来源于色氨酸与脯氨酸的吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及来源于色氨酸与脯氨酸的吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物的制备方法和用途。本发明用采自红树林卤厥根泥样品中的台中曲霉ZHN-7-07(Aspergillus taichungensisZHN-7-07)生产出结构新颖的来源于色氨酸与脯氨酸的吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂。

说明书

技术领域：

本发明涉及用台中曲霉ZHN-7-07(Aspergillus taichungensis ZHN-7-07)(2010年12月22日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCC M 2010354)生产包含色氨酸与脯氨酸的吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂中的用途。 

背景技术：

来源于色氨酸与脯氨酸的吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物主要是由微生物产生的一类吲哚生物碱类化合物，该类化合物是以一分子色氨酸与一分子脯氨酸形成的二酮哌嗪生物碱Brevianamide F为基本母核，由于分子结构中有吲哚环芳香体系的存在，因此具有多个可以结构修饰的位点，特别是异戊烯基的取代作用，异戊烯基侧链及其它基团以及分子内的环化作用造就了该类化合物的结构复杂性与活性的多样性。已报道的该类化合物多含有[2，2，2]双环体系的二酮哌嗪核的结构，且绝大多数该双环体系具有顺式的相对构型。本发明人研究得知，闪白曲霉亚属(Aspergillus section Candidi)的一个种台中曲霉(Aspergillus taichungensisZHN-7-07)(保藏编号是：CCTCC M 2010354)大米发酵产物经甲醇提取后的粗提物具有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示来源于色氨酸与脯氨酸的吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物具有抗肿瘤活性，目前关于反式相对构型的该类化合物的化学结构及细胞增殖抑制的报道较为罕见，市场上也尚未见有与此有关的药物。 

发明内容：

本发明旨在提供一种结构新颖的具有抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤活性的新化合物。其结构式是 

本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析制备HPLC等方法分离纯化得到。 

本发明的下述实施例中列举了利用台中曲霉ZHN-7-07(Aspergillus taichungensisZHN-7-07)(保藏编号是：CCTCC M 2010354)制备本发明式I化合物的实例。 

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物I的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)是： 

实施例1化合物I的发酵生产及分离精制 

1发酵生产 

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取台中曲霉ZHN-7-07(Aspergillustaichungensis ZHN-7-07)(保藏编号是：CCTCC M 2010354)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。 

取斜面培养4天的台中曲霉ZHN-7-07(Aspergillus taichungensis ZHN-7-07)适量，接种到装有80g大米培养基[培养基组成：大米80.0g，水120mL，海水素6.7g，pH自然]的1000mL锥型瓶中，在28摄氏度条件下静置培养30天，获得发酵产物。 

2浸膏的获得 

大米发酵产物用甲醇浸泡提取三次，离心除去固体物得甲醇提取液，在减压的条件下将甲醇完全除去，剩余水溶液用等量乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，得粗浸膏，共20.0克。 

3化合物的分离精制 

浸膏(20.0克)用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后，加150克100-200目硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-丙酮，氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为5个流份。Fr-3(3.0g，石油醚-丙酮8∶2洗脱物)，先后以C-18 ODS柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，再以氯仿-甲醇(1∶1)为溶剂进行LH20柱层析，最后经反相半制备高效液相色谱(甲醇∶水＝70∶30)得化合物I(20mg)。 

化合物I无色块状晶体，分子式C₂₆H₂₉N₃O₄，HR-ESI-MS m/z：446.2085[M-H]^-，计算值446.2080。IR(KBr)v_max 3439，3192，2972，2923，1680，1668，1438，1409，1360，1205，1117，1021，726cm^-1。¹H和¹³C-NMR数据见表1。 

表1化合物I的¹H和¹³C NMR数据(600和150MHz，in DMSO-d₆)^a

a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。 

b)此栏中的数字和代号分别代表在¹H-¹H COSY谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的 ¹H核。 

c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹³C核。 

实施例2体外抗肿瘤活性的测试 

细胞增殖抑制活性测试及细胞凋亡诱导活性测试 

1实验样品及实验方法 

被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。 

细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A-549细胞和人白血病HL-60细胞等癌细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃于通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。 

细胞增殖抑制活性测试方法 

丽丝胺罗丹明B(SRB)法取对数生长期的人肺癌A-549细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×10⁵个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，37℃下培养24小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋 亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清。每孔细胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L，pH 10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照X100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。 

四氮唑盐(MTT)法取对数生长期的人白血病HL-60细胞，将细胞密度调至每毫升2×10⁵个细胞，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5％CO₂的培养箱中培养4小时。每孔加样品液或空白液各2微升，培养24小时后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液)10微升，继续培养4小时，37℃、2000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(OD值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照X100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。 

2.实验结果 

细胞增殖抑制活性测试结果 

在SRB法或MTT法测试中，不同浓度的化合物I对人肺癌A-549细胞和人白血病HL-60细胞的增殖抑制结果分别见表2。 

表2不同浓度的化合物I对癌细胞增殖的抑制率(％) 

3结论 

化合物I具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。