金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白在大肠杆菌中的表达及应用

摘要

本发明涉及在大肠杆菌中高效表达金黄色葡萄球菌截短的SasA(Serine-rich adhesion forplatelets)蛋白的方法。根据GenBank报导的金黄色葡萄球菌SasA基因全长序列(GenBank：BX571856.1)，设计引物扩增金黄色葡萄球菌SasA基因的142-999bp，扩增得到的基因序列如SEQ ID No.1，其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2。扩增得到的SasA基因经双酶切后连接入表达载体pET21a(+)中，重组SasA蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性高表达，目的蛋白占碎菌上清总蛋白的约20％。经QFF柱、镍柱纯化后，目的蛋白纯度可达85％以上。通过本发明的方法制备的重组蛋白具有很好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度保护性抗体，抵御致死剂量金黄色葡萄球菌引起的小鼠死亡。本发明在金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗的大规模高效制备中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一个金黄色葡萄球菌SasA基因及其编码蛋白以及作为亚单位疫苗在金黄色葡萄球菌感染预防方面的应用。 

技术背景：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的革兰氏阳性条件致病菌，最常见的金黄色葡萄球菌引发的感染是局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心脏内膜炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。大面积烧伤、需进行血液透析的患者、早产儿及其他免疫力低下的人群是金黄色葡萄球菌的易感人群。国内一项研究结果表明，烧伤面积大于30％者，40％并发金黄色葡萄球菌引起的脓毒症，其中20％的患者最终转为多器官功能障碍综合症，50％以上死亡。另据报道75％的早产儿脓毒症是由金黄色葡萄球菌引起的。金黄色葡萄球菌感染的经典治疗是使用抗生素，而多种抗生素抗性菌株的出现，特别是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株的迅速蔓延和万古霉素抗性金黄色葡萄球菌菌株的出现，使得疫苗的研制变得更为迫切。 

金黄色葡萄球菌的疫苗研制的最大障碍是金黄色葡萄球菌的毒力因子很多，包括多种毒素、多种粘附分子和荚膜等。金黄色葡萄球菌的SasA蛋白表达在金黄色葡萄球菌细胞壁上，全长由1759个氨基酸组成，分子量约为193kDa。目前有关该蛋白的功能报导还非常少。 

由于金黄色葡萄球菌毒力相关蛋白很多，毒力蛋白在临床分离的菌株中的分布也不一致，目前还没有有效的针对金黄色葡萄球菌的蛋白疫苗。目前进入临床的针对金黄色葡萄球菌的疫苗是将金黄色葡萄球菌的荚膜多糖CP5和CP8与铜绿假单胞菌的外毒素A偶联制成的，在血液透析病人进行的三期临床结果显示该疫苗存在一定的有效性。但该疫苗存在的主要问题是需要对荚膜多糖进行提取，制备过程复杂。选择金黄色葡萄球菌的保护性抗原开发基因工程蛋白疫苗是金黄色葡萄球菌疫苗研究的方向。 

在对金黄色葡萄球菌的多个毒力蛋白的免疫保护效果进行分析后，截短SasA被发现是保护效果最好的蛋白。本研究拟在大肠杆菌中的可溶性高表达制备具有天然构象的亚单位疫苗，并对该疫苗的免疫剂量、免疫效价、保护效果等方面进行研究并进一步探索截短的SasA作为亚单位疫苗可行性，为下一步深入制备金黄色葡萄球菌亚单位疫苗奠定基础。 

发明内容：

本发明的目的是提供一个经优化后可以在大肠杆菌中进行高效可溶性表达且能够激发机体对金黄色葡萄球菌感染产生免疫保护作用的金黄色葡萄球菌截短SasA基因及其编码蛋白在金黄色葡萄球菌亚单位疫苗中的应用。 

本发明所提供的金黄色葡萄球菌截短SasA基因，名称为tSasA，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID No.2的DNA序列； 

3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对金黄色葡萄球菌感染产生免疫保护作用的核苷酸序列； 

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

序列表中的SEQ ID No.1由882个碱基组成，其编码序列为自5’端第882碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。 

