过夜培养的菌液用碱裂解法提取质粒，以1.0μL质粒作模板，按表4配制PCR反 应液，反应条件与RT-PCR中的PCR反应条件相同。用未经转化的TOP10作为阴性对照。用 1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。由图4可知，质粒PCR扩增产物约1128bp，与预期片段大小相 符，表明筛选的重组质粒为阳性pMD18-T-MSTN重组质粒。

表4藏绵羊pMD18-T-MSTN重组质粒PCR鉴定反应体系

经质粒PCR鉴定筛选的pMD18-T-MSTN阳性重组质粒用双脱氧链终止法进行测序。将序列提 交到NCBI数据库进行BlAST比对分析，结果表明，上述克隆的藏绵羊myostatin序列正确。

由图5可知，藏绵羊myostatin编码基因长1128bp，编码375个氨基酸。结构上，藏绵 羊MSTN基因具有TGF-β超家族的典型特点，①靠近N-末端氨基酸有一个疏水的分泌用的信 号肽序列LAP约40KDa，可以藉此跨越内质网膜；②生物活性区由4个氨基酸(RSRR)组成的 蛋白酶加工位点；③C-末端区域有9个保守的半胱氨酸生物活性区，它们靠分子间的二硫键 形成二聚体。MSTN基因表达产物是26KD的成熟糖蛋白，能被分泌到胞外，分泌后形成的前 肽(375个氨基酸)在RSRR区被切除掉N-端266个氨基酸，剩余的成熟区的109个氨基酸通过 其中的9个半胱氨酸形成二硫键，二聚体化后与细胞膜上的特异性受体发生相互作用，通过 三种Smad蛋白的介导将信号传入细胞核，作用于靶基因的调控区。

用DNAMAN软件分别对藏绵羊与Gene Bank中公布的绵羊(AF019622)、山羊(AY436347)、 牛(AY160688)、牦牛(EU926669)、马(NM_001081817)、猪(AY448008)、狗(AY367768)、人 (AF019627)、兔(NM_001109821)MSTN编码基因及氨基酸序列进行序列一致率比对。由表5 可知，藏绵羊与其他动物MSTN基因的序列一致率为91％～99.8％。藏绵羊与普通绵羊存在2 个核苷酸的差异，其中MSTN编码基因450位点，藏绵羊为G，绵羊为A，688位点，藏绵羊 为C，绵羊为T。

表5藏绵羊与其它9种动物MSTN基因序列多重比对

由表6可知，藏绵羊MSTN成熟肽氨基酸与其他动物的序列一致率为93.1％～100％。藏绵 羊与绵羊MSTN基因存在2个核苷酸位点的差异，MSTN基因的保守性，预示了MSTN对各物 种的进化发育及维持正常的生理机能具有及其重要的作用。

表6藏绵羊与其它9种动物MSTN氨基酸序列多重比对

四、藏绵羊MSTN成熟肽基因克隆

以上述pMD18-T-MSTN质粒为模板，在引物P3、P4引导下PCR扩增藏绵羊MSTN成熟肽基 因，命名为MSTN′，由图6可知，扩增得到的MSTN′长0.33kb，与预期结果相符。将MSTN ′连接到pMD18-T载体，并转化到E.coli TOP10宿主菌进行克隆，用质粒PCR法筛选阳性重 组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中MSTN′基因测序。由图7可知，PCR扩增得到 了0.33kb产物，与预期结果相符，表明MSTN′基因成功连接到pMD18-T载体，DNA测序结果 显示序列正确，将经鉴定正确的重组质粒命名为pMD18-T-MSTN′。

五、藏绵羊pET28a(+)-MSTN′重组载体构建

用限制性内切酶EcoRI和BamH I对pMD18-T-MSTN′质粒和pET28a(+)质粒分别进行双 酶切，分别回收得到MSTN′片段和pET28a(+)线状载体；将MSTN′片段连接到pET28a(+)开 环线状载体，转化到E.coli TOP10宿主菌，用质粒PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性 重组质粒，得到重组载体pET28a(+)-MSTN′，具体按如下操作步骤进行：

(1)pMD18-T-MSTN′质粒及pET28a(+)载体双酶切

上述提取的质粒、限制性内切酶BamHI、EcoR I及各种缓冲液按照表7所示配制双酶切 体系，置于37℃消化3h左右，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表7双酶切体系

