鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法

摘要

本发明涉及一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括：将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后经超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白；粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白，并经质谱分析得以证实。本发明还提供了按照所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。本发明的方法易于操作，所得蛋白丰度高、纯度高。

说明书

技术领域

本发明是关于一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，具体是将鼠疫 菌体经溶菌酶处理先制备粗提Pla蛋白然后采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化制备纯 化Pla蛋白的方法，本发明还涉及该方法提取纯化得到的Pla蛋白制品及其在杂交瘤株 建立与筛选中的应用。

背景技术

鼠疫菌纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator，Pla)是鼠疫菌特有的pPCP1质 粒编码的细胞膜表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌从 皮下感染扩散到循环系统的重要毒力因子(Sodeinde OA，Subrahmanyam YV，Stark K，et  al.A surface protease and the invasive character of plague[J].Science，1992，258(6)： 1004-1007；Goguen JD，Hoe NP，Subrahmanyam YVBK.Proteases and bacterial virulence：a  view from the trenches[J].Infect Agents Dis，1995，4(1)：47-54)，在鼠疫菌致病过程中发 挥重要作用。提取鼠疫菌Pla蛋白并进行纯化，可以用于鼠疫的辅助免疫学检测、鼠疫 菌的毒力等相关研究。Pla蛋白有三种形式：α-Pla、β-Pla、γ-Pla，相对分子质量(Mr) 分别为37000、35000、31000。Pla蛋白提取物常常混杂有其它蛋白，对其进行纯化是 很有必要的。

常用的对细胞膜蛋白进行提取的方法有超声破碎法、弗氏细胞压碎法、盐洗脱法、 表面活性剂提取法、尿素法等等。

石丽媛等人对Pla的分离纯化进行了研究(SDS-PAGE制备凝胶纯化鼠疫菌Pla蛋 白，医学动物防制，2008年12月第24卷第12期；鼠疫菌纤溶酶原激活因子的分离纯 化，中国地方病学杂志，2009年第28卷第4期)，分别用超声破碎、尿素提取与硫酸铵 盐析相结合的方法(简称超声法、尿素法)提取Pla，并分别用离子交换、凝胶过滤两 步层析相结合的高效液相色谱和制备电泳纯化Pla，对提取、纯化的Pla进行纤溶酶原 激活剂活性检测。其中超声法和尿素法可以提取到Pla，后者经高效液相色谱和制备电 泳可以达到基本纯化。

然而，采用尿素抽提法提取Pla蛋白时，采用透析方法难以将尿素清除干净，而其 存在会对后续的提取与纯化产生影响；该方法得到的粗提物中目的蛋白所占比例不够 高，这使得本来就较少表达的Pla蛋白，经纯化后难以得到足够的收获量。

采用制备电泳纯化Pla蛋白存在以下不足：1)该方法通过预实验获得数据，采用距 离测量的方法来定位切胶位置，存在误差；2)在制备电泳和洗脱蛋白的过程中，表面 活性剂、还原剂、加热处理、电场作用等条件，对蛋白质量产生较大影响；3)该法获 得的目的蛋白所在位置背景较深，说明有一些其它蛋白存在；4)该方法因采用电泳后 切胶再洗脱获取目的蛋白，回收率低，难以满足需要，操作繁琐。且得到的样品不具有 酶活性，仅从相对分子质量说明其为Pla蛋白。

采用高效液相色谱分离纯化Pla蛋白存在以下不足：采用离子交换纯化，大部分目 的蛋白流穿，仅小部分余留；如与凝胶过滤结合进行两步层析，可实现对Pla的纯化， 但收获量极低，需进行浓缩才能检出蛋白含量，且操作繁琐。同时，虽然三条带可占蛋 白总量80％，仅从相对分子质量及酶活性说明其是Pla，未得到进一步证实(本案发明 人在研究中曾对按该方法纯化的蛋白进行质谱分析证实，此3条带并非全为Pla蛋白)。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法， 利用简单易行的操作提取纯化得到Pla蛋白。

本发明的另一目的在于提供按照所述方法提取纯化得到的Pla蛋白。

本发明的另一目的在于提供所述纯化得到的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中 的应用。

本发明提供了一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括：

将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后经超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋 白；

粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱(CHT纯化层析柱)进行层析纯化，其中在上 样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白， 再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0)透析，去除 NaOH，得到纯化Pla蛋白。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述鼠疫菌体为鼠疫菌EV76。

根据本发明的具体实施方案，所述鼠疫菌体可以为菌粉，该菌粉可以按照常规方法 培养制备。例如，在本发明的一优选具体实施方案中，所述菌粉的制备方法包括：将鼠 疫菌接种于营养琼脂，28℃孵育48h～72h，用PBS(0.01M，pH7.2～7.4)7000～8000r/min 离心20～30min，洗涤菌体两～三次，加入4倍体积-40℃～-60℃预先低温的丙酮，充 分混匀，置-40℃～-60℃过夜后，4000r/min，10～20min离心，弃上清，再用预冷丙 酮以相同方法洗涤菌体3次，弃尽丙酮，37℃温箱过夜制成菌粉。

根据本发明的具体实施方案，是按照以下操作进行Pla蛋白的提取与纯化：

称取鼠疫菌粉，每1.5g菌粉，加入PBS(0.01M，pH7.2～7.4)60ml及溶菌酶3mg， 4℃条件下，磁力搅拌(120～180转/分)，3～4h后，菌悬液进行超声破碎，50％功率，每 次10s，间歇10s，共20min；10000～12000r/min离心20min，收集上清，加入PBS将 溶液总量补足至90ml～100ml。该过程中各试剂用量可按比例增减。

上述离心后上清进行硫酸铵沉淀：按照每100ml液体总量加入固体硫酸铵5.6g，提 取饱和度在0～10％的沉淀，并用TBS(pH8.5～9.0)充分透析至无硫酸铵，得到粗提Pla 蛋白。

根据本发明的具体实施方案，粗提Pla蛋白可进一步经10000～12000r/min、20min 离心，取上清过0.45μm滤膜，然后进行层析纯化。

根据本发明的具体实施方案，在进行层析纯化时，所述上样缓冲液为：5～10mM NaH₂PO₄，20mM Tris-Cl，0.25mM CaCl₂，pH8.5～9.0；所述洗脱缓冲液为：500mM KH₂PO₄， pH6.8。优选地，上样流速0.5～1.0ml/min，洗脱流速2.0～3.0ml/min。具体地，所述层析 纯化步骤包括：以10倍床体积的上样缓冲液平衡层析柱→上样缓冲液对倍稀释预处理 后样品上柱进行结合→以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱→以20倍床体积洗脱缓冲 液进行梯度洗脱→以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱→以5倍床体积的1N NaOH洗 脱，收集NaOH洗脱峰样品并立即以Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0)进行充分透析，得纯 化Pla蛋白。

本发明还提供了按照本发明所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。

本发明还提供了所述的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。

综上所述，本发明提供了一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该 方法的关键在于粗提时先将菌体经溶菌酶处理，再采用超声破碎法结合硫酸铵盐析；纯 化时在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目 的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后尽快用Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0) 透析，去除NaOH，以保证蛋白性状不受影响、提高目的蛋白的溶解性。用该方法初步 提取的Pla蛋白，3条目的蛋白带(在进行质谱分析鉴定之前，只能以理论上的分子量来确定Pla蛋白，本发明中发现3条这样的目的蛋白带)占蛋白总量33％，蛋白浓度为 6.4mg/ml。经纯化后，3条目的蛋白带占蛋白总量提高至80％，蛋白浓度为0.204mg/ml。 使用ABI 4700型飞行时间质谱仪采样分析鉴定，有两条带确认为Pla，占蛋白总量约 20％。在应用中，Western blot实验也表明，Pla单克隆抗体能与该两条带发生特异性结 合。本发明的方法易于操作，所得蛋白丰度高、纯度高、回收率高。

附图说明

图1为超声破碎后上清饱和硫酸铵分段沉淀样品的SDS-PAGE图形(考染)。图中， 从左至右各条带：1：0～10％；2：10～20％；3：20～30％；4：30～40％；5：40～50％；6： 50～60％；7：marker(各蛋白带分子量同图3)；8：50～60％；9：40～50％；10：30～40％； 11：20～30％；12：10～20％；13：0～10％；(1～6为超声加溶菌酶处理样品，8～13为未加 溶菌酶处理)，图中标注的37、35、31为Pla目的蛋白带。