所述金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码的蛋白tSasA，是下述氨基酸残基序列之一： 

1)序列表中的SEQ ID No.2； 

2)将序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体对金黄色葡萄球菌感染产生免疫保护作用的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO.2由294个氨基酸残基组成。 

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以使非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。 

含有本发明基因金黄色葡萄球菌截短SasA基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。 

以pET21a(+)为载体，构建的含有金黄色葡萄球菌截短SasA基因tSasA的重组原核表达载体为pET21a-tSasA。 

本发明还提供了一种表达金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白tSasA的方法。 

本发明所提供的表达上述金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白tSasA的方法是将上述含有金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码tSasA重的组表达载体导入宿主细胞，表达得到金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白tSasA。 

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。 

所述大肠杆菌可为E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS或E.coliTop10等。 

上述重组均可按照常规方法构建。 

培养含有金黄色葡萄球菌截短SasA基因tSasA的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培 养出宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.1-1.0mM，优选为0.2mM，诱导温度为16-37℃，优选为37℃，诱导时间为4-8h，优选为6h。 

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白tSasA的纯化方法，可通过QFF柱和镍柱两步纯化获得较高纯度的蛋白。 

本发明的金黄色葡萄球菌截短SasA基因所编码的蛋白可用于制备金黄色葡萄球菌亚单位疫苗。 

需要的时候，以金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白制备的金黄色葡萄球菌亚单位疫苗还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激剂因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子的基因或蛋白质作为分子免疫佐剂。 

本发明的疫苗可以制成注射液、干粉针剂或喷雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 

上述亚单位疫苗的用量可采用药学领域中亚单位疫苗的常规剂量，如1-10μg，并可根据实际情况调整。 

本发明提供了一种在大肠杆菌中高效可溶性表达金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白的方法。根据金黄色葡萄球菌S.aureus MASA252株的测序结果(GenBank：BX571856.1)，设计引物以S.aureus 12598菌株的基因组DNA为模板，扩增得到编码金黄色葡萄球菌SasA 48-333aa的基因，序列如SEQ ID No.1，其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2。在tSasA序列的两端分别加入NdeI和XhoI酶切位点。扩增得到的基因经双酶切后连接入表达载体pET21a(+)中，重组金黄色葡萄球菌tSasA在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达，目的蛋白占碎菌上清总蛋白的约30％。经QFF柱和镍柱两步纯化后，目的蛋白纯度可达85％以上，。通过本发明的方法制备的重组蛋白具有很好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度保护性抗体，抵御致死剂量金黄色葡萄球菌的攻击。本发明在金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗的大规模高效制备中具有广阔的应用前景。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌tSasA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达的SDS-PAGE蛋白电泳图。其中M为蛋白分子量标准；1为表达金黄色葡萄球菌tSasA的BL21(DE3)碎菌上清；2为空载体碎菌上清。 

图2为经QFF柱和镍柱两步纯化后得到的tSasA的SDS-PAGE蛋白电泳图。 

图3为金黄色葡萄球菌tSasA蛋白免疫BALB/c小鼠后检测血清中的抗体滴度。 

图4为金黄色葡萄球菌tSasA蛋白免疫后BALB/c小鼠在致死剂量金黄色葡萄球菌感染后的存活曲线。 

具体实施方式：

实施例一、金黄色葡萄球菌截短SasA基因片段获得 

根据报导的Staphylococcus Aureus MASA252株的序列(GenBank：BX571856.1)，对基因编码的蛋白全长进行分析后，设计引物扩增142-999bp片段，在tSasA序列的两端分别加入NdeI和XhoI酶切位点，并去除终止密码子，在3’端引入编码6个组氨酸的序列。 

实施例二、金黄色葡萄球菌截短SasA表达载体构建 

将扩增得到的tSasA基因用NdeI和XhoI双酶切后，连接入同样用NdeI和XhoI双酶切后的表达载体pET21a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB(Amp+)培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒，NdeI和XhoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET21a-tSasA。 

