抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法

摘要

本发明属于生物技术育种领域，涉及抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法。本发明通过野生种与栽培种的种间杂交，染色体加倍获得双二倍体新种，经回交、自交获得种间渐渗系，再对黄瓜渐渗系利用人工苗期卵液接种法进行鉴定，鉴定结果发现渐渗系10299F-5的病情指数均为2.0，表现为抗病，由此得到抗南方根结线虫病的黄瓜种间杂交渐渗系材料。该抗南方根结线虫病的黄瓜种间杂交渐渗系材料农艺性状优良，可直接作为育种材料，不仅填补了黄瓜抗南方根结线虫资源的空白，还为其它植物的接种鉴定提供参考，而且为今后黄瓜品种的改良、抗病基因转移、基因定位、分子标记、基因克隆等提供了有用的遗传材料。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，涉及抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法。

背景技术

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是危害黄瓜(Cucumis sativus L.)生产的主要病原线虫 ^[1、2]，全球每年因此而造成的损失高达1000亿美元以上^[3]，年损失率约10％^[4]，已成为影响黄 瓜生产的严重障碍之一。目前在黄瓜栽培种中尚未发现抗南方根结线虫的种质资源^[5、6、7]。由 于黄瓜遗传基础非常狭窄，变异率仅为3-8％^[8]，因此，通过种内变异获得抗南方根结线虫黄瓜 品种是难以实现的。诸多研究表明，甜瓜属一些近缘野生种，如C.metuliferus E.Meyer ex  Naudin，C.anguria L.，C.ficifolius A.Rich，C.heptadactylus Naud.，C.longipes Hook和C.hystrix  Chakr等，对南方根结线虫具有抗性^[9、10]，因此，通过远缘杂交转移近缘野生种中的抗性基因 以拓宽黄瓜遗传基础，并选育抗病新品种是一条解决黄瓜抗性问题的有效途径。

远缘杂交是创造新物种、新材料的有效途径之一，同时可以向栽培作物中导入外源有益基 因，扩大作物的遗传基础，提高作物的抗病、抗逆性等。在栽培黄瓜的近缘物种中，蕴藏着许 多对黄瓜改良及其有用的基因，很早就受到葫芦科育种者的重视，但由于种间杂交严重不亲和， 杂交后代的不育，许多试验均未取得成功。陈劲枫于1989年在我国云南西双版纳采集到1个 甜瓜属珍稀野生种(C.hystrix Chakr.)，实验证明其具有多种抗病性，如抗蔓枯病、根结线虫 病等多种病害，并成功的获得了其与栽培品种之间的种间杂种F₁，利用体细胞无性系变异途 径加倍杂种染色体，获得了人工双二倍体新种质(C.hytivus)，C.hytivus可作为遗传桥梁，通 过与栽培黄瓜品种不断回交、自交，得到黄瓜-酸黄瓜种间杂交渐渗系，这些渐渗系经分子标 记验证已含有酸黄瓜野生种C.hystrix的部分片段^[11]。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培 育方法。

本发明的另一目的是提供黄瓜抗南方根结线虫材料的筛选鉴定方法，该方法同时也可为其 他作物抗根结线虫病接种鉴定提供参考。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法，包含如下步骤：

(1)黄瓜种间杂交渐渗系的获得：以栽培黄瓜‘北京截头’为父本，野生种酸黄瓜为母本杂交 获得杂种F₁，杂种F₁通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异对其染色体进行加倍，加倍后获得 种间双二倍体新种，命名为Cucumis hytivus，以双二倍体新种Cucumis hytivus为母本，与栽培 品种‘北京截头’回交1～2代，然后再自交3～5代获得其多代回交自交后代群体株系，即黄瓜种 间杂交渐渗系；

(2)黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定：制备1mL含1000个虫卵的南方根结线 虫接种液，按照2000卵/株的接种量接种步骤(1)获得的黄瓜种间杂交渐渗系幼苗，接种8周 后将黄瓜种间杂交渐渗系植株的根剪下，统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病 级指数DI，1＜DI≤2的株系即为抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料：

DI＝∑(Sini)/N；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i＝病情分级的各个级别，N＝ 调查总株数，发病级别si的分级标准为：0级无根结；1级1～2个根结和卵块；2级3～10个根 结和卵块；3级11～30个根结和卵块；4级31～100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵块。