图2为CHT柱层析纯化Pla色谱图形(紫外)。

图3为CHT柱层析纯化Pla收集样品的SDS-PAGE图形(考染)。图中，M：marker； 1：粗提Pla；2：图2中A峰；3：图2中B峰；4：图2中C峰；5：图2中D峰。

图4为粗提和纯化Pla蛋白的SDS-PAGE图形(考染)及质谱分析取样图示。图中， M：marker；1：纯化Pla；2：粗提Pla。

图5A、图5B、图5C分别为图4中蛋白点E4、E5、E9胰酶酶解肽段的MALDI-TOF 肽指纹图谱。

图6A、图6B、图6C分别为图4中蛋白点E4、E5、E9的Mascot搜库结果。

图7显示利用本发明提取纯化的Pla蛋白进行Westernblot鉴定的实验结果。图中， M：预染marker；1：15B₈杂交瘤株；2：19A₄杂交瘤株；3：14H₄杂交瘤株。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明 本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件操作。

以下各实施例中，所用原始实验材料、仪器用具及试剂均可商购获得，以下提供主 要实验材料、仪器用具及试剂的来源：

1实验菌株实验用鼠疫耶尔森氏菌株EV76由云南省地方病防治所菌种资源库提 供。将保存的EV76菌株进行复苏，取单个菌落接种LB半固体培养基，扩大培养于营 养琼脂培养基，每次传代同时进行鼠疫菌噬菌体裂解实验。

2实验仪器及用具

  仪器用具名称   生产公司   纯化仪器，AKTA explore 100   Amersham Pharmacia   CHT纯化层析柱   BIO-RAD   Mili-Q超纯水系统   Millipore   聚丙烯酰胺凝胶电泳系统   Bio-RAD Mini PROTEAN 3Cell   pH计   Orion 868   细胞超声破碎仪   宁波新芝生物科技公司JY 92-2D型   0.45μm一次性滤膜   Millipore   磁力搅拌器   上海浦江分析仪器厂   电子分析天平   Sartorius、OHAUS   普通冰箱   青岛海尔   高速离心机   BECKMAN J-25型   MALDI-TOF质谱仪 4700Proteomics Analyzer，Applied Biosystems   真空干燥机   CHRIST Alphal-4LD PLUS   扫描仪   Amersham Pharmacia biotech   电转印转膜系统   Bio-RAD Trans Blot SD

3.主要试剂及配制

1)LB培养基

加入蒸馏水1000ml，煮沸充分溶解后，分装，121℃、20min高压灭菌。

2)营养琼脂培养基

营养琼脂                500.0g

琼脂粉                  10.0g

酵母粉                  5.0g

加蒸馏水10000ml，煮沸，分装茄形瓶，121℃、20min高压灭菌。

3)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS pH7.21000ml)

磷酸氢二钠              1.15g

磷酸二氢钾              0.2g

氯化钠                  8.5g

加入适量蒸馏水溶解后调pH值至7.2，定容至1000ml。

4)SDS-PAGE电泳试剂

(1)丙烯酰胺储存溶液(100ml)

丙烯酰胺                29.0g

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺 1.0g

配制时于60ml去离子水中加入以上试剂，充分搅拌至彻底溶解，再定容至 100ml，4℃保存。由于丙烯酰胺是强神经毒素，配制时要避免气流，同时做好保护措施。

(2)分离胶缓冲液(1.5M Tris-Cl pH 8.8)

将18.2g Tris溶解于50ml去离子水中充分溶解，用浓盐酸调整pH值至8.8，再 定容至100ml，4℃保存。

(3)浓缩胶缓冲液(1M Tris-Cl pH 6.8)

将12.1g Tris溶解于80ml去离子水中充分溶解，用浓盐酸调整pH值至6.8，再 定容至100ml，4℃保存。

(4)10％SDS溶液(pH 6.8100ml)

