一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫疫苗表达载体及其应用

摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及一种血吸虫疫苗沙门氏菌分泌表达载体，该表达载体是由细菌启动子控制的、沙门氏菌分泌效应蛋白及其分泌信号引导的、分泌表达血吸虫抗原的重组沙门氏菌表达载体。该血吸虫疫苗沙门氏菌分泌表达载体能够在抗原递呈细胞内乏氧微环境下诱导分泌表达血吸虫疫苗，能够在体内稳定、持续地存在，表达载体不发生丢失。该血吸虫疫苗沙门氏菌分泌表达载体通过减毒细菌株作为递送载体，能够采用口服方法进行重组疫苗递呈细菌的抗原投递。该血吸虫疫苗沙门氏菌分泌表达载体能够制备血吸虫口服疫苗，用于血吸虫病的防治。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫疫苗表达载体及其应用。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类及家畜健康的人畜共患寄生虫病，全球约6亿人生活在血吸虫疫区，2亿人受感染，1.2亿人出现临床症状，年死亡人数多达数十万。自研究出特效药吡喹酮后，通过群体化疗，对血吸虫病的流行已有所缓解，但是血吸虫病的传播仍然在持续，患病人数依然在增加。而且吡喹酮等化学药物的耐药性也在很大程度上影响了血吸虫病的防治（McManus DP，Clin Microbiol Rev，2008，21(1):225-242）。因此，为了更好的防治血吸虫病的传播和流行，急切需要开发一种高效、安全、价廉的血吸虫疫苗。

血吸虫疫苗研究先后经历了死疫苗、灭活或致弱疫苗、重组疫苗和核酸疫苗等阶段。虽然灭活疫苗显示了较高的保护力，但是其风险高；死疫苗、重组疫苗和核酸疫苗却面临着保护力不高，造价昂贵，接种不便等等问题。口服抗原递呈系统因其具有接种简单，价格便宜的优点，被广泛地应用于多种感染性疾病疫苗开发。活性减毒的沙门氏菌是一种理想的口服疫苗载体，其可通过口服途径，将外源抗原分子输送到抗原递呈细胞（APC）中，并通过组织相容性复合体递呈给T细胞，激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答。

Khan CM首次尝试利用沙门氏菌减毒株SL3261表达曼氏血吸虫28kd GST抗原，口服免疫小鼠后，在血清中检测到了针对GST抗原的抗体（Khan CM，Proc Natl Acad Sci. 1994，91(23):11261-11265）；Pacheco LG等利用减毒沙门氏菌SL3261表达曼氏血吸虫14 kd 脂肪酸结果蛋白，口服小鼠后获得了34.9%的减虫率（Acta Trop. 2005，95(2):132-142）。但是沙门氏菌一旦进入抗原递呈细胞后，便被限制在一种膜包裹的囊泡（Salmonella containing vacuole, SCV）之中（Zhang XL等，Cell Mol Immunol. 2008，5(2):91-97）。这种膜包裹的囊泡结构在很大程度上限制了抗原的有效递呈。因此，为了打破这个限制，开发一种高效的以口服减毒沙门氏菌为载体的血吸虫疫苗，需要面临抗原分子的分泌问题。

    因此，要建立一个高效的减毒沙门氏菌分泌表达日本血吸虫口服疫苗系统，必须构建一个高效的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的分泌表达，这是本发明要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的问题是建立一个高效的减毒沙门氏菌分泌表达日本血吸虫口服疫苗系统，构建一种高效的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的分泌表达。

本发明的主要目的是构建高效的沙门氏菌分泌表达载体，实现抗原分子在体内稳定持续的分泌表达，为建立表达稳定、保护性效率高的以减毒沙门氏菌为运输载体的日本血吸虫口服疫苗奠定基础。