所述的所述的野生种酸黄瓜较栽培黄瓜‘北京截头’提前2个月播种，并对其进行40d以上的 光照处理，使两者花期相遇。

所述的黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定具体步骤如下：

1)病原物繁殖与保存  将南方根结线虫卵接种到感病番茄品种‘苏粉2号’上，于温室中进行 繁殖保存备用，每3个月转接一次；

2)病原物分离  将番茄的根从植株上剪下，冲洗干净，然后将含有卵块的根切成1-2mm的 小段，按1g病根加100ml的比例加入0.5％的次氯酸钠盐溶液，充分振荡2～4min，使病根中 的卵从卵块中解脱出来，迅速依次过60、200及500目筛过滤，洗下的卵再立即用自来水清洗 干净，得到卵液后取1ml进行镜检，利用计数皿确定其浓度；

3)接种  待黄瓜幼苗长到3-4片真叶时接种南方根结线虫卵液，接种量为2000卵/株，接种 后温度维持在25℃～28℃，进行正常的肥水管理；

4)鉴定  接种8周后将所有植株的根剪下，去掉根上的基质，将根洗干净后调查统计每株根 系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，1＜DI≤2的株系即为抗南方根结线虫黄瓜 渐渗系材料：

DI＝∑(Sini)/N；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i＝病情分级的各个级别，N＝ 调查总株数，发病级别si的分级标准为：0级无根结；1级1～2个根结和卵块；2级3～10个根 结和卵块；3级11～30个根结和卵块；4级31～100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵块。

所述的南方根结线虫卵接种感病番茄品种‘苏粉2号’前以单卵块接种法进行纯化。

所述的接种步骤前还包括黄瓜材料的育苗步骤和移苗步骤，具体方法如下：

育苗：将获得的各株系黄瓜种间杂交渐渗系浸种，置于恒温培养箱中28℃催芽，待胚根长至 0.3～0.7cm时将种子播于装有灭菌营养土的穴盘中；

移苗：待幼苗长到两叶一心时，将幼苗移入装有经高温灭菌营养土的塑料钵中。

所述的高温灭菌营养土为草炭和蛭石1∶1混合，并经121℃灭菌所得。

所述的接种步骤具体方法为待幼苗长到3～4片真叶时接种，接种参照陈劲枫(2001)的方 法，用竹棒在根周围钻2个直径0.6cm、深2～3cm的孔，每孔加1mL含1000个虫卵的接种 液，接种量为2000卵/株，接种后温室温度控制在25℃～28℃，进行正常的肥水管理，即每三 天浇一次水，用市售磷酸二氢钾肥料一周浇一次肥。

黄瓜抗南方根结线虫材料的筛选鉴定方法，包含以下步骤：

1)病原物繁殖与保存  将南方根结线虫卵接种到感病番茄品种‘苏粉2号’上，于温室中进行 繁殖保存备用，每3个月转接一次；

2)病原物分离  将番茄的根从植株上剪下，冲洗干净，然后将含有卵块的根切成1-2mm的 小段，按1g病根加100ml的比例加入0.5％的次氯酸钠盐溶液，充分振荡2～4min，使病根中 的卵从卵块中解脱出来，迅速依次过60、200及500目筛过滤，洗下的卵再立即用自来水清洗 干净，得到卵液后取1ml进行镜检，利用计数皿确定其浓度；

3)接种  待黄瓜幼苗长到3-4片真叶时接种南方根结线虫卵液，接种量为2000卵/株，接种 后温度维持在25℃～28℃，进行正常的肥水管理；

4)鉴定  接种8周后将所有植株的根剪下，去掉根上的基质，将根洗干净后调查统计每株根 系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，并判断黄瓜材料对南方根结线虫的抗性：

DI＝∑(Sini)/N；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i＝病情分级的各个级别， N＝调查总株数，发病级别si的分级标准为：0级无根结；1级1～2个根结和卵块；2级3～10 个根结和卵块；3级11～30个根结和卵块；4级31～100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵 块；

0＜D I≤1为高抗南方根结线虫材料；1＜D I≤2抗南方根结线虫材料；2＜D I≤3为中抗南方 根结线虫材料；3＜D I≤4感南方根结线虫材料：D I＞4为高感南方根结线虫材料。

