一种萃取灵芝子实体三萜类化合物的方法

摘要

本发明公开了一种萃取灵芝子实体三萜类化合物的方法，该方法是将灵芝子实体干燥、粉碎后，放置于萃取釜中，再加入乙醇，进行超临界CO

说明书

技术领域

 本发明涉及食用菌有效成分提取领域，具体地说涉及一种萃取具有抗肿瘤活性的灵芝子实体三萜类化合物的方法。

背景技术

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种保健价值极高的大型担子菌，素有“仙草”之誉，是中医药学宝库中的珍品，在我国已有悠久的应用历史。东汉时期（约2000年前）的《神农本草经》已把灵芝列为上品药物，主养命以应天，无毒，多服、久服不伤人。可“补五脏之气”、“安神”、“增智慧”、“久食轻身不老，延年神仙” 。《中华人民共和国药典》2000版，2005版，均收载灵芝，作为法定中药材。灵芝化学成分复杂，主要有多糖类，三萜类，呋喃类，生物碱，氨基酸多肽类和呋喃衍生物等成分。其中三萜类化合物是灵芝中公认的抗肿瘤的有效成分。在高度竞争的现代社会中，过度紧张的工作、生活方式的改变或环境污染都会对人体健康造成严重损害，癌症也成为了困扰人类的主要疾病之一，因此三萜类化合物有巨大的应用价值。但是由于三萜类化合物在天然产物中含量很低而且不易分离，给三萜的深入研究和临床应用带来很大的限制。

醇提法是工业上从灵芝子实体中提取三萜类成分的常用方法，方法简单，易于操作，但其有提取时间长、 提取次数多， 浪费有机溶剂并有残留等诸多缺点。

CO₂超临界萃取技术安全、无毒，流程简单，耗时短，提取效率高，能避免被萃取物在高温下的热裂解、能最大限度的保护生理活性物质的活性，并且CO₂流体只对溶质起作用，不改变溶质之外的任何成分或原料机体，用纯CO₂提取后的料渣还能得到很好的综合利用，因此不会产生任何新的“三废”物质，对环境保护极为有利，是当今世界上能够用于规模生产的先进分离萃取技术。

中国专利200510047263.9公开了CO₂超临界萃取在提取灵芝子实体中三萜类物质上的应用，但是只提及了压力、温度和时间对提取效率的影响，并没有对影响提取率的各个因素以及提取物的活性作一个全面的公开。

发明内容

本发明公开了一种萃取灵芝子实体三萜类化合物的方法，本发明采用的技术方案为：以超临界CO₂为萃取介质，以乙醇为夹带剂，一定的压力、温度、时间下，实现对三萜类化合物的提取。

本发明公开的一种萃取灵芝子实体三萜类化合物的方法，具体的技术方案为：

   一种萃取灵芝子实体三萜类化合物的方法，包括如下步骤：

（1）将灵芝子实体干燥，粉碎到粒度为10～80目；

（2）将粉碎后的灵芝子实体放置于萃取釜中，再加入乙醇，乙醇的体积与灵芝子实体重量的比例为3～6:1 (乙醇的体积为毫升，灵芝子实体的重量为克),进行超临界CO₂萃取；

（3）收得萃取物，减压浓缩蒸干得到产品。

      其中乙醇是作为夹带剂，所述的乙醇浓度为30～100%；所述的CO₂ 的纯度为99.9%。

 其中所述的萃取压力为20～35 Mpa，萃取温度为40～55℃，萃取时间为1～2.5h，CO₂流量为30～45 g/min。

 其中优选的萃取压力35 Mpa，温度40℃，时间为2.5h，CO₂流量为35g/min。

    优选的乙醇浓度为85～95%；优选的CO₂ 的纯度为99.99%。

    进一步优选的乙醇浓度为95%。

    优选的灵芝子实体的粒度为10目。

 其中所述的减压浓缩蒸干的温度为50℃～60℃。优选的为60℃。

使用本发明的方法， CO₂超临界萃取灵芝子实体的萃取率可达0.87%，提取物中总三萜的含量可达40%。CO₂超临界萃取的萃取率稍低于乙醇的提取率，但是CO₂超临界萃取的萃取物中三萜的种类比乙醇萃取物中多，并且其萃取物对肿瘤细胞K562的抑制作用要高于乙醇萃取物。CO₂超临界萃取安全、无毒，流程简单，耗时短，效率高，具有良好的应用前景和经济效益，因此，适合于放大到规模化生产。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

