蔗糖转运载体蛋白基因在油菜中的用途

摘要

本发明公开了一种蔗糖转运载体蛋白基因在提高油菜产量中的应用。本发明中所使用的蔗糖转运载体蛋白基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ IDNO.1的DNA序列或与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。蔗糖转运载体蛋白序列是具有序列表中SEQ ID NO.2氨基酸残基序列的蛋白质或者是将SEQ ID NO.2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列相同活性的衍生蛋白质。本发明将利用上述基因序列在油菜中的应用来提高油菜籽的产量进而提高油菜的产油量。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体涉及一种油菜蔗糖转运载体蛋白基因 在油菜中的用途。

背景技术

高等植物中，光合产物的输出是通过韧皮部装载至筛分子伴胞复合体中，并 以蔗糖的形式经长距离运输分配到各个组织和器官。蔗糖转运从最初的同化物形 成位点(源)到输入依赖性的组织或器官(库)的同化物分配过程中，植物蔗糖转运 蛋白(sucrose transporter/sucrose carrier，SUT/SUC)参与了蔗糖在韧皮部的装载和 卸载。蔗糖转运蛋白就是质膜上的一个蔗糖转运载体，它可以与H-ATPase耦联 形成质膜电化学势差进行蔗糖的跨膜转运(Williams LE，Lemoine R，Sauer N.Trends Plant Sci，2000，5：283-290.Kflhn C，Hajirezaei MR，Fernle AR， et al.Plant Physiol，2003，131：102-113.)。蔗糖转运蛋白的表达与蔗糖转运 活性可直接影响植物体的生长和发育进程，并最终决定作物经济器官的产量和品 质。

根据近几十年的研究发现，蔗糖转运蛋白是属于一个多成员的基因家族。蔗 糖转运蛋白是植物体中转运蔗糖的一种具有12个跨膜结构域的膜结合蛋白。根 据蔗糖转运蛋白的不同特性，分别归类为SUT1、SUT2和SUT43个亚族。SUTI 是高亲和质子共转运蛋白载体，与韧皮部蔗糖的装载/卸载、库细胞的分化和发 育有关；SUT4是低亲和性载体，与次生维管组织中韧皮部的装载有关，在叶片 维管束鞘细胞、萌发的种子、根和花序等中都有表达；SUT2则可能是质膜蔗糖 信号感应器。

1992年，Riesmeier等首次从菠菜中克隆到第一个蔗糖转运蛋白SoSUT1的 cDNA，并通过酵母细胞构建异源表达系统验证了其具有转运活性。1997年， HIROSE等成功地在水稻中分离出蔗糖转运蛋白，使水稻OsSUT1成为单子叶植物 中第一个被鉴定出的蔗糖转运蛋白(Hirose T，Imaizumin(1997)cDNA cloning and tissue specific expression of a gene for surrose transporter from rice (Oryza sativa L).Plant Cell Physiol，38：1389-1396)。之后，通过植物 cDNA文库筛选、EST库或基因组序列数据库搜索和RT-PCR的方法，在多种植物 中分离、鉴定或克隆出蔗糖转运蛋白及编码基因或cDNA。在很多植物中都筛选 出不止一个SUT基因。例如，在拟南芥中，通过酵母异源表达及功能验证，鉴定 出了5个SUT基因.同时通过在公共数据库中比对也鉴定出另外4个假定的SUT 基因。

蔗糖转运蛋白的转运活性在转录水平和翻译后水平都能够进行调控 (Chi-aki M，Toshikazu S，Toshiro H et al(2000)Sugar uptake and transport in rice embryo.Expression of companion cell-specific sucrose transporter (OsSUT1)induced by sugar and light.Plant Physiol，124：85-94)。许多 内外部因素包括组织特异性、发育阶段、昼夜节律、胁迫、生长物质、创伤和植 物体内外的糖浓度等均能调控蔗糖转运蛋白的表达和活性(吴转娣，昝逢刚，张 树珍等(2009)蔗糖转运蛋白的调节，生物技术通报，7：12-16)。