其中，所述的南方根结线虫卵接种感病番茄品种‘苏粉2号’前以单卵块接种法进行纯化。

所述的接种步骤前还包括：黄瓜材料的育苗步骤和移苗步骤，具体方法如下： 育苗：将黄瓜材料浸种，置于恒温培养箱中28℃催芽，待胚根长至0.3～0.7cm时将种子播于 装有灭菌营养土的穴盘中；

移苗：待幼苗长到两叶一心时，将幼苗移入装有经高温灭菌营养土的塑料钵中。

所述的高温灭菌营养土为草炭和蛭石1∶1混合，并经121℃灭菌所得。

所述的接种步骤具体方法为待幼苗长到3～4片真叶时接种，接种参照陈劲枫(2001)的方 法，用竹棒在根周围钻2个直径0.6cm、深2～3cm的孔，每孔加1mL含1000个虫卵的接种 液，接种量为2000卵/株，接种后温室温度控制在25℃～28℃左右进行正常的肥水管理，即每 三天浇一次水，用市售磷酸二氢钾肥料一周浇一次肥。

本发明的有益效果：

1)本发明首次利用种间杂交结合卵液接种的方法在黄瓜中培育筛选到抗南方根结线虫的 种质资源，这一研究不仅填补了黄瓜抗南方根结线虫的空白，而且为今后抗病基因转移、基因 定位、分子标记、基因克隆等提供了有用的遗传材料。

2)本发明通过接种鉴定得到黄瓜抗南方根结线虫渐渗系材料10299F-5具有很大的应用前 景。黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝14)是我国及世界上重要的蔬菜作物，由于其遗传基础狭 窄，栽培种间多态性低，因此必须通过种间杂交的方法来实现抗病基因的转育，本发明采用苗 期人工接种鉴定的方法，在种间杂交渐渗系中找到了抗南方根结线虫的渐渗系材料10299F-5， 这一研究不仅拓宽了黄瓜遗传基础，并选育出了抗南方根据线虫病的新品种。

3)通过田间观察，黄瓜新品种10299F-5对南方根结线虫表现出抗性，植株长势强，节间 长8.9～12.0cm，茎粗0.5～0.6cm，叶片浅绿色，平均叶面积389.85cm2，主蔓长2.70m，主蔓节数 29～30节，瓜长16.0～22.5cm，粗4.8～5.5cm，瓜色浅绿色，瓜型呈圆筒型，瓜刺棕色稀疏，主侧 蔓均可结瓜。因此，黄瓜渐渗系10299F-5可作为优良的抗病品种用于生产，也可作为亲本配制 杂种一代种子。

4)本发明黄瓜抗南方根结线虫材料的筛选鉴定方法不仅可以筛选鉴定黄瓜材料的南方根 结线虫抗性，还为其它植物的接种鉴定提供参考，而且为今后黄瓜品种的改良、抗病基因转移、 基因定位、分子标记、基因克隆等提供了有用的实验手段。

附图说明

图1抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料10299F-5的培育技术路线图

图2分离得到的南方根结线虫卵块形态。

图3接种南方根结线虫时的黄瓜幼苗。

图4接种南方根结线虫后抗、感植株的田间表现，其中左图为南方根结线虫侵染后的抗病株 10299F-5，右图为南方根结线虫侵染后的感病对照北京截头。

图5接种南方根结线虫后抗、感植株不同根部症状，其中左图为南方根结线虫侵染后的抗病株 10299F-5，右图为南方根结线虫侵染后的感病对照北京截头。

具体实施方式

实施例1

黄瓜根结线虫病是一种世界性病害，严重影响黄瓜产量与品质，全球每年因此而造成的损 失高达1000亿美元，年损失率约10％^[4]，目前黄瓜栽培种中尚未发现抗南方根结线虫的种质资 源，本发明以黄瓜种间杂交渐渗系为材料，采用根结线虫卵液接种法，对不同株系的渐渗系材 料进行了抗性鉴定，结果发现编号10299F-5的材料抗南方根结线虫，病情指数为2.0，我们应 运本发明的方法获得了抗南方根结线虫的黄瓜材料，培育技术路线图见图1，具体过程如下：