将10g SDS溶解于80ml去离子水中，充分搅拌溶解，用浓盐酸调整pH值至6.8， 再定容至100ml，室温保存。使用前需确定是否因室温过低有SDS析出。

(5)10％过硫酸铵溶液(10％Ap)

将0.1g过硫酸铵溶解于1.0ml去离子水中，盛于棕色瓶内4℃保存。最多可储存 10天，过期需重新配制。

(6)浓缩胶(10％)

(7)分离胶(4％)

(8)5×SDS-PAGE电极缓冲液(储存液，1000ml)

Tris                15.1g

甘氨酸              94.0g

SDS                 5.0g

将以上试剂溶解于800ml去离子水中，搅拌至充分溶解，定容至1000ml后室温保 存。电泳工作液为使用时进行5倍稀释即可。

(9)5×SDS-PAGE Loading Buffer(5.0ml)

于10ml试管中混合上述试剂，用振荡器充分混匀，室温保存。

(10)考马斯亮蓝染色液(1000ml)

考马斯亮蓝R-250                1.0g

甲醇                           250ml

冰醋酸                         100ml

将以上试剂混合后定容至1000ml，室温保存。

(11)脱色液(1000ml)

冰醋酸                    100ml

甲醇                      250ml

去离子水                  850ml

5)纯化用试剂

(1)0.02M Tris-Cl缓冲液(10×)

称取Tris 24.228g，加适量双蒸水充分溶解后，用HCl调节pH至8.5，双蒸水定 容至1000ml。

(2)0.5M NaH₂PO₄缓冲液

称取NaH₂PO₄·2H₂O 39g，加双蒸水约350ml充分溶解后，用NaOH调节pH至 8.5，双蒸水定容至500ml。

(3)0.5MKH₂PO₄缓冲液

称取KH₂PO₄34g，加适量双蒸水充分溶解后，用HCl调节pH至6.8，定容至 500ml。

注：(2)(3)试剂配制完成后，以0.45μm滤膜抽滤，去除杂质、气泡。

(4)1NNaOH

称取NaOH 20g，加双蒸水定容至500ml，注意用塑料烧杯配制，边加边搅拌。

实施例1、Pla蛋白的提取、纯化及鉴定

1鼠疫菌EV76菌粉的制备

传代培养于LB平皿的鼠疫EV76菌，密集划线接种于已制备营养琼脂的茄形瓶， 28℃孵育48h，用PBS(0.01M，pH7.2)洗下菌体并7000r/min，20min离心洗涤两次， 沉淀中加入4倍体积-40℃预先低温的丙酮，充分混匀，置-40℃过夜后，4000r/min， 10min离心，弃上清，再用预冷丙酮以相同方法处理菌体3次，弃尽丙酮，37℃温箱过 夜制成菌粉。

2鼠疫菌Pla蛋白的初步提取

1)称取EV76菌粉1.5g，加入PBS(0.01M，pH7.2)60ml及溶菌酶3mg，4℃条 件下，磁力搅拌(120转/分)3～4h后，菌悬液进行超声破碎，50％功率，每次10s，间 歇10s，共20min。10000r/min离心20min，收集上清，加入适量PBS将溶液总量补足 90ml。

2)饱和硫酸铵沉淀

上述离心后上清进行硫酸铵沉淀：按照100ml总量加入固体硫酸铵5.6g，提取饱和 度在0～10％的沉淀(根据不同饱和度硫酸铵分段沉淀的结果分析，0～10％的沉淀目的蛋 白丰度相对高且杂蛋白少)。加入硫酸铵时，4℃条件下边加边磁力搅拌(150转/分)缓 慢加入，10000r/min离心20min，TBS(pH8.5)收集沉淀，并用TBS(pH8.5)充分透 析至无硫酸铵，得到粗提Pla蛋白样品。

3鼠疫菌Pla蛋白的纯化

1)样品预处理：上述硫酸铵粗提Pla蛋白样品经12000r/min、20min离心，取上清 过0.45μm滤膜，以保护层析柱。

2)上样缓冲液(Buffer A)：

5mMNaH₂PO₄，20mM Tris-Cl，0.25mM CaCl₂(pH8.5)。

3)洗脱缓冲液(Buffer B)：500mM KH₂PO₄(pH6.8)