为了达到上述目的，本发明利用Ⅲ型分泌系统和溶血素分泌系统对血吸虫抗原分子进行分泌，将Ⅲ型分泌信号和溶血素分泌信号与抗原分子融合来实现对包括日本血吸虫在内的抗原的分泌，所述的Ⅲ型分泌信号可以为沙门氏菌外膜蛋白E N端1-104氨基酸序列等原核细菌Ⅲ型分泌效应蛋白的分泌信号序列；所述的溶血素分泌信号为hlyA 蛋白N端34个氨基酸和C端61个氨基酸序列；所述的抗原分子为sj23LHD-GST双价抗原等疫苗抗原。

进一步地，本发明提供了一种血吸虫口服疫苗递呈系统，其特征是以减毒沙门氏菌为口服疫苗输送载体，以分泌表达的方式递呈日本血吸虫抗原分子，所述的减毒细菌株可以是减毒沙门氏菌VNP20009。

进一步地，本发明提供了一种稳定的以减毒沙门氏菌为载体的日本血吸虫分泌表达口服疫苗，质粒在体内表达稳定，不丢失。

与现有的血吸虫疫苗相比，本发明的特色和创新之处在于：

（1）发明了一种利用沙门氏菌分泌表达信号指导日本血吸虫疫苗抗原表达载体，实现了日本血吸虫双价抗原的分泌表达，并在小鼠模型证实利用该系统，可以实现肝脏减虫率达到41.69%，肝脏减卵率为57.71%。

（2）发明了一种口服形式的沙门氏菌介导的日本血吸虫疫苗，并在动物感染模型等证实口服该疫苗能够获得较高的针对抗原分子的体液免疫与细胞免疫反应。

（3）发明了一种成本低廉的日本血吸虫疫苗，本发明由于发明了一种高效表达、高效分泌的日本血吸虫疫苗抗原表达载体，再加上利用方便培养的沙门氏菌作为抗原表达工厂和递呈工具，具有大规模推广的应用前景。

综上所述，本发明提供了一种全新的、高效的、安全的、低廉的、方便的、口服的，可用于人和动物的日本血吸虫疫苗分泌表达载体及其应用。

四、附图说明

图一、减毒沙门氏菌分泌表达载体的构建

（1A）血吸虫抗原sj23LHDGST（sj23分子的大亲水区与GST融合蛋白）分泌表达载体的构建示意图。构建了两种分泌系统。1、Ⅲ型分泌表达系统；2、溶血素分泌表达系统。pnirB和phlyA分别为亚硝酸盐还原酶启动子和溶血素基因A（hlyA）启动子；sopE1-104为沙门氏菌Ⅲ型分泌系统分泌信号；hlyA为溶血素分泌信号，hlyB、hlyC、hlyD为溶血素分泌系统所需元件。 

（1B）Western bolting 验证分泌表达的重组沙门氏菌分泌表达抗原分子至培养液上清中的情况。1、空载细菌；2、重组溶血素分泌菌；3、重组Ⅲ型分泌菌正常培养；4、重组Ⅲ型分泌菌厌氧培养。Ⅲ型分泌菌由厌氧调控的nirB启动子表达抗原，其表达需要乏氧环境进行诱导。

（1C）分泌表达的重组沙门氏菌感染在抗原递呈细胞（小鼠巨噬细胞系RAW264.7）后，将模拟抗原EGFP递呈给巨噬细胞的表达情况。DAPI染色表示细胞核，1、空载菌；2、重组Ⅲ型分泌菌；3、重组溶血素分泌菌。

图二、分泌表达的重组减毒沙门氏菌血吸虫疫苗在体内滴度与持续时间

（2A）BALB/C小鼠口服10⁹菌落形成单位（cfu）分泌表达的重组疫苗株和野生菌后3-20天中，重组菌在外周免疫器官脾脏中的滴度。1、野生菌（非转化沙门氏菌），代表总菌数；2、重组溶血素分泌菌；3、重组Ⅲ型分泌菌。分泌表达的重组沙门氏菌在脾脏中持续存在，疫苗质粒没有丢失。

（2B）BALB/C小鼠口服10⁹cfu分泌表达的重组沙门氏菌和野生菌后3-20天中，重组菌在外周免疫器官淋巴结中的滴度。1、野生菌（非转化沙门氏菌），代表总菌数；2、重组溶血素分泌菌；3、重组Ⅲ型分泌菌。分泌表达的重组沙门氏菌在淋巴结中持续存在，疫苗质粒没有丢失。

