通过酵母细胞的碱水解和酸水解生产包含葡聚糖和甘露聚糖的糖类组合物

摘要

本发明涉及制备包含糖类成分的免疫刺激组合物的方法，该方法包括酵母细胞的水解和回收可溶成分的步骤。由此获得的包含糖类成分的组合物可作为食品或饮料组分掺入，或可用作治疗特定疾患的药物。

说明书

本发明涉及制备包含糖类成分(fraction)的免疫刺激组合物的方法， 该方法包括酵母细胞的水解和回收可溶成分的步骤。由此获得的包含糖类 成分的组合物可作为食品或饮料组分掺入，或用作用于治疗具体疾患的药 物。

发明背景

葡聚糖，特别是β(1-3)-葡聚糖，已经被非常广泛地研究，并已显示出 具有多种药理活性，包括但不限于，抗胆固醇血症活性、降血糖活性 (hypoglycaemic activity)和对免疫系统的刺激。因为这一原因，包含β- 葡聚糖的产物已经被用作家禽、动物、鱼或甲壳动物生产中的食品添加剂。 葡聚糖是不溶性聚合物。本发明揭示了包含增加量的水解的水溶性酵母糖 类和其他可溶分子的新的酵母衍生材料。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁主要包括β-连接的葡 聚糖，其主要是β(1-3)-连接的葡萄糖单元的骨架，具有经β(1-6)-键分支的 分子间和分子内的次要组分。现有技术中的酵母葡聚糖大部分是不溶于水 的聚合物。本发明揭示包含增加的量的不同水溶性水解酵母糖类和可溶α- 甘露糖材料以及具有特定分子大小的其他可溶分子的新的酵母衍生材料， 所述不同水溶性水解酵母糖类包括包含β6-连接的葡萄糖作为主要结构的 特定聚合物材料。

现有技术的酵母衍生材料已经描述为包括不溶性糖蛋白，或可能为寡 糖的甘露聚糖。本发明揭示了主要在低分子量多糖范围内的具有特定分子 大小的新α-甘露糖材料。在优选的实施方案中，可溶性α-甘露糖材料是主 要的糖组分。新的成分还具有有用的特征，包括透明性、减少的味道和气 味，特别是在由来自生产啤酒的废酵母产生酵母时。

因为在食品和酿酒工业以及工业级乙醇的生产中酵母的非常广泛的 使用，废酵母细胞是主要的工业副产物。酵母衍生的产物自身具有相当大 的商业价值，例如在诸如酵母提取物、调味剂、鲜味剂(诸如单磷酸鸟苷 和单磷酸肌酐)的产品中，在酶、精细化学品和用于生物化学和制药工业 的产品(诸如海藻糖、胸苷、核苷和核苷等)的制造中。来自酿酒工业的 废酵母是β-葡聚糖的主要来源。

此外，酵母的其他种类也用作β-葡聚糖或含有甘露糖的聚糖的来源， 包括但不限于酿酒酵母的其他酵母菌株，食品和饮料发酵过程中使用的其 他酵母，诸如酵母属(Sacchromyces species)，包括例如卡尔酵母 (Saccharomyces carlsbergiensis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis) 和念珠菌属菌株，诸如产朊假丝酵母(产朊假丝酵母)。所有这些酵母菌 株的产生可通过分批发酵或连续发酵，使用在食品级营养物中培养。

由酵母和其他生物体产生β-葡聚糖已经被广泛研究，且已知多种方法。 这些方法中大多数依赖于β(1-3)-葡聚糖在碱或在有机溶剂中的不溶性。主 要已知的方法是：

(a)用浓氢氧化钠高温提取，随后用酸高温提取，并用乙醇沉淀(例 如Manners，D.J.等人，Biochem.J.13519-30(1973)，Jamas，S.等人，美国专 利号4,810,646、5,028,703和5,250,436)。这些程序中许多需要酵母细胞的 预均化，且许多需要每个提取步骤的多次重复。

(b)用浓氢氧化钠提取，随后用酸高温提取，并且酶处理以修饰或 纯化葡聚糖(参见例如Masler，L.等人的捷克专利申请号890038，其报道 了通过碱-酸提取纯化β-D-葡聚糖，随后用具有淀粉酶活性的酶处理)。

(c)源自浓苯酚∶水(1∶1)自溶或酶降解酵母的酵母细胞壁制品提取 (参见Truscheit，E.等人例如美国专利号4,138,479)。

(d)用诸如异丙醇、乙醇、丙酮或甲醇的有机溶剂单独或在碱存在 下提取(参见例如日本专利公开号7051081、6340701、5295003和3002202； 欧洲专利申请号515216)。