实施例三、金黄色葡萄球菌截短SasA的大肠杆菌表达及western-blot鉴定 

正确连接入tSasA基因的pET21a(+)载体，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆于5mL LB(Amp+)液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃，220rpm继续培养6h。5,000g，4℃离心收集菌体，用PBS重悬后超声碎菌。12,000g，4℃离心取上清，行SDS-PAGE电泳，以空载体表达产物为对照，鉴定大小为40kDa的tSasA蛋白的表达。 

Western-blot分析tSasA蛋白与鼠抗His标签单克隆抗体的特异性结合。将含有tSasA蛋白的超声碎菌上清及空载体碎菌上清行SDS-PAGE蛋白电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含3％BSA的PBS室温封闭1h后，加入1∶1000稀释的鼠抗His标签单克隆抗体，37℃反应1h。将膜用PBST洗涤4遍后，加入1∶5000稀释的辣根酶标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应1h后PBST洗涤4遍，采用化学发光法显色、压片、曝光。 

从图1的实验结果可以看到，与空载体对照相比，转化有pET21a-tSasA质粒的菌株在40kDa左右有明显的条带，western-bolt结果证实该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性的结合，说明该条带即为tSasA目的条带。经薄层扫描分析目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的20％，说明tSasA蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达。 

实施例四、金黄色葡萄球菌tSasA的大肠杆菌发酵及纯化 

表达tSasA蛋白的种子液1L，转接入30L发酵罐中，培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，300rpm继续培养6h。10,000g，4℃离心收集菌体，用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)重悬后匀浆碎菌。20,000g，4℃离心收集上清。上清液过QFF柱进行阴离子交换，流出液用20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl(pH7.4)3倍稀释后进行镍柱纯化，用20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，0.5M咪唑(pH7.4)进行连续梯度洗脱。经过两步纯化后，目的蛋白tSasA得到了很好的纯化，纯度可达85％以上(图2)，目的蛋白最终保存在PBS缓冲液中。 

实施例五、tSasA蛋白的免疫原性研究 

按10μg/只小鼠的tSasA蛋白与铝佐剂混匀后，4℃吸附过夜，腹腔免疫6-8周龄BALB/c小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次，第二次和第三次免疫后7天取血检测血清中的抗体滴度；抗体滴度的测定采用ELISA的方法，金黄色葡萄球菌tSasA蛋白2μg/mL，100μL/孔包被96孔酶联板，4℃包被过夜。PBST洗涤4次，5min/次。将抗血清用PBST从1∶100依次倍比稀释后，加入酶联板中，37℃反应1h，同时设PBS免疫后的血清为对照。PBST洗涤4次，5min/次。加入HRP-抗小鼠鼠二抗，37℃反应30-40min。加入TMB显色液，50μL/孔，显色后用2MH₂SO₄终止，酶标仪450nm测定光吸收值。以加入阴性对照血清孔的显色值为对照，以OD450nm大于0.1且高于阴性孔2倍为阳性稀释滴度。从实验结果可以看到，tSasA组的抗体滴度基本在1∶128000以上。 

实施例六、tSasA蛋白免疫可避免致死剂量金黄色葡萄球菌引起的小鼠死亡。 

挑取金黄色葡萄球菌菌株USA300单克隆接种至5mL营养肉汤培养基中，37℃、220rpm培养过夜，然后按1∶100转种至200mL应用肉汤培养基中，37℃、220rpm培养5h，8000rpm离心收集菌体，菌体沉淀用100mL PBS洗涤两遍，然后用10mL PBS重悬，用比浊法测定菌体浓度。调整菌体浓度为3×10¹⁰/mL。取tSasA蛋白三次免疫的小鼠，腹腔注射金黄色葡萄球菌USA3003×10⁹/只小鼠，观察小鼠的存活。tSasA蛋白免疫小鼠生长状态较好，小鼠存活率显著高于对照组，具有很好的预防效果。 

SEQ ID No.1 

<110>军事医学科学院微生物流行病研究所 

<120>金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白在大肠杆菌中的高效表达及应用 

<160>1 

<170>PatentIn Version 3.5

<210>1

<211>882

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<220>

<221>gene

<222>(1)...(882)