(2)目的片段的回收纯化

采用上海生物工程有限公司凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，方法如下：

①将100μL RT-PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳；

②用干净的手术刀切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，放入1.5mL离心管中，称 其重量；

③按每100mg琼脂糖凝胶加入400.0μL Binding Bufffer，混匀后置50～60℃、水浴锅 内水浴10min，使胶彻底融化，加热融胶时每2min混匀一次；

④将过滤柱放入2mL收集管中，将融化的胶溶液转移到过滤柱中，12000r/min室温离 心1min；

⑤取下过滤柱，倒掉收集管中的废液，将过滤柱放入原收集管中，加入300.0μL Binding Buffer，12000r/min室温离心1min；

⑥取下过滤柱，倒掉收集管中的废液，将过滤柱放入原收集管中，加入700.0μL DNA Wash Buffer，室温放置2～3min，12000r/min室温离心1min；

⑦重复步骤6；

⑧倒掉收集管中的废液，将过滤柱放入原收集管中，空转，12000r/min，室温离心1min；

⑨将过滤柱放入一只新的1.5mL离心管，在柱膜中央加30.0μL Elution Buffer室温 或37℃放置2min；

⑩12000r/min高速离心1min，离心管中的液体即含有回收的DNA片段，可立即使用或 -20℃保存备用；

(3)连接反应

将MSTN′连接到pET28a(+)载体，按照表8所示，配制连接5.0μL反应体系，将连接反 应体系放入置于16℃的低温水浴连接过夜。

表8连接反应体系

(4)转化

将连接体系转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞，具体操作与上述步骤三藏绵羊myostatin 克隆中的转化操作相同。

(5)重组质粒鉴定

用质粒PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒并用DNA测序方法重组质粒进行鉴定， 测序正确的重组质粒即为pET28a(+)-MSTN′重组载体。具体操作与上述步骤三藏绵羊 myostatin克隆中的质粒PCR及步骤五中质粒双酶切鉴定操作相同。

用MSTN成熟肽基因特异性引物进行质粒PCR，如图9可知，质粒PCR扩增得到0.33kb 的目的条带。由图10可知，用EcoRI和BamHI双酶切重组质粒pET28a(+)-MSTN′，得到0.33kb 的目的片段和5.4kb的载体片段。双酶切及质粒PCR鉴定均表明重组表达载体中含有一条 330bp的插入片段，与预期插入的藏系绵羊MSTN成熟肽基因大小相符，表明MSTN成熟肽基 因已经成功的插入到重组载体中。重组质粒PET28a(+)-MSTN′测序结果与pMD18-T-MSTN′重 组子测序结果进行比对，发现插入序列一致率达到100％。藏绵羊MSTN基因片段定向插入且 阅读框正确，说明成功构建了藏绵羊myostatin成熟肽基因原核表达载体。

实施例2、藏绵羊pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)基因工程菌表达

一、构建藏绵羊pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)基因工程菌

将pET28a(+)-MSTN′重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，具体操作步骤与上述 实施例1步骤三藏绵羊myostatin克隆中的转化操作相同。

二、IPTG诱导pET28a(+)-MSTN′-E.coli BL21(DE3)基因工程菌表达

(1)挑取重组菌单菌接种于LB培养基中，37℃、120rpm震荡培养过夜，基因工程菌菌 液与LB培养基的体积比为1∶100，以含有空载体的细菌样品做对照；

(2)次日，将实验组与对照组活化的种子菌以1∶40体积比的比例接种到含有Kan的 LB培养基中，于37℃，120rpm震荡培养；

(3)待实验组与对照组细菌OD₆₀₀＝0.5～1时，加IPTG至浓度为1mmol/L，30℃，继续培 养5h；

(4)4000r/min离心5min，收集菌体。

三、表达产物SDS-PAGE电泳检测

(1)将上述离心收集的表达产物溶于PBS缓冲液(含8mol/L尿素，pH7.5)，4℃，12000rpm， 离心10min；

(2)取上清加入等体积2×SDS样品缓冲液，煮沸5min；

(3)取10μL样品，用常规SDS-PAGE方法进行检测(浓缩胶浓度5％，分离胶浓度15％)， 记录结果数据。

预计表达的藏绵羊MSTN蛋白分子量大约16.5kDa。所构建的pET28a(+)-MSTN′表达载体 和空白对照质粒pET28a(+)，在受体菌BL21(DE3)中进行平行表达后，裂解后离心收集菌体进 行SDS-PAGE电泳。由图11可知，经IPTG诱导的pET28a(+)-MSTN′-BL21(DE3)基因工程菌 在14.0～20.1KDa区域呈现出明显的蛋白条带，约16.5kDa，且条带亮度随诱导时间的变化 而变化，经IPTG诱导4小时的工程菌原核表达蛋白条带亮度最高，空白对照组BL21(DE3)和 pET28a(+)-BL21(DE3)均为见明显的蛋白条带，未经IPTG诱导的pET28a(+)-MSTN′-BL21(DE3) 的表达产物也未见明显的特异性条带。