图三、BALB/C小鼠口服接种分泌表达的重组疫苗菌后机体产生的针对抗原分子sj23LHDGST的免疫反应。

（3A）小鼠口服空载菌、重组Ⅲ型分泌菌和重组溶血素分泌菌三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取血清，分析血清中抗sj23LHDGST抗原的IgG抗体效价。1、空载菌；2、重组Ⅲ型分泌菌；3、重组溶血素分泌菌。

（3B）小鼠口服免疫PBS、空载菌、重组溶血素分泌菌和重组Ⅲ型分泌菌（10⁹cfu）三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取脾脏，经过红细胞裂解后，制备脾细胞悬液，然后分别用重组抗原sj23LHD、GST，以及阳性对照ConA刺激72小时，分析脾细胞分泌IFN-γ量。1、PBS；2、空载细菌；3、重组溶血素分泌菌；4、重组Ⅲ型分泌菌。

图四、小鼠口服免疫分泌表达的重组血吸虫疫苗菌后腹部皮下感染日本血吸虫42天后保护性效率分析。

（4A）BALB/C小鼠口服免疫PBS、空载细菌、重组溶血素分泌菌和重组Ⅲ型分泌菌（10⁹cfu）三次，间隔两周一次，末次免疫后一周，腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40只，感染后42天计算小鼠体内成虫数。1、PBS；2、空载细菌；3、重组溶血素分泌菌；4、重组Ⅲ型分泌菌。

（4B）减虫率=（对照组平均每鼠的成虫数-实验组平均每鼠成虫数）/对照组平均每鼠的成虫数×100%。1、空载细菌；2、重组溶血素分泌菌；3、重组Ⅲ型分泌菌。

（4C）利用5%氢氧化钾（KOH）消化肝脏过夜的方法，计算肝脏虫卵数。1、PBS；2、空载细菌；3、重组溶血素分泌菌；4、重组Ⅲ型分泌菌。

（4D）减卵率=（对照组平均每鼠肝脏虫卵数-实验组平均每鼠肝脏虫卵数）/对照组平均每鼠肝脏虫卵数×100%。1、空载细菌；2、重组溶血素分泌菌；3、重组Ⅲ型分泌菌。

五、具体实施方式：

以日本血吸虫双价抗原sj23LHDGST（sj23分子的大亲水区与GST融合蛋白）做为投递抗原为实施例：

1、 分泌表达的疫苗载体的构建：

抗原分子sj23LHD-GST分别采用沙门氏菌Ⅲ型分泌系统和溶血素分泌系统进行分泌。

a）Ⅲ型分泌表达载体的构建： 通过Ⅲ型分泌效应分子sopE N端1-104个氨基酸(sopE_1-104) 与抗原分子sj23LHD偶联来实现其分泌；采用大肠杆菌硝酸盐还原酶（nirB）启动子对Ⅲ型分泌抗原进行表达。nirB启动子利用PCR方法获得：引物序列为：P1：5’-cccctcgagggttaccggcccgatcg-3’；P2：5’-cccggatccaccgcctaccttaacgattc-3’；以50 ng大肠杆菌基因组DNA做为模板。得到的片段两端带有XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，PCR程序都为94℃ 40 s,60℃ 40 s，72℃ 1 min，26个循环。沙门氏菌Ⅲ型分泌系统分泌信号即sopE蛋白1-104氨基酸序列基因的扩增：引物序列为：P1: 5’-cccggatccatgactaacataacactatc-3’；P2: 5’-aaaggtacccggatctttactcgcat-3’；所得到的sopE1-104基因两端分别带有BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点，PCR程序都为94℃ 40 s,60℃ 40 s，72℃ 1 min，26个循环。双价疫苗基因sj23LHDGST的获得：采用重叠PCR方法扩增得到sj23LHDGST基因，引物序列为：P1: 5‘-aaaggtaccatgtacaaggataaaatcgatg-3’；P2: 5’-taagttgcgttttaagaatgctagtataggggacat-3’；P3: 5’-ttcttaaaacgcaacttaatgtcccctatactaggt-3’；P4：5’-cccaagcttttattttggaggatggtcgc-3’；具有方法如下：先分别以P1和P2，P3和P4为引物以pcDNA3.1-sj23和pcDNA3.1-GST为模板，扩增出sj23LHD片段与GST片段；然后以P1和P4为引物，以扩展的sj23LHD片段与GST片段为模板得到sj23LHDGST双价疫苗基因，所扩增的sj23LHDGST基因两端分别带有KpnⅠ和HindⅢ酶切位点。PCR程序都为94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min， 26个循环。启动子-分泌信号-抗原基因的连接：选用低拷贝表达载体pQE30，首先将nirB启动子连入pQE30载体的XhoⅠ和BamHⅠ之间；其次将分泌信号sopE_1-104插入BamHⅠ和KpnⅠ位点之间；然后将双价疫苗抗原基因sj23LHDGST基因插入KpnⅠ与HindⅢ位点之间。经过转化、鉴定、测序后得到了Ⅲ型分泌表达载体nirB-sopE_1-104-sj23LHDGST。其中的酶切程序为：20微升反应体系，37℃，3个小时；连接程序为：10微升反应体系，室温，5个小时。