<223>

<400>1

atgagtcata gtttagtgag tcaagataat caaagcatta gtaaaaaaat aacgggatac    60

ggactgaaaa ctacagcggt tattggtggt gcattcacag taaacatgtt gcatgaccag    120

caagcttttg cggcttctga tgcaccttta acatctgaat taaacacgca aagtgaaacc    180

gtaggcaatc aaaactcaac gacaatcgaa gcatcaacat caacaaccga ttctactagc    240

gtaacgaaaa atagcagttc ggaacaaaca tcaaatagtg acacagtctc aagtgaaaag    300

tctgaaaatg tcacttcgac aactaatagt acaagcaatc aacaagaaaa attgacatct    360

acatctgaat caacatcccc aaagaatact acatcaagtt ctgatactaa atctgtaaca    420

tcaatttcaa gtacagacca acaaactaat acatcaacaa atcaaagtac tgcatcaaat    480

actacttcac aaagcacaac gccagcttca gccaatttaa acaaaactag tacaacgtca    540

accagcacag cacctatcaa acttcgaact ttcagtcgat tagctatgtc aacttttgca    600

tcagctgcaa cgacaagtgc agtaaccgct aatacgatta cggttaataa agataacctc    660

aaacaatata tgacaacgtc aggtaatgct acttatgatc aaagtaccgg tattgtgacg    720

ttaacgcagg atgcatacag ccaaaaaggt gctattacat taggaacacg tattgactct    780

aataaaagtt ttcatttttc tggaaaagta aatttaggta ataaatacga aggtaatgga    840

aatggtggag atggtatcct cgagcaccac caccaccacc ac                       882

SEQ ID No.2

<110>军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白在大肠杆菌中的高效表达及应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.5

<210>1

<211>294

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<220>

<221>mat_peptide

<222>(1)...(294)

<223>

<400>2

Met Ser His Ser Leu Val Ser Gln Asp Asn Gln Ser Ile Ser Lys

1                5                  10                   15

Lys Ile Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Thr Thr Ala Val Ile Gly Gly

                20                  25                   30

Ala Phe Thr Val Asn Met Leu His Asp Gln Gln Ala Phe Ala Ala

                35                  40                   45

Ser Asp Ala Pro Leu Thr Ser Glu Leu Asn Thr Gln Ser Glu Thr

                50                  55                   60

Val Gly Asn Gln Asn Ser Thr Thr Ile Glu Ala Ser Thr Ser Thr

                65                  70                   75

Thr Asp Ser Thr Ser Val Thr Lys Asn Ser Ser Ser Glu Gln Thr

                80                  85                   90

Ser Asn Ser Asp Thr Val Ser Ser Glu Lys Ser Glu Asn Val Thr

                95                  100                 105

Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ser Asn Gln Gln Glu Lys Leu Thr Ser

                110                 115                 120

Thr Ser Glu Ser Thr Ser Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ser Ser Asp

                125                 130                 135

Thr Lys Ser Val Thr Ser Ile Ser Ser Thr Asp Gln Gln Thr Asn

                140                 145                 150

Thr Ser Thr Asn Gln Ser Thr Ala Ser Asn Thr Thr Ser Gln Ser

                155                 160                 165

Thr Thr Pro Ala Ser Ala Asn Leu Asn Lys Thr Ser Thr Thr Ser

                170                 175                 180

Thr Ser Thr Ala Prp Ile Lys Leu Arg Thr Phe Ser Arg Leu Ala

                185                 190                 195

Met Ser Thr Phe Ala Ser Ala Ala Thr Thr Ser Ala Val Thr Ala

                200                 205                 210

Asn Thr Ile Thr Val Asn Lys Asp Asn Leu Lys Gln Tyr Met Thr

                215                 220                 225

Thr Ser Gly Asn Ala Thr Tyr Asp Gln Ser Thr Gly Ile Val Thr

                230                 235                 240

Leu Thr Gln Asp Ala Tyr Ser Gln Lys Gly Ala Ile Thr Leu Gly

                245                 250                 255

Thr Arg Ile Asp Ser Asn Lys Ser Phe His Phe Ser Gly Lys Val

                260                 265                 270

Asn Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Gly Asn Gly Asn Gly Gly Asp Gly

                275                 280                 285

Ile Leu Glu His His His His His His

                290                 294