实施例3、藏绵羊MSTN成熟肽蛋白质纯化

一、包涵体分离

(1)经IPTG诱导的表达菌，4℃12000r/min离心15min，收集菌体；

(2)菌体中加入PBS缓冲液，1g菌体湿重加入10mL，重悬菌体，洗涤2次；

(3)菌体悬浊液置于冰上超声破碎20min，破碎5s、间断9s，4℃12000r/min离心15min， 收集沉淀；

(4)加入含0.1％Triton X-100的PBS缓冲液重悬沉淀，1g菌体湿重加入20mL缓冲液， 4℃静置20min，反复洗涤5次；

(5)以同样的方法用含2M尿素的PBS缓冲液洗涤包涵体5次，4℃12000r/min离心 15min，收集沉淀；

(6)洗涤后的沉淀加入含8M尿素的PBS缓冲液4℃溶解过夜，1g菌体湿重加入10mL包 涵体变性液，4℃12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤备用。

二、亲和层析纯化

(1)将上述经滤膜过滤后的上清液用Ni²⁺螯合层析柱纯化目的蛋白：将Ni²⁺螯合层析柱 接入低压层析系统，用含8M尿素的PBS缓冲液充分平衡，上样；

(2)用含20mM咪唑、8M尿素、pH值7.4的PBS缓冲液(洗脱液A)洗脱杂蛋白；

(3)用含500mM咪唑、8M尿素、pH值7.4的PBS缓冲液(洗脱液B)洗脱目的蛋白，收 集洗脱峰。

三、纯化后蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测及肽质量指纹图谱检测

上述纯化后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测，方法与实施例3中相同。由图12可知， 重组基因工程菌表达的藏绵羊MSTN成熟肽蛋白质单体分子量为16.5kDa。总蛋白经过Triton X-100和2M Urea洗脱后，大部分杂蛋白被除掉，在29.0kDa～44.3kDa间，隐约可见微量杂 蛋白。洗脱后的产物经8M Urea溶解，得到了较高纯度的包涵体蛋白，经Quantity One软件 检测，纯度为83％。利用金属镍螯合层析柱可以特异性结合带有6×His Tag融合蛋白的特性， 纯化His-MSTN融合蛋白，回收洗脱峰，图13。由此表明，亲和层析得到了高纯度的融合蛋 白His-MSTN，经Quantity One软件检测，纯度为94％。

亲和层析得到的蛋白质样品，送交北京华大蛋白质研究中心进行胶内酶切，然后将所得 的酶解产物进行MALDI-TOF-MS分析，即得到肽质量指纹图谱即PMF，图14。所得PMF数据利 用Mascot软件，在NCBI数据库中进行检索来鉴定蛋白质。由图15可知，肽质量指纹图谱显 示，在NCBInr数据库，登录号为gi|21886638，检索到一种蛋白质MSTN[Capra hircus]， 与待检样品的匹配分数为83分(＞74分)，说明两者之间氨基酸序列同源性比较高，在统计学 上有意义(P＜0.05)，二者属同一种蛋白质，期望值为0.0084，搜索肽段数为31，匹配肽段数 为8，序列覆盖度为60％。理论酶解片段匹配的详细信息见图12，相匹配片段的覆盖情况见 图16和图17。

三、蛋白透析复性

用尿素浓度梯度法透析复性藏绵羊MSTN蛋白质

(1)将透析袋剪成适当长度，在含1mM EDTA的Na₂CO₃溶液中沸30分钟，用蒸馏水彻底清 洗；

(2)用棉线将透析袋的一头扎结，并保证不漏，将洗脱下来的含有目的蛋白的各管洗脱液 混合，加到透析袋中，打结透析袋的另一头，将透析袋加入到含6M尿素的PBS透析缓冲液中；