b）溶血素分泌系统投递疫苗抗原载体的构建：利用溶血素分泌表达载体pMohly1来实现抗原的溶血素分泌表达，该载体含有溶血素分泌系统所必须的所有元件以及分泌信号，并采用效应分子hlyA的原始启动子进行表达。将sj23LHDGST基因连入pMohly1单酶切位点NsiⅠ中，并与上下阅读框一致；用于扩增sj23LHDGST基因的引物序列为：P1: 5’-ccaatgcatcgtacaaggataaaatcg-3’；P2: 5’-ccaatgcatcttttggaggatggtcgc-3’；扩增PCR程序为94℃ 40 s，60℃ 40 s，72 1 min 26个循环。然后对扩增产物以及载体pMohly1进行NsiⅠ酶切，酶切反应体系20微升，37℃，3个小时；对酶切产物进行回收后，载体用碱性磷酸酶进行去磷酸，反应体系为20微升，37℃，3个小时；最后将载体与片段进行连接，反应体系为10微升，室温5个小时。经过转化、鉴定、测序后得到溶血素分泌载体pMohly1-sj23LHDGST。

2、 重组减毒沙门氏菌的电穿孔转化：

    沙门氏菌电转感受态的制备：接种新鲜减毒沙门氏菌到200 ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD值在0.4-0.6之间，离心6000g×5 min收集菌体，用无菌双蒸水洗涤菌体一遍，离心6000 g×5 min，用10%甘油的洗涤菌体二遍，离心6000 g×5 min，用500微升10%甘油重悬，分装50微升/管，用于电转。

采用电穿孔方法将重组疫苗DNA载体转化到减毒沙门氏菌VNP20009内：在无菌条件下，将0.5-5 μg 构建好的重组载体（Ⅲ型分泌或溶血素分泌）加入在电转感受态中，混匀后，转移到0.2 μM的电转杯中，用于电击，电转条件为1.8 KV，500 Ω，2 μF，电转后涂氨苄平板筛选，长出的菌落即为重组菌。

3、免疫程序及方法：

6-8周龄雌性小鼠BALB/C按照每组20只进行分组，每只小鼠口服1×10⁹ cfu细菌剂量接种空载细菌组、重组Ⅲ型分泌组、重组溶血素分泌组，自然对照组口服0.2 ml PBS。口服免疫三次，间隔两周一次，第三次后一周进行血吸虫感染。

4、重组疫苗菌在体内的滴度检测：

BALB/C小鼠口服10⁹cfu重组Ⅲ型分泌菌、重组溶血素分泌菌以及没有转化的野生减毒沙门氏菌，分别在3天、10天、20天取脾脏和肠系膜淋巴结，称重，按照5：1（PBS体积：脏器质量）的比例加入PBS进行匀浆，然后将匀浆液进行梯度稀释，涂于氨苄平板，根据长出来的菌落数与脏器质量计算脏器中重组菌的滴度，非转化野生减毒沙门氏菌涂正常没有抗性的LB平板，以此计算总菌数。

