B-降-3,6-二取代胆甾烷化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物，具有如式I或II中的化学结构式：其中，R为-OH、＝NOH、-OSO3Na、＝O、＝NNHC(＝S)NH2、＝NNHC(＝O)NH2、＝NOCH2Ph、＝NOCH3、＝NOCH2CH3、-OCH2CH2N(CH3)2、-OCH2CH2N(CH2CH3)2、-OCH2CH2N(CH2CH2Cl)2、-N(CH2CH2Cl)2中不同的取代基R1为＝NOH、-OSO3Na、＝NNHC(＝S)NH2、＝NNHC(＝O)NH2、＝NOCH2Ph、＝NOCH3、＝NOCH2CH3、-OCH2CH2N(CH3)2、-OCH2CH2N(CH2CH3)2、-OCH2CH2N(CH2CH2Cl)2、-N(CH2CH2Cl)2中不同的取代基。式中R与R1可以相同，也可以不同。本发明的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物，可从胆甾醇出发，经过官能团保护、臭氧化、环化、缩合、去保护、氧化、加成的化学方法转化而成。实验证明本发明的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物对多种肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可作为制备治疗癌症药物的应用。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一类B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物及其合成方法，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 

(二)背景技术

癌症是一种恶性肿瘤，是对人类健康和生活素质危害最大的疾病之一。寻找高效、高选择性和副作用小的抗肿瘤药物是药物研发的主要方向。 

在抗肿瘤药物中，1992年Merck公司上市的用于治疗前列腺增生的药物Finasteride属于甾体酰胺类化合物。近年来在抗肿瘤药物的研究中，出现了不少对甾体化合物作为抗肿瘤药物的报道，例如胆甾-4-烯-B-环内酰胺甾体化合物(Natalija M. Mira S.Bielakoviá， Synthesis of some steroidal oximes，lactams，thiolactams and their antitumoractivities，2007，steroids，72：406-414)、雄甾-B-环内酰胺类甾体化合物(Anna I.Koutsourea，Mandis A.Fthanasios Papageorgiou，George N Pairas Papagerous，George N.Pairas and Sotiris S.Nikolaropoulos.Rational design，synthesis，and in vivo evaluation of the antileukemic activity ofsix new alkylating steroidal esters，Bioorganic & Medical Chemistry，2008(16)：5207-5212)、4-烯-6-肟甾体化合物(Krstic′a，N.M.；Bjelakovic′，M.S.；Zizˇakb，Z.；Pavlovic，M.D.；Jurani′c，Z.D.；Pavlovi′c，V.D.Synthesis of some steroidal oximes，lactams，thiolactams and their antitumoractivities，2007，steroids，72：406-414)，上述的某些化合物在体外或体内对某些肿瘤细胞的生长增值具有显著抑制作用。 

我们曾提供了一类“3，6-二取代甾体肟类化合物作为抗肿瘤药物”的发明专利申请(中国发明专利，申请号：200810073497.4；公开号：CN 101245090A)，同时并做了相关报导(JianguoCui，Liliang Huang，Lei Fan，Aimin Zhou，steroids，2008，73(3)：252-256；Jian-Guo Cui，Lei Fan，Li-Liang Huang，Hong-Li Liu，Ai-Min Zhou.Steroids，2009，74(1)，62-72；Jianguo Cui，Lei Fan，Yanmin Huang，Yi Xin，Aimin Zhou，Steroids.2009，74(12)，989-995)。另外，我们也提供了一 类“6-取代-4-氮杂-A-homo-3-氧代甾体化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用”的发明专利申请(中国发明专利，申请号：201010107528.0；公开号：CN 101845075A)和另一类“3-取代-B-Homo-甾体-B-环内酰胺化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用”的发明专利申请(中国专利，申请号：201110009124.2.)，同时发表了相关报导(Yanmin Huang，SijingChen，Jianguo Cui，Chunfang Gan，Zhiping Liu，Yingliang Wei，Huachan Song.Steroids 2011，doi：10.1016/j.steroids.2011.03.009；Yanmin HUANG，Jianguo CUI，Zhengguo ZHONG，ChunfangGAN，Wenyan ZHANG，Huacan SONG，Bioorg.Med.Chem.Lett.2011，DOI：10.1016/j.bmcl.2011.04.093)。 

(三)发明内容

本发明的目的是提供一类B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物，该类化合物的合成方法及其在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。 

本发明的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物，具有下列通式： 

其中，R为-OH、＝NOH、-OSO₃Na、＝O、＝NNHC(＝S)NH₂、＝NNHC(＝O)NH₂、＝NOCH₂Ph、＝NOCH₃、＝NOCH₂CH₃、-OCH₂CH₂N(CH₃)₂、-OCH₂CH₂N(CH₂CH₃)₂、-OCH₂CH₂N(CH₂CH₂Cl)₂、-N(CH₂CH₂Cl)₂中不同的取代基 