植物SUT基因在植物发育中的作用主要是通过转基因手段实现的。在研究早 期建立了用于SUT基因功能分析的酵母表达体系。利用这些体系可以研究SUT 蔗糖吸收的动力学特性、蔗糖与质子的共转运特性和蔗糖吸收的特异抑制剂等 (Relnders A，Schulze W，Kiihn C，Barker L，Schuiz A，Ward JM，Frommer WB(2002).Protein-protein interactions between sucrose transporters of diferent afinities colocalized in the same enucleate sieve element.Plant Cell 14，1567-1577；Barth I，Meyer S，Sauer N(2003).PmSUC3： characterization of a SUT2/SUC3-type sucrose transporter from Plantago major.Plant Cell 15，1375-1385)。反义RNA或者T-DNA插入突变表明，蔗糖 转运蛋白对光合同化物在植物体各个器官间的合理分配至关重要(Burke L， Hibberd JM，Quick WP，Kuhn C，Hirner B，Frommer WB(1998)The H+-sucrose cotransporter NtSUT1 is essential for sugar export from tobacco leaves. Plant Physiol.118：59-68；Elke R，Daniel B，Mechthild T et al.(2002) Seed-specific overexpression of a potato sucrose transporter increases sucrose uptake and growth rates of developing pea cotyledons.Plant J 30： 165-175；Georg L，Anna K，Remi L et al.(2003)Overexpression of the sucrose transporter So SUT1 in potato results in alteratiohs in leaf carbon partitioning and in tuber metabolism but has little impact on tuber morphology.Planta 217：158-167)。

虽然目前从各种植物中分离到的编码蔗糖转运蛋白的基因或cDNA很多，也 包括油菜中的一些SUT基因序列。但在本发明申请之前，国内没有人公开或发 表过关于利用蔗糖转运蛋白基因来提高油菜种子产量的相关报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种油菜蔗糖转运载体蛋白及其同源基因在提 高油菜籽产量中的应用。本发明中所使用的蔗糖转运载体蛋白基因包括SEQ ID NO.1的DNA序列或与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上 同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。植物蔗糖转运从源到库的同化物分 配过程中，植物蔗糖转运蛋白参与了蔗糖在韧皮部的装载和卸载。蔗糖转运蛋白 就是质膜上的一个蔗糖转运载体，它可以与H-ATPase耦联形成质膜电化学势差 进行蔗糖的跨膜转运。该基因在油菜中过量表达可以提高蔗糖转运能力进而增加 油菜籽的千粒重。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：

A.蔗糖转运蛋白基因的获得：

1)利用拟南芥已发表的SUT1基因的编码区序列在NCBI数据库中Blast油菜 EST序列，设计对应的可扩增油菜SUT1基因编码区序列的两侧引物(正向引物： [5’-atggagaaaggttccaacgg-3’]；反向引物： [5’-atcagaaatatggtcagtcac-3’])。

2)以油菜cDNA文库为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序， 获得SUT1基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

B.蔗糖转运蛋白基因的转化：

通过上述方法获得了油菜蔗糖转运蛋白基因SUT1，采用一种提高SUT1基因表 达活性的转基因油菜，其特征在于转基因植物表现为种子重量增加，比受体对照 (非转基因植株)增加20％以上。

在本发明中为了达到上述目的采用以下具体技术措施：提供了一种质粒表达载 体pBI121(从商业途径获得，下同)，它含有非组织特异表达启动子(35S启动 子及对应的终止序列)和翻译控制件。

在本发明的另一个方面，提供了一种可在植物中表达的宿主菌(如GV3101或 LBA4404，购自invitrogen公司)，本发明优选的是农杆菌GV3101。

本发明也提供了一种将所述载体(pBI121-35S:BnSUT1)导入植物细胞的方法， 如基因枪注射法，细菌导入法。本发明优选农杆菌导入法，如农杆菌LBA4404 油菜子叶柄导入法。

本发明提供了一种能够过量表达蔗糖转运蛋白基因BnSUT1的转基因油菜的方 法，其特征在于油菜蔗糖转运蛋白含量增加，种子蔗糖和淀粉含量提高，种子重 量增加。其应用过程包括下列步骤：

1)将克隆得到的油菜SUT1基因连接到质粒pBI121上，利用非组织特异性表达 启动子35S形成可转化或表达的载体(pBI121-35S:BnSUT1)；

2)将步骤1)中制备的载体(pBI121-35S:BnSUT1)转入根癌农杆菌LBA4404，再 导入甘蓝型油菜植株中；

3)筛选阳性植株：

在本发明中，①以甘蓝型油菜为材料，根据已发表的油菜EST序列，在基因 编码序列的两侧保守区域设计特异引物进行RT-PCR扩增，得到了基因序列如SEQ ID NO：1所示。利用PCR产物和由PBI121质粒制备的T载体经T4连接酶连接后， 转化到感受态细胞DH5α(从商业途径获得)中鉴定，构建植物表达载体命名为 pBI121-35S:BnSUT1。②将pBI 121-35S:BnSUT1质粒转染根癌农杆菌LBA4404， 培养农杆菌于YEB液体培养基(牛肉浸膏5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨5g/L，蔗 糖5g/L，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml，琼脂1.5g/100ml，pH 7.4)，并将无菌苗在 农杆菌菌液中浸泡。③在加卡那(Kan)的选择培养基筛选阳性克隆。