    将灵芝子实体粉碎后分别过10目、60目、80目筛，分别取100g置于CO₂超临界萃取的萃取釜中，设定萃取压力为25Mpa、温度为45℃、CO₂流量为30g/min、萃取时间1.5h、夹带剂（95%乙醇）500mL，使CO₂超临界流体在上述的条件下进行萃取，当达到实验设定的时间后，从分离釜的出料口收集萃取液，60℃减压回收溶剂，得灵芝子实体粗提物，60℃烘箱中干燥后称定提取物的重量，结果如表1所示。

    本发明萃取物中三萜类成分的含量测定：

    精密称取CO₂超临界萃取干物质0.03g于25mL的量瓶中，加乙醇溶解、定容，摇匀，即得待测液。

    对照品溶液的制备：取齐敦果酸对照品适量，精密称定，加乙醇制成1mg/1ml的溶液，即得。

标准曲线的制备： 精密量取对照品溶液0.02ml、0.04ml、0.06 ml 、0.08 ml、0.1ml，置10ml具塞试管中，加乙醇至0.1ml，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.5 ml，混匀后于60℃水浴中保温20分钟,取出后立即冷却至室温，加冰醋酸5 ml，摇匀；以相应的的溶液为空白。照紫外－可见分光光度法，在550nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。线性方程为：Y=0.0141X+0.0774,R²=0.09989,结果表明齐敦果酸在0.18～17.21μg呈现良好的线性关系。

     含量测定法： 精密量取待测溶液0.1ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含灵芝三萜的量，计算，即得。结果如表1所示，从数据中可以看出粒度为10目的子实体萃取效果更好。

表1 萃取物的重量、萃取物中总三萜的含量以及提取率

粒度萃取物重（g）萃取物中总三萜含量（g)总三萜的萃取率（%）10目1.580.650.6560目0.670.420.4280目0.630.330.33

总三萜的萃取率=萃取物中总三萜含量/100*100%

实施例2

    将灵芝子实体粉碎过10目筛，分别取100g置于CO₂超临界萃取的萃取釜中，设定萃取压力为25Mpa、温度为45℃、为30g/min、萃取时间1.5h、夹带剂乙醇（浓度从30-100%，具体见表2）500mL，使CO₂超临界流体在设定的条件下进行萃取，当达到实验设定的时间后，从分离釜的出料口收集萃取液，60℃减压回收溶剂，得灵芝子实体粗提物，60℃烘箱中干燥后称定萃取物的重量。总三萜的测定方法同实施例1。结果如表2所示。

表2不同浓度乙醇的萃取结果

乙醇浓度萃取物干重（g）萃取物中总三萜的含量（g）总三萜提取率（%）30%乙醇0.230.140.1435%乙醇0.360.210.2140%乙醇0.490.270.2745%乙醇0.560.300.3050%乙醇0.660.350.3555%乙醇0.730.380.3865%乙醇0.820.420.4275%乙醇0.870.430.4385%乙醇1.110.500.5090%乙醇1.250.540.5495%乙醇1.630.660.66无水乙醇1.480.650.65

总三萜的提取率=萃取物中总三萜的含量/100*100%

实施例3

    将灵芝子实体粉碎过10目筛，分别取100g置于CO₂超临界萃取的萃取釜中，加入95%乙醇，再设定不同的萃取压力、温度、CO₂流量、萃取时间（具体条件见表3），使CO₂超临界流体在设定的条件下进行萃取，当达到实验设定的时间后，从分离釜的出料口收集萃取液，60℃减压回收溶剂，得灵芝子实体粗提物，60℃烘箱中干燥后称定萃取物的重量。总三萜的测定方法同实施例1。结果如表3所示。