已知酸治疗减少葡聚糖材料中的β(1-6)-键的数目，并且这导致粘度增 加。

酵母的细胞壁主要包括：

(i)具有β(1-6)-连接的葡聚糖的侧链的丝状不溶于碱的β(1-3)-连接 的葡聚糖。

(ii)具有β(1-6)-连接的葡聚糖的侧链的可溶于碱的β(1-3)-连接的葡 聚糖。

(iii)具有间隔β(1-3)-键的无定形可溶于酸的β(1-6)-葡聚糖。

(iv)连接于蛋白质的无定形可溶于碱的甘露聚糖。

分离β-葡聚糖的现有方法通常使用多步骤碱-酸提取过程。碱提取步骤 除去了大多数无定形甘露糖蛋白和葡聚糖材料，且随后的酸提取步骤除去 糖原，并从主要的丝状β(1-3)连接的葡聚糖除去大部分β(1-6)侧链。最 终的溶剂提取步骤有时用于除去脂质。

葡聚糖方法包括强碱提取和任选地弱酸处理，以获得主要不溶的β3- 连接的葡聚糖。本发明包括产生更易溶的材料的优选在升高的温度下的更 有效的酸水解，和增加溶解的碱水解，碱性反应被用于提取碱性可溶材料， 但没有除去而是保留了可溶成分。本发明还包括分离和/或分级分离步骤， 以除去例如包括β3-葡聚糖的不溶材料，且任选地将该不溶材料再循环到 水解步骤，以产生更加易溶的糖，并除去低分子量材料，诸如单糖，或低 分子量寡糖，或实际上所有的寡糖，并除去盐。应了解，酸和碱处理产生 盐。

清楚地是，考虑到用于一些应用的葡聚糖的零售价格，使用现有公开 的或授予专利的方法生产葡聚糖的成本不是商业上可行的。这些方法具有 至少一个主要缺点，它们的目标是仅产生丝状不溶于碱形式的葡聚糖。细 胞壁中存在的其他形式的葡聚糖和甘露聚糖以过程的副产物被除去。这些 表明可具有显著增加的葡聚糖收率，且可以是功能上重要的额外量的葡聚 糖。此外，在水解处理之后或之间，除去可溶组分，而保留不溶的大部分 β(1-3)葡聚糖。本发明的制备方法可用于产生可溶的β6-葡萄糖连接结构， 其包括糖或糖类材料，用于或用作免疫刺激和/或调节组合物。增加的溶解 度和β3-葡聚糖结构的量的减少可区别本可溶材料和已知的含β-葡萄糖的 材料。

甘露聚糖是包含甘露糖单元的聚合物。在酵母中，甘露聚糖与酵母细 胞壁的外表面中的蛋白作为muscigenous多糖缔合，并与细胞内膜中的蛋 白缔合。其通常占细胞壁干重的约20-50％。甘露聚糖以寡聚物或聚合物连 接于核肽链。复合物含有约5-50％的蛋白质。寡聚甘露聚糖直接键合于丝 氨酸和苏氨酸，而聚合甘露聚糖经N-乙酰葡糖胺键合于天冬酰胺。在甘露 糖蛋白复合物中，甘露糖单元通过α-1，6、α-1，2和α-1，3-键连接。本发明产 生浓缩的可溶甘露聚糖和甘露糖聚糖，它们具有有用的生物活性和在NMR 分析中不同的特征。

已显示甘露聚糖-寡糖(MOS)通过蛋白水解作用从酵母细胞壁释放。 蛋白水解产生的甘露聚糖可具有高分子量，含有变应原蛋白，并可能具有 大的分子量和差的溶解度。这种释放的MOS类型产品具有有限的有用性。 在一个具体的实施方案中，本方法可包括额外的酶促和蛋白水解的步骤。 应认识到，本方法中碱水解β-消除O-连接的和/或N-连接的甘露糖糖肽。 还应理解，该肽材料可具有产物结构的不利影响，并甚至具有不利的免疫 影响。