(3)更换透析液，依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的PBS缓冲液，4℃进行 透析。

(4)以不含尿素的PBS缓冲液4℃透析过夜。

实施例4、藏绵羊MSTN成熟肽蛋白质的应用及免疫学检测

藏绵羊MSTN重组表达蛋白质在藏绵羊繁育中的应用中，用藏绵羊MSTN重组蛋白质对藏 绵羊进行主动免疫。用藏绵羊MSTN重组蛋白质为抗原，主动免疫家兔制备兔抗藏绵羊MSTN 多克隆抗体血清，检测藏绵羊MSTN重组蛋白质的免疫原性，从而验证藏绵羊MSTN重组表达 蛋白质主动免疫藏绵羊后，能否使机体产生中和抗体。

其中，兔抗藏绵羊MSTN多克隆抗体血清，是由以下方法制备得到的：

将实施例3中所得蛋白质作为抗原主动免疫家兔，制备多克隆抗血清。

一、快速混合乳化法制备弗氏佐剂抗原

分别取抗原(纯化的藏绵羊MSTN重组蛋白质，浓度1mg/m1)与弗氏佐剂各1mL，按1∶1 体积混合，置于超声波破碎机上，粉碎针浸入液面下0.5～0.8cm，距离瓶底1.5cm，每次乳 化10～15s，冰浴或冰箱中冷却1min，反复乳化3～4次，即可完全乳化。用12号针头吸入 注射器，如容器底或容器壁有残留，可800～1000r/min离心5～10min。

将弗氏抗原佐剂滴入冷水中，每一滴都应保持完整不分散，且聚成滴状，浮于水面或沉 于水底，即乳化完全，为完全的油包水乳剂。若分散成云雾状或细小颗粒，则乳化不合格。

二、免疫程序

首次免疫：首次免疫采用全量免疫法，于家兔两只后脚掌皮下注射弗氏完全佐剂抗原2mL， 每只家兔免疫MSTN蛋白质1mg。

加强免疫：采用淋巴结免疫法或多点皮下免疫法，首免10天后，于家兔后肢内侧腘窝淋 巴结注射弗氏不完全佐剂抗原0.5mL，如淋巴结免疫失败，则采用皮下多点注射，背部皮下 注射6～8点，每点0.5mL，加强免疫2次后进行试血。加强免疫2～3次。

三、血清采集及分离

放血前动物禁食24h，防止血脂过高。采用心脏采血法采血：将动物做仰卧位或垂直位 固定，剪去左胸部毛，消毒皮肤，用食指触其胸壁，探明心脏搏动最明显处，用16号针头在 预定位置于胸壁成45°角刺入，针头刺入心脏后有明显的搏动感，待见到血液进入注射器后， 即将注射器固定并往外抽血，一只家兔一次可取血20～30ml。血液置37℃凝固2小时，然后 放置4℃过夜，使血块收缩。将血块自容器壁分离，将血清全部转移置离心管。4℃2500r/min 离心30min，取上清即血清部分于前面的血清混合，4℃1500r/min离心全部分离的血清部分。 最后将血清分装，存于-80℃。

四、抗体效价检测

用间接酶联免疫吸附法检测血清特异性及抗体滴度，具体步骤为：

1、用包被缓冲液将MSTN蛋白质稀释成1-10μg/ml，每孔加0.1mL，4℃过夜，移去包被 缓冲液，用洗涤缓冲液洗3次，每次5min；

2、每孔加0.1mL 5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，移去脱脂奶粉，用洗涤缓冲液洗3次， 每次5min；

3、每孔加稀释缓冲液稀释的待检血清各0.1mL，37℃，孵育1-2小时，移去血清，用洗 涤缓冲液洗3次，每次5min；

4、每孔加入辣根过氧化氢酶标价的山羊抗兔IgG 0.1mL，37℃孵育1-2小时，移去液体 用洗涤缓冲液洗3次，每次5min。

5、各反应孔中加入3，3，5，5-四甲基联苯胺底物溶液0.1ml，37℃孵育10～30分钟；

6、在各反应孔中加入2M硫酸0.05mL终止反应。

7、用酶标仪测450nm处各孔OD值，以空白对照孔调零，若大于规定的阴性对照OD值的 2.1倍，即为阳性。

所述包被缓冲液为0.1mol/L Na₂CO₃、0.1mol/L NaHCO₃、pH9.6；所述洗涤缓冲液为PBS pH 7.2、0.05％吐温20，所述稀释缓冲液为PBS(pH 7.2)、0.05％吐温20、1％脱脂奶粉， 所述PBS缓冲液为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂P04 1.4mmol/L，pH7.2。