上样流速：0.5ml/min

洗脱流速：2.5ml/min

先用洗脱缓冲液梯度洗脱后，以1N NaOH洗脱，收集NaOH洗脱样品。

4)操作流程：

以10倍床体积的Buffer A平衡层析柱→Buffer A对倍稀释预处理后样品上柱进行结 合→以5倍床体积Buffer A平衡层析柱→以20倍床体积Buffer B进行梯度洗脱→以5 倍床体积Buffer A平衡层析柱→以5倍床体积的1N NaOH洗脱，收集洗脱峰样品并立 即以Tris-Cl缓冲液(pH8.5)进行充分透析→以5倍床体积的1N NaOH清洁处理层析 柱。

4SDS-PAGE

1)电泳胶的配制：

①装配电泳制胶单元，使玻璃夹层竖立，固定以防漏胶。

②配制分离胶，混合后立即注入准备好的制胶玻璃板间隙，在其表面加入少量水或 酒精，37℃孵育约40min聚合。

③聚合完成后，倒弃表层液体，尽量用吸水纸吸干凝胶顶面的残余液体。

④配制浓缩胶，混合后立即注入制胶玻璃板间隙，插入梳子，37℃孵育约30min聚 合。

⑤聚合完成后，轻轻拔去梳子。

2)待测样品的预处理

①将待分析的蛋白样品浓度调整至约1.0mg/ml，若浓度过低，直接取原样。

②取16μl样品与4μl 5×Loading Buffer于Eppendorf管中，混匀，水浴煮沸5min， 恢复至室温。

3)上样、电泳

①将凝胶放入电泳槽中，加入电极液。

②将处理好的样品加于泳道上样孔中，10～20ul/孔，80V、25mA，至样品进入分离 胶，约20min。

③100V、25mA，运行至指示剂迁移至胶底边，停止电泳。约需80min。

④剥胶，回收电极液。

4)染色、脱色

①染色：电泳胶于染色液中振摇染色约60min，回收染色液。

②脱色：电泳胶于脱色液中振摇脱色，更换脱色液约2-3次，直至凝胶背景洁净。

5)照相、分析

用凝胶图像分析软件处理。

5Pla蛋白的质谱鉴定

1)SDS-PAGE

将粗提的Pla蛋白、经CHT柱纯化的Pla蛋白按常规方法进行SDS-PAGE，考 马斯亮蓝染色。

2)图像数字化及软件分析

考马斯亮蓝染色后，扫描胶块，采集图像信息。

3)胶内酶解

a、切胶：将下图中标记的目的蛋白小心切下，编号后放入96孔圆形板中；

b、洗胶：每孔加入100μl 25mM NH₄HCO₃(pH8.0)，置于摇床上，剧烈摇动 20min；

c、脱色：吸去上清，加入50μl含30％乙腈的0.1M NH₄HCO₃，置于摇床上，摇 动脱色，中间换液一次，至看不到颜色为止；

d、去液后，加入100μl 25mM NH₄HCO₃摇动20min，洗胶；

e、-80℃预冻1h；

f、真空干燥：-80℃取出，放于真空干燥机内冻干约1h；

g、每孔加入20μg/ml的Trypsin 3μl(Trypsin溶于pH8.025mM NH₄HCO₃)于干燥的 胶上，胶块立即吸液涨大，等完全涨大后，置于4℃冰箱30min，加入10μl 25mM NH₄HCO₃，用封口膜封紧，37℃16h；

h、离心后将反应液吸出备用，加入50％ACN/5％TFA40μl，轻微震荡萃取60min， 共进行两次；萃取液预冻抽干。

4)MALDI-TOP质谱鉴定

a)取酶解肽段溶液0.5μl与0.5μl介质(10mg/ml α-氰基-4-羟基-肉桂酸溶于70％乙 腈，1.1％三氟乙酸)混匀；

b)将样品点于靶板上，自然挥发干燥；

c)质谱分析：使用ABI 4700型飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF-MS，Applied  Biosystems，Foster City，CA，USA)采样。频率为200Hz的Nd:YAG激光器，波 长为355nm，正离子模式采样，默认校准(误差小于50ppm)。酶解之后的样 品中加入2μl蛋白溶解液(0.5％TFA+50％ACN)，采用干滴法使样品蛋白与基 质(10mg/ml)以1∶1的比例在192靶上混合，干燥后进行质谱采样。利用4000 Series Explorer^TM software version 3.0软件采集样品；从800Da到4000Da采集一 级谱图，采用interpreation从高到低采集6个母离子；