根据本发明的更易容和有用的甘露聚糖有效结合肠道的细菌性病原 体，并阻断它们在肠道中定居(colonize)的能力。例如大肠杆菌(E.coli)、 沙门氏菌(Salmonella spp.)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)在它们表面具有 结合甘露聚糖的甘露糖糖残基的蛋白质(凝集素)。本发明揭示了新的活 性糖类组合物，其包括大多数具有大于寡糖的分子量的聚糖，并能够多价 和寡价(oligovalent)呈递的寡糖表位。本方法还产生用于病原体结合的 大量的有用末端寡糖序列。寡价和多价糖表位用于针对感染的抗粘连疗法 和治疗或用于与细胞表面凝集素受体的相互作用的有用性是本领域公知 的，且经常综述于例如K-A.Karlsson和Beachey 1981的Nathan Sharon的 出版物中(Beachey，E.H.(1981)J.Infect.Dis.143，325-345)。多价聚糖用 于抗粘连，以防止病原体对患者组织的结合。通过定义，寡糖含有小于10 个单糖残基，Mw小于1700，而本材料含有大量大于约5000Da的糖。本 材料用于对抗病原体，和有害微生物，因为高化合价提高新的甘露糖聚糖 的结合和溶解度。

本领域明确需要糖类成分提取的快速和便宜的方法，其避免损失可溶 于碱的葡聚糖和甘露聚糖，提高了葡聚糖和甘露聚糖的回收，并产生生物 活性制品。

目前，我们已经惊奇地发现，含糖类成分的可溶免疫刺激组合物可使 用包含简单的两次水解步骤的程序分离，并获得具有高免疫刺激活性的可 溶产品的出色收率。水解可补充有酶或其他剂的处理，或机械、气动或流 体静力处理，或热处理，且必要时，糖类成分的性质可通过酸处理、均化 程度或通过改变使用的酶的类型来调整。

附图简述

图1.生产根据本发明的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的过程的 一个实施方案的流程图。

图2.生产根据本发明的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的过程的 另一个实施方案的流程图。

图3.可溶糖组分通过NMR的定量。将如实施例1所示制备的材料(A) 和商业上的酸水解的酵母材料的样品(B)溶解于重水。加入0.5μmol苯 丙氨酸甲酯(PheCOOMe)作为定量标准。示出通过积分定量的PheCOOMe 质子和酵母甘露聚糖的信号。

图4.在336nm分析2-AB衍生糖类成分的Superdex Peptide色谱。在 该系统中，2-AB衍生葡聚糖5000和葡聚糖1000标准品分别在10.5分钟 和15.8分钟洗脱。如图所示，由色谱面积计算MW＞5000Da和1000-5000 Da的材料的相对丰度。

发明概述

本发明涉及制备含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的方法，包括以下 步骤：

a)提供酵母细胞材料，

b)使所述酵母细胞材料经受碱水解和酸水解的步骤，以从酵母细胞 材料释放甘露聚糖和葡聚糖，且任选地中和所获得的材料和/或任选地对所 述材料脱盐，

c)从步骤ii)获得的材料分离可溶和不溶成分，并且任选地

d)使步骤iii)的可溶成分经受进一步的分级分离步骤，其中可溶成 分包括甘露聚糖和β-1，6葡聚糖，且其中可溶成分基本上无臭无味。

优选地，本发明涉及该方法，其中酵母细胞材料首先用酸处理。

优选地，本发明涉及该方法，其中步骤ii)中获得的材料进一步与水 溶液接触，并优选地在所述水溶液中混合。

优选地，本发明涉及该方法，其中酵母细胞材料是干含量的约5％至 50％，10％至30％，优选15％至25％，更优选17％至23％，更加优选19％ 至21％，且最优选约20％。

优选地，本发明涉及该方法，其中糖类成分包含小于0.1％w/w β-1，3 葡聚糖干物质，或基本上不含β1，3葡聚糖，或β1，3葡聚糖的量小于β1，6 葡聚糖的量的30％。

优选地，本发明涉及该方法，其中甘露聚糖和/或具有至少1,000Da 的分子量，或通过用至少500Da截留的膜超滤可分离的成分的去除来获 得。

优选地，本发明涉及该超滤方法，其中所述膜的截留是至少1000Da 或3000Da。

优选地，本发明涉及该方法，其中步骤iv)的可溶成分被浓缩。

优选地，本发明涉及该方法，其中浓缩用超滤进行。

优选地，本发明涉及该方法，其中所述碱水解在约9至约13，优选 约11至13之间，且更优选约12和13之间的pH下进行。

优选地，本发明涉及该方法，其中所述酸水解在约1至4的pH下， 优选在pH约2至约3下进行。

本发明涉及制备含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的方法，包括以下 步骤：

i)提供酵母细胞材料，

ii)使酵母细胞材料在pH约9至13和约10°至90℃的温度经受碱水 解约10分钟至8小时，且在pH约2至3和约30°至90℃的温度经受酸水 解约3至48小时，中和所述材料，任选地使所述材料与水溶液接触，