在间接ELISA检测中，选用未免疫的正常兔血清作为阴性对照，由表9及图18可知，稀 释64000倍后，阴性对照OD₄₅₀＝0.0145，兔抗藏绵羊MSTN抗体血清OD₄₅₀＝0.278，为阴性对照 的19倍，由此判定兔抗藏绵羊MSTN多克隆抗体血清效价为1∶64000。

表9兔抗藏绵羊MSTN多克隆抗体血清效价测定结果

注：P表示兔抗藏绵羊MSTN多克隆抗体血清OD₄₅₀值；N表示正常兔血清阴性对照OD₄₅₀值。

由此表明本发明制备的藏绵羊MSTN蛋白质具有较高的免疫原性。已有的研究结果表明， 利用体外注射抗MSTN单克隆抗体以阻断体内MSTN的方法可以有效的促进机体肌肉的生长发 育，本发明中重组藏绵羊MSTN蛋白具有较高的免疫原性，家兔经主动免疫后产生了特异性较 好、效价高的多克隆抗体。由此提示，用本发明提供的藏绵羊MSTN蛋白主动免疫藏绵羊，可 使之产生中和抗体，并进而阻断MSTN的作用通路，降低MSTN对肌肉发育的抑制作用，提高 藏绵羊产肉性能。

实施例5、藏绵羊MSTN成熟肽蛋白质功能检测

用藏绵羊MSTN重组表达蛋白质主动免疫小鼠，观察其对小鼠体重及肌纤维的影响，为应 用主动免疫该蛋白质加快藏绵羊生长速度提供理论依据及数据支持。

其中，藏绵羊MSTN重组表达蛋白质主动免疫小鼠包括以下方法：

一、小鼠主动免疫MSTN蛋白质后体重检测

昆明小白鼠(NIH mice)分2组，实验组25只，其中：雄鼠12只，雌鼠13只，分笼饲 养；对照组25只，其中：雄鼠13只，雌鼠12只，分笼饲养。两组小鼠均正常饲养5天，上 午十点饲喂，晚上十点第二次饲喂，用记号笔在小鼠尾部标记编号。取藏绵羊MSTN′蛋白质 抗原(浓度1mg/mL)与弗氏佐剂按1∶1体积混合(各1mL)，用超声波破碎仪混合乳化。首 次免疫用弗氏完全佐剂乳化的疫苗，采用小鼠皮下多点注射，每只小鼠注射疫苗100uL。对 照组注射等量的生理盐水与弗氏完全佐剂乳化物。首次免疫15日后，注射弗氏不完全佐剂抗 原50uL，采用皮下多点注射，背部皮下注射6～8点，第二次免疫37日后进行第三次加强免 疫。对照组注射等量的生理盐水与弗氏不完全佐剂乳化物。注射疫苗后，隔一天称重，在早 上十点喂食之前称重并记录体重。

由表10、表11及图22、图23可看出，整个实验中，小白鼠生长良好，雄鼠平均体重均 高于雌鼠；从一免后6天到二免后18天，雄性小鼠累计增重实验组和对照组之间均无显著性 差异(P＞0.05)。实验组F(雌鼠)与对照组相比，前期体重变化差异不显著(P＞0.05)，但 二免后6天、二免后12天、二免后18天，一直持续到二免后24天，雌性小鼠累计增重实验 组和对照组之间均呈显著性差异(P＜0.05)；后期三免后差异不显著(P＞0.05)。可见藏绵 羊肌肉抑制素C-端重组蛋白(MSTN)对肌肉生长的抑制作用在雌雄间可能有差异。

表10小鼠免疫前到二免后18天累计体重变化情况

注：表中“*”表示对照组与相应的实验组t检验结果，P＜0.05

表11小鼠二免后24天到三免后30天累计体重变化情况

注：表中“*”表示对照组与相应的实验组t检验结果，P＜0.05

由表12和图21可知，第一次注射MSTN基因工程蛋白后的实验组雄鼠与雌鼠生长速度 (日增重g/d)均比对照组低，而且差异极显著(P＜0.01)；二免后实验组雄鼠生长速度(日 增重g/d)高于对照组，且差异显著(P＜0.05)，实验组雌鼠生长速度(日增重g/d)仍然低 于对照组，但是差异不显著(P＞0.05)；第三次注射后的实验组生长速度高于对照组(日增 重g/d)，差异不显著。由此可见第一次注射MSTN基因工程蛋白后15天内对小鼠的日增重 起到明显的抑制作用。由图22和23发现，小鼠在藏绵羊肌肉抑制素C-端重组蛋白(MSTN)对 肌肉生长的干扰作用下平均日增重有较大变化。