1.黄瓜渐渗系的获得

野生种酸黄瓜(Cucumis hystrix，2n＝24)为短日照植物，且生长初期长势较慢，因此要较普通 栽培黄瓜提前2个月播种，并对其进行40d以上的光照处理，使得两者花期相遇，以栽培黄瓜‘北 京截头’为父本，野生种酸黄瓜为母本杂交，获得杂种F₁，杂种F₁通过胚胎拯救结合体细胞无 性系变异对其染色体进行加倍，加倍后获得种间双二倍体新种，命名为Cucumis hytivus，以双 二倍体新种为母本，与栽培品种‘北京截头’回交1～2代，然后再自交3～5代获得其多代回交自交 后代群体株系，即黄瓜种间杂交渐渗系，体细胞染色体鉴定结果表明其染色体数与普通栽培黄 瓜相同，2n＝14。

2.黄瓜渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定

1)线虫病原物由南京农业大学植物保护学院线虫实验室提供，采自田间自然发病的蔬菜 地块，形态见图2，以单卵块接种法进行纯化。

2)将纯化后的卵接种到感病番茄品种‘苏粉2号’上，于温室中进行繁殖保存备用，每3个月 转接一次。

3)将番茄的根从植株上剪下，轻轻抖去根上的基质，用自来水冲洗干净，然后将含有卵 块的根切成1-2mm的小段，置于大型三角瓶中，按1g病根加100ml的比例加入0.5％的次氯酸钠 盐溶液，充分振荡2～4min，使病根中的卵从卵块中解脱出来，迅速以60、200及500目的网筛过 滤(60目在上层)，洗下的卵再立即用自来水清洗干净，得到卵液后取1ml进行镜检，利用计数 皿确定其浓度。

4)将蛭石和草炭按1∶1比例混合均匀制得营养土，然后于121℃下高压灭菌2h。

5)将不同株系的黄瓜种间杂交渐渗系材料、抗病对照‘非洲角’(C.metuliferus)、感病对照 ‘北京截头’同时浸种，置于恒温培养箱中28℃催芽，待胚根长至0.5cm左右时将种子播于装有 灭菌营养土的穴盘中。

6)待幼苗长到两叶一心时，将幼苗移入装有经高温灭菌营养土的塑料钵中，塑料钵的规 格为10cm×18cm。

7)待幼苗长到3～4片真叶时接种，接种前将营养钵浇透水，接种参照陈劲枫^[10]的方法，用 竹管或硬质塑料管在根周围钻2个直径0.6cm、深2～3cm的孔，每孔加1mL含1000个虫卵的 接种液，接种量为2000卵/株，接种后温室温度控制在25～28℃进行正常的肥水管理，每三天浇 一次水，注意根系水分不能过多，用市售磷酸二氢钾肥料一周浇一次肥。接种南方根结线虫时 的黄瓜幼苗见图3。

8)接种8周后将所有植株的根剪下，轻轻抖去根上的基质，小心用清水将根洗干净后调 查统计每株根系的根结数及卵块数，判断病级，计算病级指数，并根据病级指数判断黄瓜材料 的抗性。

病级的分级标准为：0级无根结；1级1～2个根结和卵块；2级3～10个根结和卵块；3级 11～30个根结和卵块；4级31～100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵块；

病级指数计算公式：DI＝∑(Sini)/N，其中DI病级指数；si发病级别；ni相应发病级别的 株数；i＝病情分级的各个级别；N＝调查总株数。

抗抗性判断标准：高抗(HR)：0＜D I≤1；抗(R)：1＜D I≤2；中抗(MR)：2＜D I≤3；

感(S)：3＜D I≤4；高感(HS)：D I＞4。

鉴定后发现编号为10299F-5的渐渗系材对南方根结线虫表现出抗性，其病级指数为2.0，其 它材料病级指数在3～5之间，表现为感病，其中抗病对照‘非洲角’的病级指数为0.71，感病对 照的病级指数为4.86，分别表现为高抗和高感。接种南方根结线虫后抗、感植株的不同田间表 现见图4，接种南方根结线虫后抗、感植株根的不同症状见图5。

应用本发明获得的抗南方根结线虫病黄瓜渐渗系材料10299F-5，其性状优良，可以直接作 为育种材料，该材料生长势强，节间长8.9～12.0cm，茎粗0.5～0.6cm，叶片浅绿色，平均叶面积 389.85cm2，主蔓长2.7m，主蔓节数29～30节，瓜长16.0～22.5cm，瓜粗4.8～5.5cm，瓜刺棕色 稀疏，主侧蔓均可结瓜。此抗病材料的获得为今后研究黄瓜品种改良、抗病基因转移、基因定 位、分子标记研究、基因克隆等奠定了坚实的基础。

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