R¹为＝NOH、-OSO₃Na、＝NNHC(＝S)NH₂、＝NNHC(＝O)NH₂、＝NOCH₂Ph、＝NOCH₃、＝NOCH₂CH₃、-OCH₂CH₂N(CH₃)₂、-OCH₂CH₂N(CH₂CH₃)₂、-OCH₂CH₂N(CH₂CH₂Cl)₂、-N(CH₂CH₂Cl)₂中不同的取代基。 

式中R与R¹可以相同，也可以不同。 

本发明的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物，可从胆甾醇出发，经过官能团保护、臭氧化、环化、缩合、去保护、氧化、加成的化学方法转化而成。 

制备本发明B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物中的下述某些化合物的反应式如下所示： 

B-降-3，5-二羟基-6-取代胆甾烷的制备路线 

从上述化合物4出发，与不同的试剂(如盐酸羟胺、氨基硫脲、氨基脲、氨基甲醚、氨基苄醚等)反应，或者将4中的6-位醛基还原后再进行反应，或者进一步将4中的3-位羟基进行官能团转换，可以得到通式I中所列不同的产物。 

B-降-3β-羟基-6-取代胆甾-5-烯的制备路线 

从上述化合物11出发，与不同的试剂(如盐酸羟胺、氨基硫脲、氨基脲、氨基甲醚、氨基苄醚等)进行缩合反应，或者将13中的6-位羟基进行官能团转换，或者进一步将11中的3-位羟基进行官能团转换，可以得到通式II中所列不同的产物。 

通过体外抑制癌细胞生长增值活性试验表明，本发明的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物对多种肿瘤细胞株如肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌等癌症细胞株具有显著的抑制作用。因此，本发明的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物可用于制备治疗癌症的药物。 

本发明还提供一种用于抗肿瘤的药物，其含有上述B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物以及药学上可接受的辅助剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂的形式使用，其给药途径可为口服，或经皮下、静脉或肌肉注射。 

(四)具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1 

B-降-3，5-二羟基-6-羟亚胺基胆甾烷(6)的制备 

步骤1：中间产物(2)的制备 

5.018g(13mmol)胆固醇溶于40mL吡啶中，溶解完全后，慢慢滴加4.0mL乙酸酐，乙酸酐加完后，继续搅拌0.5小时，然后将反应物于室温下静置24小时。加蒸馏水15mL，用10mL×3乙酸乙酯萃取，再分别用1N稀盐酸洗，饱和NaHCO₃洗，水洗2次，最后用饱和 食盐水洗至中性。无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，当有较大量固体析出时，停止蒸馏，加热溶解所析出的固体，静置让其析出结晶。抽滤并干燥后得到白色片状晶体25.308g，产率96％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

步骤2：中间产物(3)的制备 

110mg化合物2装入反应瓶中，加入16mL二氯甲烷和4mL甲醇。置于液氮冷却的乙酸乙酯保温瓶中，待体系温度冷却到-78℃时，通入富含有O₃的氧气流，反应完成后，加入2mL二甲硫醚，升温至室温搅拌过夜。减压抽除大部分溶剂得到油状物，该油状物用50mL二氯甲烷溶解，加入10mL蒸馏水分层，分出有机层用无水硫酸钠干燥。减压抽除溶剂，得到无色透明的油状物，干燥。快速柱层析分离(洗脱剂：V_石油醚∶V_乙酸乙酯＝4∶1)得到油状化合物3108mg，产率91％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

步骤3：中间产物(4)的制备 

盛有478mg化合物3的100mL圆底烧瓶中加入22mL苯及中性氧化铝4.78g，室温下搅拌反应24小时，TLC跟踪反应，没有原料点后停止反应，将该混合物倾入硅胶短柱中，用大量的CH₂Cl₂冲洗，直至无产物点，抽除溶剂得到透明油状物445mg。硅胶柱层析分离得到白色固体化合物4 377mg，产率85％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

步骤4：中间产物(5)的制备 

184mg(0.4mmol)化合物4置于反应瓶中，加入15mL 95％的乙醇，在60℃的水浴条件下搅拌溶解，加入55mg的三水乙酸钠，溶解后一次性加入32mg盐酸羟胺。TLC跟踪反应，无原料点即停止反应，减压蒸除大部分的乙醇，加入少许蒸馏水，出现白色固体。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。柱层析分离得到纯化合物5166mg，产率87.4％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

步骤5：产物(6)的制备 

117mg化合物5溶于10mL的KOH/CH₃OH(5∶95)中，在室温下搅拌反应，TLC跟踪反应至无原料点后停止反应。减压蒸去溶剂得到白色固体，加入10mL的冰水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层后用水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂得到油状物。柱层析分离得到白色固体产物683mg，产率78％。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。 

实施例2 

B-降-3β-乙酰氧基-5-羟基-6-缩氨硫酰腙基胆甾烷(7)的制备 

114mg(0.248mmol)化合物4置于100mL反应瓶中，加入15mL无水乙醇，在60℃的 水浴条件下搅拌溶解，滴入2-3滴冰醋酸控制溶液pH≈4，随后一次性加入52mg硫代氨基脲。TLC跟踪反应至无原料点即停止反应，减压蒸除大部分乙醇，得到油状物。柱层析分离得到固体产物7120mg，产率91％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例3 