表12小鼠各个免疫阶段平均日增重长变化(g/d)

注：“**”表示差异极显著(P＜0.01)；“*”表示差异显著(P＜0.05)

小鼠免疫MSTN后体重检测结果显示，在第一次注射MSTN基因工程蛋白后，虽然实验组 雌鼠、雄鼠体重均较对照组低，但差异不显著。但从生长速度即日增重比较发现，照组小鼠 生长速度显著的高于实验组，原因可能是小鼠注射MSTN蛋白时，小鼠平均为20日龄，处于 迅速生长期，小鼠体内也表达一定量的MSTN，当外源注射MSTN蛋白到小鼠体内后，小鼠体内 MSTN蛋白质含量提高，MSTN蛋白开始发挥作用，抑制小鼠肌肉生长发育，从而抑制体重的增 长；第二次注射是在第一次注射后的第15天，实验组雄鼠日增重显著高于对照组，实验组雌 鼠与对照组差异不显著，相比第一次注射后生长速度加快。但是从累计体重上比较，发现实 验组均低于对照组，雌鼠的差异显著，出现上述结果，可能有以下几个方面的原因：第一， 由于小鼠免疫体系在20日龄左右已建立，进入机体的MSTN基因工程蛋白逐渐被机体识别， 并对机体开始产生免疫反应，此时机体出现MSTN蛋白的拈抗体，抑制了外源注射的MSTN的 作用，同时小鼠自身的MSTN也受到了抑制，导致小鼠的生长速度发生了改变，与第一次注射 后比较，有加快的趋势；第二，由于对照组在第一次注射后生长迅速，到了第二次注射后达 到了一定的体重，生长速度逐渐下降；第三，从累计体重比较，实验组均低于对照组，可知 MSTN还在一定程度上发挥抑制作用。从雌雄小鼠的累计体重上比较发现，MSTN的抑制作用存 在雌雄差异。第三次注射后，发现实验组与对照组的体重差异逐渐变小。出现这样的原因， 可能是因为第三次注射与第二次间隔了37天，小鼠已经成年，肌肉抑制素的抑制作用不明显 所致。

二、石蜡切片法比较小鼠肌纤维面积及数量

取材与固定：将小鼠处死，统一选取右腿股二头肌中段，取1～5立方毫米肌肉，称重后 迅速放入装有10ml固定液的试管里，固定时间为12～24h。固定液体积约为组织块体积的15 倍。组织固定液包含苦味酸饱和溶液375mL，甲醛125mL，冰乙酸25mL。

洗涤与脱水：用穿透性很好的擦镜纸将组织块连同标签纸包裹，置入广口瓶中，一个广 口瓶分装8个组织块。用50％的酒精清洗组织块，冲洗多次。用不同的酒精浓度逐级脱水， 具体过程为：70％酒精(2h)→85％(2h)→95％I(过夜)→95％II(1h)→100％I(0.5h) →100％II(0.5h)

透明与透蜡：采用二甲苯透明，二甲苯I(10min)→二甲苯II(10min)，透蜡前先将 不同溶解度的石蜡溶解，置于恒温箱中，温度保持在62℃，透明好的组织块迅速放入石蜡I (熔点为52℃)，约1.5h；然后移入石蜡II(56℃)，约1.5h。

包埋：点燃酒精灯，从恒温箱中取出石蜡III(62℃)倒入包埋纸盒中，用热镊子将组织 块迅速移入包埋纸盒中，切面方向朝下，标签纸置于旁边。之后，置于空气中自然冷却。

修整蜡块并固定：切去组织周围过多的石蜡，用手术刀将石蜡切成正方形或长方形，四 周离组织1-2mm，两边必须平行，前端离材料宜近。然后把修整好的蜡块固定在事先准备好 的小木块上，先把蜡铲在酒精灯上加热至冒青烟后，将蜡块底部烙熔后迅速贴在小木块的底 座上。固定好后再将标签贴于蜡块下部边缘。

切片：将切片刀装在切片机的刀架上并固定好。固定好粘有蜡块的小木块，调整蜡块与 刀的合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角，切片厚度一般为5～8μm，连续切片形成蜡带。 用镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置在温水上，由于受到水的张力，切片自然平 整地展开，如果出现褶皱，用镊子轻轻拨开。然后用载玻片开始捞片，依次放在切片盒中， 放在50℃烘箱中烤干。