5、sj23LHDGST抗体检测：

免疫血清的制备：BALB/C小鼠按照上述的免疫程序接种细菌疫苗，末次免疫后一周，尾静脉采血，室温静置2-4小时后，5000 rpm离心5分钟，收集血清；

sj23LHDGST抗原的包被：利用50 mM，pH9.6的碳酸盐缓冲液按照10 μg/ml稀释抗原，每孔滴加100 μl，4度包被过夜，PBST洗三次（5分钟一次）后用于检测。

ELISA测定抗体滴度：包被板每孔采用200 μl 3%的BSA在37度封闭3个小时，经PBST洗三次（5分钟一次），然后用100 μl PBS将血清梯度稀释50倍加入孔中，37℃反应1-2个小时，PBST洗三次（5分钟一次），加入HRP（辣根过氧化物酶）偶联的羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1个小时，PBST洗三次（5分钟一次），加入TMB底物显色，2 M浓硫酸终止，测定450 nM吸收光。

6、IFN-γ检测：

末次免疫一周后，每组取三只小鼠脾脏，无菌条件下制成单细胞悬液，红细胞裂解后用10%胎牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为2×106/ml，按照每孔100微升加入到96孔板中，分别用10微克/毫升sj23LHD、10微克/毫升GST、10微克/毫升Con A进行刺激72小时，收集细胞培养上清，采用IFN-γ ELISA试剂盒，按照说明书，进行测量IFN-γ含量

7、免疫保护作用观察：

末次免疫后一周，每只小鼠经腹部皮肤感染40±2 条日本血吸虫尾蚴，感染后 6 周剖杀, 用灌注法收集成虫计算虫荷均数；称取肝脏 0.5 g, 加 10 ml5% KOH, 37 ℃消化 5 h 后取 0.1 ml 涂片，在显微镜下计数, 即每克肝组织虫卵数( EPG)，以减虫率和每克肝减卵率评价各组质粒免疫保护力。计算公式如下：减虫率(%)=[(对照组虫荷均数- 实验组虫荷均数) /对照组虫荷均数]×100%；减卵率(%)=[(对照组EPG-实验组EPG)/对照组 EPG]×100%。

本发明实施例利用安全的减毒沙门氏菌VNP20009为载体，采用两种分泌系统对日本血吸虫双价抗原sj23LHD-GST进行分泌表达：Ⅲ型分泌系统（图1A：1）和溶血素分泌系统（图1A：2）。利用电转化的方法转化减毒沙门氏菌后，得到重组Ⅲ型分泌菌、重组溶血素分泌菌以及转化空载质粒的空载菌，采用western bloting技术检测了各重组菌对抗原的分泌情况，结果显示在空载菌的培养液上清中没有检测到sj23LHD-GST抗原（图1B：1）；在重组溶血素分泌菌培养液上清（图1B：2）和重组Ⅲ型分泌菌厌氧培养上清中（图1B：4）均可以检测到抗原；因为Ⅲ型分泌系统采用的是乏氧调控的nirB启动子，因此在重组Ⅲ型分泌菌有氧培养上清中没有检测到抗原（图1B：3）。为了更进一步地证明重组菌在抗原递呈细胞-巨噬细胞里的抗原输送情况，本发明采用EGFP（绿色荧光蛋白）作为模拟抗原，当携带EGFP的各重组菌在体外感染巨噬细胞系RAW264.7后，感染空载菌后，巨噬细胞胞内没有观察到荧光（图1C：1）；感染重组Ⅲ型分泌菌（图1C：2）和重组溶血素分泌菌（图1C：3）后，在巨噬细胞胞内均能检测到荧光。