iii)从所获得的材料分离可溶成分，

iv)使步骤iii)的可溶成分经受超滤分级分离，且

v)缩减(reducing)经超滤的成分成固体材料。

优选地，本发明涉及该方法，其中所述可溶糖类成分从可溶成分分级 分离、离析、分离或纯化。在优选的实施方案中，这些被称为进一步纯化。

优选地，本发明涉及该方法，其中分级分离、离析、分离或纯化的进 行通过选自以下组成的组的方法或方法的任何组合：

选自以下组成的组的色谱方法：带电和或亲脂(疏水)杂质的吸收色 谱、分子排阻色谱、基质结合糖类的亲和色谱和/或相分离溶液方法；和/ 或

离心。

本发明涉及根据本发明的方法获得的可溶糖类成分和根据该方法获 得的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物，该方法任选地包括进一步的纯化 步骤。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其含有糖类成分，且其中糖类成分 包括甘露聚糖和β-1，6葡聚糖和小于1％的β-1，3葡聚糖干物质，且优选 地β3-葡聚糖的量小于β3-葡聚糖的50％，且其中所述组合物基本上无臭 无味。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述组合物包括干重的 0.001-10％，优选0.005-5％，更优选0.01-3％，且最优选0.01-1.5％的β1-6 葡聚糖。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述组合物包括1-50％，优选 2-50％，更优选3-50％，更加优选4-50％，更加优选4-40％，更加优选5-35％， 最优选5-25％或10-20％w/w干重的甘露聚糖。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述组合物包括比为14∶0.32， 或高于40∶1的甘露聚糖∶葡聚糖，或一种或多种β6-葡聚糖，或基于干重优 选小于20％w/w，更优选小于10％w/w，更优选小于5％w/w，更优选小 于4％，更加优选小于3.5％，更加优选小于2.5％，最优选小于2.3％的 甘露聚糖。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述组合物包括至少约14％ w/w，更优选至少约15％w/w，且更优选至少约22％w/w组合物干重的 量的可溶β-葡聚糖和甘露聚糖。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖和葡聚糖具有至 少500Da，更优选至少1000Da的分子量。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中当5000的Mw标志在约10.5 分钟、Mw标志在约15.8分钟从Superdex Peptide 10/300GL柱洗脱，且总 洗脱体积为18ml，柱长度30cm，且糖类作为还原末端的二氨基苯甲酰胺 标记的结构进行分析时，所述组合物包括在空体积和5000Da的己糖多糖 Mw标志位置之间洗脱的葡聚糖和甘露聚糖糖类材料作为主要部分，和任 选地，在1000和5000Da的Mw标志之间洗脱的材料作为次要部分。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述组合物包括约80mol％的 大于5000Da的材料，和约20mol％在1000和5000Da的Mw标志之间洗 脱的材料。

本发明涉及可溶免疫刺激组合物，其中所述组合物包括至少约91％ (w/w)、更优选至少95％w/w的大于5000Da的可溶甘露聚糖材料。

应理解，包括可溶的，尤其是溶解度为1％水溶液的称为甘露聚糖的 聚合α-甘露糖糖类的组合物不是公知的。聚合物通常大于10-mer，其为诸 如“MOS产物”的寡糖限制。本发明还揭示了新的可溶聚合6-葡聚糖和 它们与甘露聚糖的浓缩组合物。

本发明人具有先前PCT申请，描述了优化的酸溶质化的酵母产品，与 这些相比，本发明揭示了具有高于14％或甚至更高的较高的甘露聚糖和β6- 葡聚糖的糖含量的材料，而先前申请具有约2％的甘露糖材料。为了通过 相同方法提供更加准确的定量，先前的酸水解产物通过图3和实施例2中 的NMR对比，显示出先前的材料仅含有约12％的本发明的甘露糖材料。 此外，当先前的材料含有至少10％甘露糖寡糖时，在优选的成分中，本材 料实际不含有寡糖，因此通过包含碱/碱性水解的新过程，最有用的多价甘 露聚糖的量增加了约10倍。本发明还揭示了相对于甘露聚糖β6-葡聚糖比 相似地增加的较高甘露聚糖量，并由此改变组合物。