脱腊与复水：把已干燥的切片依次放在切片架上，分别放入盛有二甲苯I、II的染缸中 脱蜡，每次15min。随后进行复水，依次置于梯度浓度酒精中，100％I→100％II→95％I→95％ II→85％→70％各3分钟后入蒸馏水清洗一次。

苏木素核染：放入苏木精染液中10～15分钟，至细胞核为紫红色。入自来水中冲洗3分 钟以上至细胞核呈鲜亮的蓝色。入酸性酒精水中分化弥染，约几秒钟，见切片变红，色泽较 浅即可，此步为染色成败的关键。入自来水中回复蓝色，入碱性水(氨水)中数秒复蓝，入 自来水中冲洗30秒～1分钟。将切片放入70％、80％酒精脱水各1～2分钟。

伊红复染：将切片入伊红染液1～3分钟，主要染细胞质，染色好的切片应该是细胞核被 苏木精染成鲜明的蓝色，细胞质被伊红染成桃红色，红蓝相映色彩鲜明，对比明显。将切片 依次放入70％酒精→85％→95％I→95％II→100％I→100％II各3～5分钟。脱水好的切片待酒 精蒸发完后，依次铺在切片框上，准备封片。

封片：用中性树胶封片；擦拭玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐 步盖下去，避免发生气泡。封好后，放在烘箱中烘干，烘干后用OLYMPUS倒置显微镜10×40 倍放大观测切片，计算肌纤维面积及数量。数据以平均数±标准差(X±SE)表示，采用独立 样本t检验进行分析，P＜0.05表示具有统计学意义。

增重实验结束以后(饲养96天)将小鼠处死，统一选取右腿股二头肌中段进行肌纤维横 切面积比较。由表13和图24可知，小鼠股二头肌肌纤维横截段面积比较，实验组雄鼠高于 对照组，但差异不显著(P＞0.05)；实验组雌鼠高于对照组，达到差异显著水平(P＜0.05)。 这一结果与小鼠累计体重变化结果有相似之处，即藏绵羊肌肉抑制素C-端重组蛋白(MSTN)对 肌肉生长的抑制作用在雌雄间可能有差异。

表13小鼠肌纤维横截面积测定结果

注：表中“*”表示对照组与相应的实验组t检验结果，P＜0.05

在显微镜下对小鼠股二头肌石蜡切片进行肌纤维数量计算，数据以平均数±标准差(X ±SE)表示，采用独立样本t检验进行分析，P＜0.05表示具有统计学意义。由表14及图25 可知，实验组雄鼠及雌鼠肌纤维数量均略高于对照组，未达到显著差异水平，由此表明，外 援注射MSTN蛋白质对小鼠肌纤维增殖影响不大。

表14小鼠肌纤维数量测定结果

注：“**”表示t检验结果差异极显著(P＜0.01)；“*”表示差异显著(P＜0.05)

三、浸渍离析法比较小鼠肌纤维直径

处理组织块：将小鼠股二头肌组织块放入装有分离液的离心管中，浸泡2～3天。分离液 的用量为10mL/组织块。浸泡后第三天内，倒去分离液，从10mL离心管中换到1.5mL的离心 管中，加入蒸馏水洗涤组织块，并用力摇动，使组织块分散。组织分离液包含硝酸100mL， 甘油200mL，水200mL。

染色：组织用蒸馏水洗涤几次后，用移液器吸取500uL的苏木素加到离心管中，轻轻摇 晃几分钟后，倒掉苏木素，加入自来水洗涤。洗涤后再加入伊红染核，染色3分钟，染后开 始脱水。依次放入酒精浓度为70％→85％→95％I→95％II→100％I→100％II，各3～5分钟。

透明并封片：在树胶中滴入几滴二甲苯，即可在封片中透明。取少量肌纤维组织置于载 玻片上，用镊子轻轻分散开，滴上树胶，盖上干燥的盖玻片，封片后置50℃烘箱中烤干。

OLYMPUS倒置显微镜刻度校正：在10×10倍下物测微尺的最小刻度为0.0imm，用其校正 OLYMOUS显微镜在10×40倍下目测微尺的刻度，经校正其最小刻度为12.5um。