为了评价各重组菌的质粒稳定性，各重组菌和野生性未转化菌按照1×10⁹cfu/只的剂量口服接种5-7周龄的Balb/C小鼠。在接种后3、10、20天分离外周免疫器官脾脏和淋巴结，计算各重组菌在器官中的滴度。在脾脏中，相对于野生菌（图2A：1），重组溶血素分泌菌（图2A：2）和重组Ⅲ型分泌菌（图2A：3）在各时间点滴度均没有明显减少；同样在淋巴结中也是如此，相对于野生菌（图2B：1），重组溶血素分泌菌（图2B：2）和重组Ⅲ型分泌菌（图2B：3）在各时间点滴度均没有明显减少。

本发明进一步评价了各口服各重组疫苗菌后产生的针对抗原分子的免疫反应。小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取血清，评价血清中抗sj23LHD-GST的抗体产生。相对于空载菌（图3A：1），重组Ⅲ型分泌菌（图3A：2）和重组溶血素分泌菌（图3A：3）都能产生针对抗原分子特异的抗体，其中重组Ⅲ型分泌菌（图3A：2）抗体效价最高。由于以沙门氏菌为载体的口服疫苗主要诱导机体产生Th1反应，所以本发明还分别用重组sj23LHD，重组GST，以及阳性对照药物Con A刺激免疫小鼠脾细胞，分析脾细胞分泌细胞因子IFN-γ的产生，与PBS免疫（图3B：1）和空载菌（图3B：2）免疫相比，重组溶血素分泌菌（图3B：3）和重组Ⅲ型分泌菌（图3B：4）免疫小鼠脾细胞都能产生较高的IFN-γ，相比重组溶血素分泌菌（图3B：3），重组Ⅲ型分泌菌（图3B：4）免疫小鼠产生的IFN-γ更高。

本发明还进一步评价了口服各重组菌对血吸虫感染的保护力：小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌三次，间隔两周一次，末次免疫后一周腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40只，感染后42天计算小鼠体内成虫数，减虫率，肝脏虫卵数，减卵率。免疫PBS小鼠成虫数为30±3只（图4A：1）和空载菌成虫数为26±3只（图4A：2），重组溶血素分泌菌成虫数为20±3只（图4A：3），重组Ⅲ型分泌菌成虫数为17±3只（图4A：4）；相对于PBS免疫，空载菌的减虫率为14.98%（图4B：1），重组溶血素分泌菌的减虫率32.93%（图4B：2），重组Ⅲ型分泌菌的减虫率为41.69%（图4B：3）；免疫PBS小鼠肝脏虫卵数为122699±34214（图4C：1），空载菌肝脏虫卵数为100398±21669（图4C：2），重组溶血素分泌菌肝脏虫卵数为73058±25481（图4C：3），重组Ⅲ型分泌菌肝脏虫卵数为51889±12888（图4C：4）；相对于PBS免疫，空载菌的减卵率为18.17%（图4D：1），重组溶血素分泌菌减卵率为40.46%（图4D：2），重组Ⅲ型分泌菌减卵率为57.71%（图4D：3）。

综上所述，本发明提供了一种利用减毒沙门氏菌分泌系统表达的日本血吸虫口服疫苗及其应用，该血吸虫疫苗口服疫苗以减毒沙门氏菌为载体，通过分泌表达疫苗抗原的方式突破囊泡结构对于抗原递呈的限制。本发明所述的分泌表达的减毒沙门氏菌口服疫苗递呈系统在抗原递呈细胞中能有效地表达和递呈抗原，并具有较好的体内稳定性。该疫苗递呈系统能激活机体产生针对抗原分子的免疫反应，获得良好的保护性效率。

    以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> OrganizationName : 南京大学

 

<120> Title : 一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫口服疫苗以及应用

 

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      SequenceDescription :Ⅰ型分泌信号hlyN

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      SequenceDescription : Ⅰ型分泌信号hlyC

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taa                                                                   183

 

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      SequenceDescription : nirB 启动子