表3本实施例中正交试验设计及结果

萃取物中三萜的含量=总三萜含量/萃取物干重*100%

实施例4

    实施例3中实验1～16的萃取物中三萜的种类比较：

取实验1～16的萃取物各5mg加甲醇定容至1.5mL，10⁴ rpm，离心30min，取上清液约1mL上C18柱HPLC色谱。结果表明实验1～16的萃取物的三萜种类相同。为了确定实验1～16的萃取物中各种三萜含量的占总三萜含量的比例是否相同，取实验1～16中20个主要的峰计算其峰面积，并分别除以75.51min峰的面积，计算实验1～16的各个峰与75.51min峰的比例。结果表明实验1～16的萃取物中不仅三萜的种类相同，并且各种三萜的含量比例也相同。

其中HPLC的条件为：反向色谱柱 (YMC-Pack ODS-AQ, 5 μm, 250 mm×4.6 mm i.d. YMC, Japan)； 流动相由A、B两部分组成， A为色谱级甲醇，B为含 5‰acetic acid 的超纯水，梯度洗脱，

0min:50%A；30min:80%A；35min:85%A；65min:85%A；70min:95%A；80min:95%A；85min:100%A；100min:100%A；流速：1.0 mL/min ；柱温：30 ℃。 检测波长254 nm。 检测时间110min。

     结果16个萃取物中三萜的种类没有差别。

实施例5 

    实施例3中实验1～16的萃取物的体外抗肿瘤实验：

    人类红白血病细胞株K562 （来源于美国国家菌种保藏中心（ATCC））

将实验1～16所得的萃取物溶解于二甲基亚砜中，浓度为10mg/mL待用。

细胞K562的培养：K562细胞接于RPMI1640培养基中，置于饱和湿度的5%CO₂培养箱中培养。

对细胞K562的抑制实验：取对数生长期的K562细胞离心，去除上清液，用RPMI1640完全培养基稀释到2×10⁴个/mL。取199μl细胞液接于96孔板中，置于培养箱中培养3小时后每孔加1μl各待测三萜样品，对照以1μlDMSO替代。细胞培养72小时后，每孔加20μlMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时后终止培养，将96孔板2000r/min离心6min后小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。于570nm测定吸光值。细胞抑制率按MTT法所给公式计算。

结果：实验1-16的萃取物在作用的终浓度为100μg/ml时对人类红白血病细胞K562的抑制率为58～80%。

实施例6 

    CO₂超临界萃取灵芝子实体三萜与醇提灵芝子实体三萜比较：

    （1）灵芝子实体CO₂超临界物的制备：灵芝子实体100g，干燥粉碎到粒度为10目，加95%乙醇600毫升，在压力35Mpa、温度40℃、时间2.5h、CO₂流量35g/min的条件下，进行萃取。将萃取物压浓缩，蒸干。取干的萃取物0.03g定容到25ml，用实施例1中的化学方法测三萜含量。结果见表5。

灵芝子实体醇提粗三萜的制备：取干燥的子实体粉碎样品1g，置100ml具塞容量瓶中，加95%乙醇50ml，室温放置14小时，过滤，用实施例1中的化学方法测三萜含量。结果见表4，虽然醇提的提取率比CO₂超临界萃取高，但是CO₂超临界萃取的萃取物中三萜的含量却比醇提的高。

表4 CO₂超临界萃取灵芝子实体三萜与醇提灵芝子实体三萜的比较

提取率%=总三萜含量*100%

提取物中三萜的含量%=总三萜含量/提取物干重*100%

    （2）将CO₂超临界萃取物和醇提物各取5mg加甲醇定容至1.5mL，104 rpm，离心30min，取上清液约1mL上C18柱HPLC色谱。色谱条件同实施例4。结果可以看出CO₂超临界萃取物中三萜的种类比醇提物中三萜的种类要多。

    （3）将CO₂超临界萃取物和醇提物溶解于二甲基亚砜中，浓度为20mg/mL待用。按照实施例5中同样的方法测定CO₂超临界萃取物和醇提物对人类红白血病细胞株K562的抑制作用，结果，CO₂超临界萃取物对人类红白血病细胞株K562的抑制作用比醇提物要高，在作用终浓度为100μg/ml时CO₂超临界萃取物和乙醇萃取物对K562的抑制率分别为79.95%和73.10%。