肌纤维直径测定及统计分析：在10×40倍显微镜下，用直线形目测微尺测量肌纤维横断 面最长距作为肌纤维直径，每个样本测10～30根肌纤维，被测肌纤维乃随机取样，取平均值。 数据以平均数±标准差(X±SE)表示，采用独立样本t检验进行分析，P＜0.05表示具有统 计学意义。

增重实验结束以后(饲养96天)将小鼠处死后，对上述右腿股二头肌组织进行浸渍离析 法比较肌纤维直径。由表15和图26可知，实验组小鼠肌纤维直径显著高于对照组(P＜0.05)， 其中雌鼠差异达到极显著(P＜0.01)。这一结果与累计体重变化结果、肌纤维面积测定结果 一致。

表15小鼠肌纤维直径测定结果

注：“**”表示t检验结果差异极显著(P＜0.01)；“*”表示差异显著(P＜0.05)

小鼠肌纤维面积、直径及数量检测结果显示，实验组小鼠肌纤维面积、直径均高于对照 组，肌纤维数量物显著性差异，这一结果说明藏绵羊MSTN蛋白质注射到小鼠体内后，小鼠体 内发生了免疫反应，产生了MSTN拈抗物，削弱了外源及体内MSTN的抑制作用，导致肌纤维 增殖与肥大，与预想的结果一致，由此表明，主动免疫重组藏绵羊MSTN蛋白质具有促进小鼠 肌纤维增殖、肥大，加快小鼠生长速度的作用。

<110> 西南民族大学

<120>藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质

<160> 6(序列的总数)

 

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 1

atgcaaaaac tgcaa 15

 

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 2

tcatgagcac ccacagcgat ctact 25

 

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 3

cgggatccga ttttgggctt gattgtgat 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 4

cggaattctc atgagcaccc acagcgat 28

 

<210> 5

<211> 1128

<212> DNA

<213> 藏绵羊（Ovis aries breed Tibetan）

<400> 5

atgcaaaaac tgcaaatctt tgtttatatt tacctattta tgctgcttgt tgctggccca    60

gtggatctga atgagaacag cgagcagaag gaaaatgtgg aaaaaaaggg gctgtgtaat   120

gcatgcttgt ggagacaaaa caataaatcc tcaagactag aagccataaa aatccaaatc   180

ctcagtaagc ttcgcctgga aacagctcct aacatcagca aagatgctat aagacaactt   240

ttgcccaagg ctcctccact ccgggaactg attgatcagt acgatgtcca gagagatgac   300

agcagcgacg gctccttgga agacgatgac taccacgtta cgacggaaac ggtcattacc   360

atgcccacgg agtctgatct tctagcagaa gtgcaagaaa aacccaaatg ttgcttcttt   420

aaatttagct ctaagataca acacaataag gtagtaaagg cccaactgtg gatatatctg   480

agacctgtca agactcctac aacagtgttt gtgcaaatcc tgagactcat caaacccatg   540

aaagacggta caaggtatac tggaatccga tctctgaaac ttgacatgaa cccaggcact   600

ggtatttggc agagcattga tgtgaagaca gtgttgcaaa actggctcaa acaacctgaa   660

tccaacttag gcattgaaat caaagctcta gatgagaatg gtcatgatct tgctgtaacc   720

ttcccagaac caggagaaga aggactgaat ccttttttag aagtcaaggt aacagacaca   780

ccaaaaagat ctaggagaga ttttgggctt gattgtgatg agcactccac agaatctcga   840

tgctgtcgtt accctctaac tgtggatttt gaagcttttg gatgggattg gattattgca   900

cctaaaagat ataaggccaa ttactgctct ggagaatgtg aatttttatt tttgcaaaag   960

tatcctcata cccatcttgt gcaccaagca aaccccaaag gttcagccgg cccttgctgt  1020

actcctacaa agatgtctcc aattaatatg ctatatttta atggcaaaga acaaataata  1080

tatgggaaga ttccaggcat ggtagtagat cgctgtgggt gctcatga 1128

 

<210> 6

<211> 143

<212> PRT

<213> 藏绵羊（Ovis aries breed Tibetan）(藏绵羊MSTN重组表达蛋白质氨基酸序列)

<400> 6

MET Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His    20

MET Ala Ser MET Thr Gly Gly Gln Gln MET Gly Arg Gly Ser Asp Phe Gly Leu Asp Cys    40

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala    60

Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu    80

Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro   100

Lys Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys MET Ser Pro Ile Asn MET Leu Tyr   120

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly MET Val Val Asp Arg Cys   140

Gly Cys Ser *** 143