尽管来自发酵工业的废酵母在本发明的方法中特别有用，但应清楚地 理解，本发明适用任何来源，诸如在食品和发酵工业中使用的其他酵母。 这些包括但不限于在粘性赋予剂、乳化剂、纤维、薄膜、包衣物质、亲和 色谱和凝胶电泳的支持体的制备中使用的酵母、细胞培养基中使用的酵 母、滤板中使用的酵母和粘固剂中使用的酵母。它们还广泛用作食品增稠 剂，并用作膳食纤维的来源，并用作药品中的载体和包衣剂。本发明涉及 源自用于人类食品或饮料生产的发酵过程的酵母。优选类型的酵母包括源 自酒精工业的酵母，在优选的实施方案中，源自酿酒厂酵母和/或源自红酒 工业(vine industry)的酵母，在另一个优选的实施方案中，源自啤酒生产 过程的酵母残渣/废酵母。

术语“酵母”在本文中指具有用于通过根据本发明的方法制备免疫刺 激聚糖/糖类组合物的糖的可培养真核微生物，在优选的实施方案中，酵母 是真菌物种。

本领域技术人员将能够容易地确定最合适的条件，在该条件下，本发 明的过程可适用于其他酵母属。

本领域技术人员将注意到，对于使用本发明的方法制备的含糖类成分 的可溶免疫刺激组合物的一些应用，有利地以干形式提供。对该制品适当 的干燥是通过任何合适的方法，包括但不限于冷冻干燥、滚筒转鼓式干燥、 烘箱干燥、喷雾干燥、环式干燥(ring-drying)或使用薄膜形成设备干燥， 并且该制品可不经进一步的加工而使用，或可使用任何合适的技术碾磨成 优选小于20微米的粒度。对于其他应用，诸如粘稠的糊的湿产品是合适 的，且该制品可不经进一步的加工而使用，或在增加其粘性和减少粒度的 机械破碎后使用。

根据一个方法，本发明提供了通过本发明的方法制备的含糖类成分的 可溶免疫刺激组合物。根据本发明的干形式的含糖类成分的可溶免疫刺激 组合物优选包括β1-6葡聚糖(例如干重的0.001-10％，更优选0.005-5％， 且最优选0.01-3％，且最优选0.01-1.5％)和甘露聚糖(例如干重的1 -50％，更优选2-50％，更加优选3-50％，更加优选4-50％，更加优选 4-40％，更加优选5-35％，且最优选5-25％，更加优选10-20％w/w之间)， 其优选地为水溶形式，具有根据本发明的NMR特征。

该制品或组合物可优选包括β1-6和1-4，更优选β1-6葡聚糖和甘露 聚糖，和小于8％或优选基本上没有β1-3葡聚糖，或含有较少量的β1-3 葡聚糖。该组合物包括优选小于50％的β1-6葡聚糖的量的β3葡聚糖， 更优选小于30％的β1-6葡聚糖的量的β3葡聚糖，更加优选小于25％的 β1-6葡聚糖，优选从5至25％的β6-葡聚糖的量的β3葡聚糖。在优选的 实施方案中，通过积分NMR谱的信号分析糖类的量。

可单独使用含糖类成分的可溶免疫刺激组合物。然而，最常见地，将 提供与其他组分结合的该组合物。

因此，在本发明的一个方面，优选地实施方案包括但不限于用于营养 品或治疗的组合物，优选包括例如食品组合物、食品补充剂组合物、膳食 组合物、药物组合物(包括处方和OTC药物组合物)、临床营养组合物、 局部药物组合物、天然药物组合物、营养组合物和营养添加剂。本组合物 的目标是被需要该组合物的受治疗者或患者，优选被人类或动物，且最优 选被人类受治疗者使用。

本发明还涉及新的糖类成分在制备药物组合物和/或治疗组合物和/或 营养组合物的方法中的用途，优选当组合物的目标是用于需要免疫调节或 免疫刺激或抗感染治疗的受治疗者或患者。

因此，在本发明的这一方面，优选的实施方案还包括但不限于优选猫 或狗的宠物动物、牛、猪、家禽、鱼、甲壳动物或贝壳类动物的饲料组合 物，其包含含有本发明的糖类成分的可溶免疫刺激组合物和抗感染组合 物，以及一种或多种兽医可接受的食品组分；含有本发明的糖类成分以及 药学上可接受的载体的可溶免疫刺激组合物；药物组合物，其包含药学活 性剂，和含本发明的糖类成分的可溶免疫刺激组合物作为载体或佐剂，或 作为固体剂型(诸如片剂或胶囊)的包衣。含糖类成分的可溶免疫刺激组 合物还可应用于牛、宠物、家禽或动物的饮用水，或鱼、甲壳动物或贝壳 类动物的环境水。

本发明的其他实施方案包括动物饲料、食品补充剂、药物和营养制品， 它们包含由本发明的方法制备的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物。