B-降-3，5-二羟基-6-缩氨硫酰腙基胆甾烷(8)的制备 

63mg化合物7溶于8mL的KOH/CH₃OH(5∶95)中，室温下搅拌反应(20℃)，TLC跟踪反应至无原料点停止反应。减压抽除溶剂得到白色固体，加入8mL的冰水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层后用水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去溶剂得到油状物。柱层析分离得到白色固体化合物853mg，产率91％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例4 

B-降-3β-乙酰氧基-5-羟基-6-腙基胆甾烷(9)的制备 

115mg(0.25mmol)化合物4置于50mL反应瓶中，加入15mL无水乙醇，在65℃的油浴条件下搅拌溶解，滴入2滴冰醋酸控制溶液pH≈4，随后一次性加入25μL水合肼(80％)。TLC跟踪反应至无原料点停止反应，减压蒸除大部分乙醇，得到油状物。然后加入少许蒸馏水，用乙酸乙酯萃取3次(10mL*3)，合并有机层，水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去溶剂，得到白色固体物质。该粗产物经柱层析分离得到纯化合物996mg，产率78％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例5 

B-降-3，5-二羟基-6-腙基胆甾烷(10)的制备 

66mg(0.14mmol)化合物9溶于8mL的KOH/CH₃OH(5∶95)中，在室温下搅拌反应(20℃)，TLC跟踪反应至无原料点停止反应。减压抽除溶剂得到白色固体，加入8mL的冰水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层后用水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去溶剂得到油状物。柱层析分离得到淡黄色固体化合物1050mg，产率：83％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例6 

B-降-3β-羟基-6-羟亚胺基胆甾-5-烯(12)的制备 

步骤1：中间产物(11)的制备 

460mg(0.4mmol)化合物4溶于15mL的KOH/CH₃OH(5∶95)中，在45℃水浴条件下搅 拌反应，TLC跟踪反应至无原料点后停止反应。减压抽除溶剂得到黄色油状物，加入8mL冰水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层后用水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去溶剂得到油状物。柱层析分离得到油状化合物11284mg，产率87.4％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

步骤2：产物(12)的制备 

106mg(0.25mmol)化合物11置于50mL反应瓶中，加入15mL 95％的乙醇，在60℃水浴条件下搅拌溶解，加入35mg三水乙酸钠，溶解后一次性加入22mg(0.30mmol)盐酸羟胺。TLC跟踪反应，无原料点即停止反应，减压蒸除大部分的乙醇，得到淡黄色固体。加入少许蒸馏水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。柱层析分离得到淡黄色固体产物1290mg，产率82.0％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例7 

B-降-3，6-二羟基胆甾-5-烯(13)的制备 

418mg(0.9mmol)化合物11溶于20mL CH₃OH中，在室温下搅拌溶解后一次性加入硼氢化钠44mg，TLC跟踪反应至无原料点停止反应。减压抽除溶剂得到白色固体。用CH₂Cl₂溶解该固体，60-100目硅胶拌样，柱层析分离(洗脱剂：V_石油醚∶V_乙酸乙酯＝2∶1)得到白色固体13314mg，产率78％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例8 

B-降-3β-羟基-5-烯-6-缩氨硫酰腙基胆甾烷(14)的制备 

160mg(0.38mmol)化合物11置于100mL反应瓶中，加入15mL无水乙醇，在70℃油浴下搅拌溶解，滴入2滴冰醋酸控制溶液pH≈4，一次性加入86mg硫代氨基脲。TLC跟踪反应(V_石油醚∶V_乙酸乙酯＝2∶1)至无原料点停止反应，减压蒸除大部分乙醇，得到白色固体。柱层析分离得到固体产物14143mg，产率76％。产物结构经IR、NMR和MS分析确定。 

实施例9 

本实施例是采用本发明所述的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物对某些肿瘤细胞进行抑制肿瘤细胞生长增值活性试验的测试结果。 

选择本发明的部分B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物试验其对人肝癌细胞株(7404)，胃癌细胞株(7901)的细胞毒性。采用MTT方法，进行体外细胞毒性测定。在96孔板中培养的对数生长期细胞中加入不同浓度的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物，同时进行3个平行试验，与对照组进行比较。培养72小时后，加入MTT，测定其吸光度，分别计算抑制肿瘤细胞生 长增值到50％时化合物的浓度，以IC₅₀值表示，结果如表1所示： 

表1B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物抗肿瘤活性测试结果(MTT方法，IC₅₀，μmol/L) 

从表1中所列化合物对人体肝癌细胞、胃癌细胞抑制作用的IC₅₀值可以看出，本发明所述的B-降-3，6-二取代胆甾烷化合物对此2种肿瘤细胞具有很好的抑制作用，如化合物8对人肝癌细胞株(7404)的抑制IC₅₀值为8.6μmol/L，对胃癌细胞株(7901)的抑制IC₅₀值为8.4μmol/L。