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<400> PreSequenceString :

tacaaggata aaatcgatga cgaaattaat acactaatga ctggtgctct ggaaaatcca      60

aacgaggaaa taacggcaac catggataag atacaaacat cattccattg ttgtggagtc     120

aaaggtccag acgattataa agggaatgtg ccagcatcat gtaaagaagg gcaagaagtt     180

tatgttcagg gttgtctatc tgtctttagt gcattcttaa aacgcaactt aatgtcccct     240

atactaggtt attggaaaat taagggcctt gtgcaaccca ctcgacttct tttggaatat     300

cttgaagaaa aatatgaaga atggcatttg tatgagcgcg atgaaggtga taaatggcga     360

aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat tgatggtgat     420

gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca caacatgttg     480

ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt tttggatatt     540

agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa agttgatttt     600

cttagcaagc tacctgaaat gctgaaaatg ttcgaagatc gtttatgtca taaaacatat     660

ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct tgatgttgtt     720

ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt taaaaaacgt     780

attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat agcatggcct     840

ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaata a              891

 

<210> 6

<211> Length : 29

      SequenceName : 6

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌信号sopE P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccggatcca tgactaacat aacactatc                                        29

 

<210> 7

<211> Length : 26

      SequenceName : 7

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌信号sopE P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

aaaggtaccc ggatctttac tcgcat                                           26

 

<210> 8

<211> Length : 26

      SequenceName : 8

      SequenceDescription : nirB P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccctcgagg gttaccggcc cgatcg                                           26

 

<210> 9

<211> Length : 29

      SequenceName : 9

      SequenceDescription : nirB P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccggatcca ccgcctacct taacgattc                                        29

 

<210> 10

<211> Length : 31

      SequenceName : 10

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

aaaggtacca tgtacaagga taaaatcgat g                                     31

 

<210> 11

<211> Length : 36

      SequenceName : 11

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

taagttgcgt tttaagaatg ctagtatagg ggacat                                36

 

<210> 12

<211> Length : 36

      SequenceName : 12

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P3

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

ttcttaaaac gcaacttaat gtcccctata ctaggt                                36

 

<210> 13

<211> Length : 29

      SequenceName : 13

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P4

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccaagcttt tattttggag gatggtcgc                                        29

 

<210> 14

<211> Length : 27

      SequenceName : 14

      SequenceDescription : Ⅰ型分泌si23LHD-GST P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

ccaatgcatc gtacaaggat aaaatcg                                          27

 

<210> 15

<211> Length : 27

      SequenceName : 15

      SequenceDescription : Ⅰ型分泌si23LHD-GST P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

ccaatgcatc ttttggagga tggtcgc                                          27

 

 

 <110> OrganizationName : 南京大学

 

<120> Title : 一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫口服疫苗以及应用

 

<160> 14

 

<210> 1

<211> Length : 312

      SequenceName : 1

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌信号sopE

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Salmonella typhimurium

<400> PreSequenceString :

atgactaaca taacactatc cacccagcac tacagaatcc atagaagtga cgttgaacca      60

gtaaaagaaa aaacaacgga gaaggacatt tttgcaaaaa gtattactgc cgttagaaat     120

agctttatca gcctgtcgac gagtctgtca gatcgtttta gcctgcatca acaaacagac     180

ataccgacta cccattttca tcgtgggaac gcttctgagg gtagggcggt attaaccagt     240

aaaactgtta aagattttat gctgcaaaag ctcaatagtc tggatatcaa aggtaatgcg     300

agtaaagatc cg                                                         312

 

<210> 2

<211> Length : 102

      SequenceName : 2

      SequenceDescription :Ⅰ型分泌信号hlyN

<212> Type : DNA

<213> OrganismName :  Escherichia coli

<400> PreSequenceString :

atgacaacaa taaccactgc acaaattaaa agcacactgc agtctgcaaa gcaatccgct      60

gcaaataaat tgcactcagc aggacaaagc acgaaagatg ca                        102

 

<210> 3

<211> Length : 183

      SequenceName : 3

      SequenceDescription : Ⅰ型分泌信号hlyC

<212> Type : DNA

<213> OrganismName :  Escherichia coli

<400> PreSequenceString :

ttagcctatg gaagtcaggg tgatcttaat ccattaatta atgaaatcag caaaatcatt      60

tcagctgcag gtagcttcga tgttaaagag gaaagaactg cagcttcttt attgcagttg     120

tccggtaatg ccagtgattt ttcatatgga cggaactcaa taaccctgac cacatcagca     180

taa                                                                   183

 