应清楚地理解，本发明的组合物一般适合用于已知β-葡聚糖和甘露聚 糖对其有用的产品。在一些情况下，进一步的纯化可能是需要的或必要的， 且如果这样，可使用本身已知的纯化步骤。

发明详述

还应理解，本文引用的任何数字范围包括从下限值到上限值的所有 值。例如，如果浓度范围被陈述为1％至50％，则期望诸如2％至40％、10％ 至30％或1％至3％等的值被明确列入本说明书中。这些仅为具体所期望的 实例，且列举的最低值和最高值之间的所有可能的数值组合被认为是清楚 地陈述于本申请中。

除非另外说明，本说明书和权利要求中所使用的表达成分的量、反应 条件等的所有数字被理解为在所有的情况中，被术语“约”修饰。因此， 除非相反地说明，否则以下说明书和所附权利要求中列出的数字参数都是 近似值，其可基于寻求通过本发明获得的所需性质而变化。最后，且并不 试图限制与权利要求的范围等同的理论的应用，每个数字参数至少应该依 据报告的有效数字的数并通过应用普通舍入技术来解释。

本文使用的术语“含糖类成分的免疫刺激组合物”指含有糖类成分的 免疫刺激组合物，其刺激(例如具有对脊椎动物淋巴细胞促有丝分裂作用， 或诱导或增加脊椎动物淋巴细胞的细胞因子表达，和/或另外活化白细胞， 特别是巨噬细胞。

本文使用的术语“糖类成分”指通过本发明的方法获得的，并含有源 自本发明的酵母细胞材料的糖、寡糖和其他糖分子的可溶成分。

如本文和所附权利要求中所用，“味觉”应该指任何味觉，其为成、 苦、甜、酸(sour)、碱、鲜味(umami)、涩、刺激(tangy)、干、辛辣(sharp)、 冷、热、灼烧、酸(acidic)、香辣(spicy)、辣(pungent)和/或金属味(metallic)。 这种味觉应该包括任何和所有的味觉，以及任何和所有的余味。另外，该 列表并未全部包括本领域技术人员所知的。

本文使用的术语“基本上无味”指化合物或组合物在开始摄取时，基 本上无味。

本文使用的术语“基本上无气味”指化合物或组合物在开始鼻接触或 通过鼻吸入时，基本上无气味。

根据本发明的物质或药物组合物可以任何合适的方式施用，尽管优选 使用口服施用。

本文使用的术语“治疗”同时指为了治愈或缓解疾病或疾患的治疗， 和为了预防疾病或疾患的发展的治疗，还指预防性治疗。在优选的实施方 案中，预防性治疗是减少病原体载量的抗粘连预防性治疗，在另一优选的 实施方案中，预防性治疗是细胞因子或趋化因子表达增加的免疫调节治 疗。治疗可以快速方式或长期方式进行。

本文使用的术语“患者”指需要根据本发明的治疗的任何人类或非人 哺乳动物。

糖的命名基本上依照IUPAC-IUB生物化学命名委员会的推荐。键是指 端基异构体结构和键位置，或对于根据本发明的结构，缩短形式例如β1，3、 β(1，3)或β1-3、或β1-3或β3的含义相同。假设Glc(葡萄糖)、Man(甘露 糖)、Gal、GlcNAc、GalNAc、NeuAc和NeuGc具有D构型，Fuc具有L 构型，且所有的糖以吡喃糖形式存在。

根据本发明，可将在适合于治疗由于病原体(诸如病毒或细菌)存在 引起的疾患的药物组合物中的根据本发明的物质，任选地连同载体引入患 者，在优选的实施方案中，引入患者的胃肠道或呼吸道，或将根据本发明 的物质用于这种疾患的治疗方法。根据本发明可治疗的疾患的实例是传染 病和腹泻。

根据本发明的药物组合物还可以包括其他物质，诸如惰性媒介物，或 药学上可接受的佐剂、载体、防腐剂等，它们是本领域技术人员公知的。

此外，根据本发明的物质可与优选目标为免疫刺激治疗和/或抗粘连治 疗的其他药物或治疗物质或组合物一起施用。

此外，可使用根据本发明的物质，以通过筛选结合根据本发明的物质 的序列，鉴别一种或多种粘附素。所述序列可以是例如蛋白质或糖。糖结 合蛋白可以是凝集素或糖结合酶。例如，可通过亲和色谱或亲和交联方法， 进行筛选。