在本发明的一个具体实施例中，植株无菌苗选自油菜，通过选择培养基最后 筛选到油菜BnSUT1表达的植株，植株种子表现出蔗糖和淀粉含量增加，种子重 量增加。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强 或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。

本发明中的“植物细胞”是指植物的各种未成熟胚，愈伤组织或悬浮细胞(成 熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶)，或原生质体(叶肉细胞)。 这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。

克隆本发明中所述的油菜BnSUT1基因的方法是本领域中所常采用的方法。提 取mRNA的方法也有多种成熟的技术(如采用TRIzol Reagent，Invetrogen)， 提取mRNA试剂盒如可从商业途径获得，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学 技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采用的方 法。其中所涉及的质粒(如质粒表达载体pBI121)，转染用媒体(如根癌农杆菌 GV3101和所用试剂如蔗糖、表面活性剂等可从商业途径获得。

本发明具有以下优点和效果：

本发明是国内首次公开油菜BnSUT1及其同源基因在提高油菜产量中的应用。 通过在转基因油菜中的实验证实，转基因植株成熟后的种子重量与受体对照(非 转基因植株)相比，提高幅度最高为40％左右(见表1)。因此该基因及其同源基 因在提高油菜体内蔗糖分子的跨膜运输效率，增加油菜籽的产量具有重要的应用 价值。同时，将其扩展到其他油料作物如大豆、花生、芝麻等的育种应用中，最 大限度的提高作物的产量。

附图说明

图1RT-PCR扩增的BnSUT1cDNA目标片段，BnSUT1基因序列长度约1.3kb。

图2植物表达载体示意图。Kan为卡那抗性，35S为启动子，BnSUT1基因插 在35S启动子之后。

图3Real-time PCR检测转基因阳性植株BnSUT1基因的表达水平。转基因 株系的表达量均高于对照至少4倍以上。

图4转BnSUT1基因油菜与对照植株种子大小的比较。左图为BnSUT1基因 的种子，右图为非转基因对照。

具体实施方式

通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spri ng Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等人(Blackwell科学 出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1：(基因的克隆及测序)

利用拟南芥SUT1基因在NCBI数据库中Blast已发表的油菜SUT1基因的EST 序列，设计基因编码序列的两侧引物(正向引物： [5’-atggagaaaggttccaacgg-3’]；反向引物： [5’-atcagaaatatggtcagtcac-3’])。用来从油菜中扩增SUT1基因的编码区序 列。

提取甘蓝型油菜mRNA。

RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)，液氮研磨100mg材料。

A.加1mlTRIZOL，室温(20-25℃，下同)放置5min。

B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。

C.12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后 室温放置15min。

D.12000g，15min，4摄氏度。去上清，加入1ml70％(体积比)乙醇。

E.7500g，7min，4摄氏度。去上清，空气干燥。DEPC-H2O溶解。

2、cDNA第一链的反转录采用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。

3、以cDNA为模板进行PCR扩增(图1)，得到了基因序列如SEQID NO：1所 示。

实施例2：(载体构建)

PBI121质粒经SmalI酶切后加T并去磷酸化制备T载体，将纯化后的PCR产 物与上述T载体连接(图2)，转化到感受态细胞DH5α(从商业途径获得)中经 PCR鉴定，选择阳性克隆经测序鉴定后摇菌制备质粒并转化农杆菌LBA4404感受 态。

实施例3：(植株的转化与筛选)

油菜的农杆菌LBA4404转化

A.无菌苗的准备：种子经70％(体积比)乙醇1min，氯化汞(HgCl2)浸泡 13-15min，ddH2O洗5次后，平铺于MS培养基(PH 5.8)中，琼脂浓度0.8％。油 菜无菌苗备用。

B.油菜子叶柄转化：接种根癌农杆菌LBA4404(含BnSUT1基因)于固体培养基 LB上，两天后挑取单菌落于50ml YEP液体培养基(胰蛋白胨10g+ 酵母提取物10g+NaCl5g+MgSO4 0.5g)中培养。取4-5天无菌苗子叶柄， 于菌液中浸泡5-8min，其间轻摇，而后倒去菌液，以无菌滤纸吸去外植体上残 留菌液。置于共培养基(MS+0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+1mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸(2、4-D)+200um乙酰丁香酮(AS)，PH5.8)，上培养2-3天。

C.将共培养后的外植体转入只含青霉素(Car)不含Kan的分化培养基中，黑 暗条件的温室中进行脱菌与分化培养5-7天。再继代在添加Kan筛选压的选择培 养基(MS+3mg/L6-BA+0.1mg/L α-萘乙酸(NAA)+5mg/L硝酸银(AgNO3) +400mg/L Car+15mg/L Kan；pH5.8)中，进行筛选，待分化出再生绿芽。