5)数据库查询

使用GPS工作站(GPS Explorer^TM v3.6，mascot v2.1)搜索NCBI的非冗余数 据库。设置可变修饰Carboxymethyl(C)、Oxidation(M)。搜索母离子偏差设为0.1Da、 MS/MS片断偏差设为0.1Da。蛋白与离子的置信区间均高于95％，且至少有两个 肽段得分大于50或一个肽段得分大于60，确认蛋白。

实验结果

Pla的纯化及SDS-PAGE

不同饱和度硫酸铵分段沉淀SDS-PAGE结果见图1。图中结果表明0～10％饱和度沉 淀目的蛋白丰度高，杂蛋白相对较少。0～10％硫酸铵沉淀粗提Pla及CHT柱层析纯化的 Pla进行SDS-PAGE，结果见图3、图4。CHT柱层析纯化紫外吸收色谱图见图2。收集 A、B、C、D 4个峰进行SDS-PAGE，结果见图3。A为穿透峰，B、C为杂蛋白，D即 为纯化Pla。

蛋白浓度测定及含量计算

采用BCA法测定蛋白浓度，粗提Pla浓度为：6.4mg/ml；纯化Pla浓度为：0.204mg/ml。

图像分析软件采用TotalLab 1.0，结果显示粗提物中可能的Pla含量约占蛋白总量的33％， 经纯化后约为80％，经质谱分析鉴定证实为Pla的蛋白约占20％。

Pla蛋白的质谱鉴定

按照图4中标记点(E2～E11)取样进行质谱分析，其中3个点(E4、E5、E9)检 测结果显示含有Pla蛋白，该3个点的质谱鉴定及肽质量指纹图谱(peptide mass  fingerprint，PMF)见表1～3及图5。

表1：蛋白点E4的肽质量指纹图谱MS-Fit检索结果

表2：蛋白点E5的肽质量指纹图谱MS-Fit检索结果

表3：蛋白点E9的肽质量指纹图谱MS-Fit检索结果

数据库查询

图4中蛋白点E4、E5、E9的Mascot搜库结果请参见图6A(E4)、图6B(E5)、 图6C(E9)。再次确认这三个蛋白点含有Pla蛋白。

实施例2、Pla蛋白在杂交瘤株建立与筛选中的应用实例

应用克隆表达的重组Pla蛋白(rPla)免疫动物，采用杂交瘤技术制备细胞系，筛 选能分泌抗鼠疫菌Pla抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，在瘤株的筛选过程中，应用 本发明实施例1提取纯化的天然Pla蛋白(nPla)作为抗原，筛选到了3株能识别天然抗原 的杂交瘤细胞株，为建立鼠疫诊断技术及开展相关研究奠定基础。

(1)间接ELISA法筛选杂交瘤株：

以rPla、nPla、rGST为包被抗原，检测融合细胞上清OD值。经棋盘测定，rPla、 nPla、rGST包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml，HRP-羊抗鼠工作浓度为1∶8000 (rGST为重组Pla蛋白的标签，免疫时未除去)。经初筛、复测、克隆化后检测，3株 阳性细胞株能稳定分泌与nPla特异性结合的单克隆抗体。

下表为克隆化后细胞上清检测结果。

3株杂交瘤各亚株细胞上清不同包被抗原OD值检测结果

(2)Western blot鉴定

将实施例1纯化的Pla蛋白进行SDS-PAGE，电转到PVDF膜，5％脱脂奶粉4℃ 封闭过夜后以纯化Pla单克隆抗体腹水为一抗、HRP-SPA为二抗进行Western blot，DAB 显色。结果如图7所示，显示3株单克隆抗体能特异性地识别提取Pla，在相应的两条 蛋白带处发生清晰显色。