通过抗粘连的抗感染治疗

根据本发明的更加可溶和有用的甘露聚糖有效结合肠道的细菌病原 体，并阻断它们定居在肠道的能力。例如，大肠杆菌、沙门氏菌和霍乱弧 菌在它们的表面具有结合到甘露聚糖的甘露糖糖残基的蛋白(凝集素)。 一部分发明人已显示人类胃肠道含有结合甘露糖的引起腹泻的病原体(诸 如引起腹泻的大肠杆菌)的受体，其还具有结合包含甘露糖聚糖，特别是 Manα3Man的结构(PCT FI2003/00528)的受体。本发明揭示了新的活性 糖类组合物，其包括大多数具有大于寡糖的分子量的聚糖，并能够多价和 寡价(oligovalent)呈递寡糖表位。本方法还产生用于病原体结合的大量 的有用末端寡糖序列。寡价和多价糖表位用于针对感染的抗粘连疗法和治 疗或用于与细胞表面凝集素受体的相互作用的有用性是本领域公知的，且 经常综述于K-A.Karlsson和Beachey 1981的Nathan Sharon的出版物中 (Beachey，E.H.(1981)J.Infect.Dis.143，325-345)。多价聚糖用于抗粘连， 以防止病原体对患者组织的结合。微生物的粘连是感染发病的第一步，其 中传染原的粘附素的特异性以及由宿主靶组织的上皮细胞表达的受体结 构，诸如聚糖结构，是病原体的宿主范围和组织嗜性的重要决定因素。为 了治疗由于病原体存在于患者的胃肠道引起的疾病或疾患，可能使用根据 本发明的物质用于抗粘连，即抑制在患者的肠上皮中，病原体对受体的结 合。当施用根据本发明的物质或药物组合物时，其将与结合细菌的受体竞 争，并且然后，胃肠道中存在的细菌的全部或一些将结合于根据本发明的 物质，而不是胃上皮上的受体。然后，附连于根据本发明的物质的细菌将 通过肠，并离开患者，产生细菌对患者健康的减少的影响。

根据本发明，通过抗粘连和免疫刺激，可治疗由致泻病原体的存在引 起的疾病，特别是腹泻。

通过免疫刺激的治疗

本发明涉及免疫刺激治疗，优选以刺激用于预防病原体的免疫系统。 在优选的实施方案中，这一免疫刺激的目标是诱导抗病原体微生物(诸如 病毒、细菌和/或真菌)的白细胞，诸如巨噬细胞。在另一个优选的实施方 案中，免疫刺激被用于平衡免疫反应，以预防有害的疾患(harmfull  contition)，诸如自身免疫疾患和/或变应性疾患。免疫刺激的平衡通常涉及 特异性T辅助淋巴细胞群体的活化和失活。在优选的实施方案中，免疫刺 激的介导是通过特异性因子，包括趋化因子或细胞因子分子，诸如白介素 和/或干扰素，且免疫刺激的作用可测量为因子的变化，和/或白细胞的抗 微生物作用。

本文使用的术语“组合物”指可由人口服摄取施用于人的组合物、棒 剂、丸剂、胶囊、可由陪伴动物口服摄取施用于陪伴动物的组合物、陪伴 动物的补充物、宠物食品、狗粮、猫粮、零食(treats)、饼干、生皮(raw  hide)、零食(treats)、口香糖(chews)、充填剂、肉汁、调味品、饮料、 补充水及其组合。组合物可以是潮湿的、含水的和/或干的。

除非另外说明，本文使用的所有百分比、份和比是按总组合物的重量 计。有关列出的成分的所有这种重量是基于有效水平，并因此不包括商业 上可获得的材料中包含的溶剂或副产物，除非另外说明。

用作酵母细胞材料的本发明的合适酵母属包括但不限于酵母属的酵 母菌株和酿酒酵母的酵母菌株(包括面包酵母菌株和啤酒酵母菌株)、脆 壁克鲁维酵母和念珠菌菌株，诸如产朊假丝酵母，及其组合。为含糖类成 分的可溶免疫刺激组合物的合适来源的，用于并用作酵母细胞材料的酵母 的其他菌株优选地包括食品级酵母物质，诸如德尔布酵母(Saccharomyces  delbruekii)、玫瑰酵母(Saccharomyces rosei)、微球酵母(Saccharomyces  microellipsodes)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵 母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces  lactis)、多孢克鲁维酵母(Kluyveromyces polysporus)、白色念珠菌(Candida  albicans)、阴沟念珠菌(Candida cloacae)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、 吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、温奇汉森酵母(Hansenula wingei)、 arni汉森酵母(Hansenula arni)、亨氏汉森酵母(Hansenula henricii)、美 洲汉森酵母(Hansenula Americana)及其组合。这些酵母菌株可使用在食 品级营养物中培养，通过分批发酵或连续发酵来生产。