D.待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基(MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Kan+400mg/L Car；pH5.8)上，用加Car与Kan的固体MS培养基筛选。 E.苗生根后，移栽入室外。10天后移栽下土钵。 实施例4：(转化植株的核酸分析-PCR鉴定)

(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取：

A.70％(体积比)乙醇擦洗叶片，称取大约100mg；

B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％(体 积比)SDS，pH 7.5)，室温快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5-10s。

D.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过 夜。

E.12000rpm，15min，室温。加入70％(体积比)乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。

G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。

H.以总DNA为模板，进行PCR。

(2)PCR程序

PCR反应混合液的配比同质粒(含BnSUT1基因)PCR鉴定，依据植物表达载 体中目的基因及其上游35S启动子序列，设计并合成PCR引物。(正向引物： [5’-CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA-3’]和反向引物 [5’-atcagaaatatggtcagtcac-3’]，反应的时间和温度作如下：94℃3min， 94℃45s，59℃45s，72℃2min 30s，30cycles，72℃5min。

检测结果显示，阳性对照和大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条 带(1500bp左右)，而阴性对照则没有，表明转基因油菜基因组中已经含有外源 基因DNA片段。

实施例5：(对T1代转基因株系进行分析)

(1)转基因株系BnSUT1基因的表达量分析

为确认BnSUT1基因在转基因阳性株系中的表达量提高，选择6株阳性植株进 行Real-time PCR分析，引物序列为SUT1F：ACGTGCAGCTACTCGGAATC，SUT1R： CGGCGGCGTAACCGATGA。检测结果显示，与野生型对照相比，转基因阳性植株中 SUT1基因的表达水平均有不同程度的显著提高(图3)，证实了SUT1基因表达载 体的可靠性。

(2)BnSUT1转基因株系种子重量的测定

油菜转基因株系及对照完全成熟后收获，油菜籽脱粒并充分晒干称取千粒重。最 终结果显示，与非转基因株系相比，转基因株系种子重量最大的增幅超过40％(表 1，图4)。

表1油菜BnSUT1转基因株系T2代纯合株系种子的千粒重(单位：克)

  WT对照   Trans1   Trans2   Trans3   Trans4   Trans5   Trans6  千粒重(g)   3.8±0.2   4.2±0.32   4.7±0.25   4.4±0.21   5.6±0.35   5.0±0.27   4.8±0.41

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>中国农业科学院油料作物研究所

 

<120>蔗糖转运载体蛋白基因在油菜中的用途

 

<130>蔗糖转运载体蛋白基因在油菜中的用途

 

<160>1

 

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>1542

<212>DNA

<213>油菜

 

<400>1

atggtcagtc acccaatgga gaaagcttcc aacggtacgt ccgcgctaga gacgcagacg    60

gctgagcttg atcagcctgc agcgcttaga aaaatcatat cggtgtcttc tatagccgcc    120

ggtgtacagt tcggctgggc tttacaacta tctctgctga ctccttacgt gcagctactc    180

ggaatcccac ataaatgggc ttctctgata tggctctgtg gcccaatctc cggcatgctt    240

gttcaaccca tcgtcggtta ccacagcgac cgttgcacct caagattcgg ccgtcgtcgt    300

cctttcatcg tcgccggagc cggtttagtc accgtcgccg ttttcctcat cggttacgcc    360

gccgacttag gtcacagcat gggtgatcag ctcaacaaac cgcctagaac gcgagccatc    420

gcgattttcg ctctcgggtt ttggatactc gacgtggcta acaacaccct ccaaggacca    480

tgccgagctt tcttggccga tctatccgcg gggaacgcca agaaaacgcg gaccgcaaac    540

gcgtctttct cgtttttcat ggcggtggga aacgttttgg gttacgcggc gggttcttac    600

agggatctct acaaaatggt ccctttcacg atgaccgagt catgcggacc tctactgtgc    660

taacctcaaa acgtgttttt tcctctccat aacgcttctc gtcttggtca cgttcgtctc    720

tctctgttac gtgaaggaga agccatggac gctgagccaa ccgcagacgg gaaagcctcg    780

aacgttccgt ttttcggaga gatcttcgga gctttcaagg agctgaaaag accgatgtgg    840

atgcttctta tagtcactgc actaaactgg atcgcttggt tccctttcct cctcttcgac    900

accgattgga tgggccgtga ggtttatgga ggtaactcag acgcaactgc aagcgcaacc    960

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acgttcagta ttccttttgc actagcttcc atattttcaa gcaattccgg tgccggccaa    1320

ggactttctc taggtgttct aaatctggct attgtcgtcc cacagatggt ggtatctgtg    1380

ggaggtggac catttgatga aatcttcggt ggtggaaaca ttccggcgtt tgtgttagga    1440

gcaattgcag ctgcggtgag tggcatattg gctttaacgg tgctgccatc gccaccaccg    1500

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