<210> 4

<211> Length : 382

      SequenceName : 4

      SequenceDescription : nirB 启动子

<212> Type : DNA

<213> OrganismName :  Escherichia coli

<400> PreSequenceString :

ggttaccggc ccgatcgttg aacatagcgg tccgcaggcg gcactgctta cagcaaacgg      60

tctgtacgct gtcgtctttg tgatgtgctt cctgttaggt ttcgtcagcc gtcaccgtca     120

gcataacacc ctgacctctc attaattgct catgccggac ggcactatcg tcgtccggcc     180

ttttcctctc ttcccccgct acgtgcatct atttctataa acccgctcat tttgtctatt     240

ttttgcacaa acatgaaata tcagacaatt ccgtgactta agaaaattta tacaaatcag     300

caatataccc attaaggagt atataaaggt gaatttgatt tacatcaata agcggggttg     360

ctgaatcgtt aaggtaggcg gt                                              382

 

<210> 5

<211> Length : 891

      SequenceName : 5

      SequenceDescription : sj23LHD-GST

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Schistosoma  japonicum

<400> PreSequenceString :

tacaaggata aaatcgatga cgaaattaat acactaatga ctggtgctct ggaaaatcca      60

aacgaggaaa taacggcaac catggataag atacaaacat cattccattg ttgtggagtc     120

aaaggtccag acgattataa agggaatgtg ccagcatcat gtaaagaagg gcaagaagtt     180

tatgttcagg gttgtctatc tgtctttagt gcattcttaa aacgcaactt aatgtcccct     240

atactaggtt attggaaaat taagggcctt gtgcaaccca ctcgacttct tttggaatat     300

cttgaagaaa aatatgaaga atggcatttg tatgagcgcg atgaaggtga taaatggcga     360

aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat tgatggtgat     420

gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca caacatgttg     480

ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt tttggatatt     540

agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa agttgatttt     600

cttagcaagc tacctgaaat gctgaaaatg ttcgaagatc gtttatgtca taaaacatat     660

ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct tgatgttgtt     720

ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt taaaaaacgt     780

attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat agcatggcct     840

ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaata a              891

 

<210> 6

<211> Length : 29

      SequenceName : 6

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌信号sopE P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccggatcca tgactaacat aacactatc                                        29

 

<210> 7

<211> Length : 26

      SequenceName : 7

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌信号sopE P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

aaaggtaccc ggatctttac tcgcat                                           26

 

<210> 8

<211> Length : 26

      SequenceName : 8

      SequenceDescription : nirB P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccctcgagg gttaccggcc cgatcg                                           26

 

<210> 9

<211> Length : 29

      SequenceName : 9

      SequenceDescription : nirB P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccggatcca ccgcctacct taacgattc                                        29

 

<210> 10

<211> Length : 31

      SequenceName : 10

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

aaaggtacca tgtacaagga taaaatcgat g                                     31

 

<210> 11

<211> Length : 36

      SequenceName : 11

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

taagttgcgt tttaagaatg ctagtatagg ggacat                                36

 

<210> 12

<211> Length : 36

      SequenceName : 12

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P3

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

ttcttaaaac gcaacttaat gtcccctata ctaggt                                36

 

<210> 13

<211> Length : 29

      SequenceName : 13

      SequenceDescription : Ⅲ型分泌sj23LHD-GST P4

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

cccaagcttt tattttggag gatggtcgc                                        29

 

<210> 14

<211> Length : 27

      SequenceName : 14

      SequenceDescription : Ⅰ型分泌si23LHD-GST P1

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

ccaatgcatc gtacaaggat aaaatcg                                          27

 

<210> 15

<211> Length : 27

      SequenceName : 15

      SequenceDescription : Ⅰ型分泌si23LHD-GST P2

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

<400> PreSequenceString :

ccaatgcatc ttttggagga tggtcgc                                          27