具体地，根据本发明的方法涉及制备含糖类成分的可溶免疫刺激组合 物的方法。在一个示例性实施方案中，该方法或生产或过程包括提供酵母 细胞材料，例如啤酒酵母(通常是干含量的5％至50％，5％至40％，10％ 至30％，具体是15％至25％，且更具体是17％至23％或19％至21％，且 最优选干含量的约20％)的第一步骤，随后使酵母细胞材料经受碱和酸的 水解步骤，以从酵母细胞材料释放甘露聚糖和葡聚糖。

在优选的实施方案中，使用啤酒酵母或啤酒酵母膏。这种酵母材料包 括植物源不溶材料，特别是含植物多糖(诸如半纤维素糖类)的植物源不 溶材料和植物源β-葡聚糖材料，诸如谷物β葡聚糖，优选地，谷物是在酿 酒过程中使用的谷物，最优选大麦。在另一个优选的实施方案中，由啤酒 酵母产生的材料包括大量的啤酒酵母材料，并不含植物糖类或仅包含少量 的植物糖类。在另一个优选的实施方案中，用基于植物的或植物源的材料 发酵的任何酵母适合用作酵母细胞材料。

碱水解和酸水解的反应条件

本发明涉及能够改善可溶产物的味道和气味的碱反应，优选当该碱水 解与酸水解组合进行时。本发明还涉及碱水解和酸水解的组合，此时碱处 理能够提高可溶甘露聚糖的量，在优选的实施方案中，这是通过消除反应 引起N-连接的聚糖的释放，和/或通过β消除反应释放O-连接的聚糖。

这些反应减少结合于聚糖的肽/蛋白，并提高产物的质量。已知聚糖肽 键可通过多种碱切割，例如通过约0.1-0.2M NaOH和数小时至约48小时 的培育，或在升高的温度，诸如约50-70摄氏度下持续约0.5至8小时， 优选在50-60摄氏度下持续约2-8小时，这是优选的条件，假设将pH调节 至约13的相应值，这是因为酵母材料的缓冲能力。

碱水解可能适合于在至少9，至少9.5，具体地至少9.7，且更具体地 至少10，更具体地至少10.5，且更具体地至少11.5的pH下进行。碱水解 可能适合于在pH约11至约14，优选pH约12至约13，最优选pH约12.5 下进行。碱水解可能适合于在约9.0和11之间的pH，或约11.0和13之间 的pH或约9.0和13之间的pH下进行。

用于水解的优选的碱试剂是氢氧化钠，可使用其他食品可接受的碱材 料，诸如其他碱金属氢氧化物，特别是氢氧化钾KOH，或碱土金属氢氧化 物，优选Ca(OH)₂或Mg(OH)₂或其混合物，或碳酸盐，诸如钠(Na)₂CO₃或 钾(K)₂CO₃或碳酸钙CaCO₃，或在具体的实施方案中，为氨NH₃。啤酒酵 母材料优选含钠的碱试剂。在具体的实施方案中，该过程包括磷酸离子的 产生，诸如通过磷酸的酸水解，并且还包括以下步骤，其中将其脱盐和/ 或中和和/或通过碱的碱水解，并沉淀出盐，诸如Ca(OH)₂沉淀磷酸盐为磷 酸Ca²⁺。沉淀脱盐步骤在分离步骤中进行，分离出沉淀的磷酸盐和不溶材 料，或在分级分离步骤前进行。

酸水解可能适合于在小于4.5，具体地小于3.5，且更加具体地小于2.5 的pH下进行。酸水解可能适合于在pH约1至4，优选pH约2至约3， 更优选pH在约2.1和2.8之间，更优选pH在约2.2和2.7之间，最优选 pH约2.3、2.4或2.5下进行。

进行优选碱水解和酸水解两者的温度可能适合于至少优选在升高的 温度下进行，优选至少30℃，更加优选40℃，更加优选至少45℃，至少 50℃，具体地至少60℃，更具体地至少70℃，且更加具体地至少75℃。

在优选的实施方案中，碱水解步骤的进行是在0℃至100℃的温度， 更优选在0℃至60℃的更低温度范围，且更加优选10℃至约90℃，且 在优选的实施方案中，从10℃至约50℃。碱水解特别优选接近50℃的温 度，30℃至65℃，更优选40℃至55℃，且更优选45℃至55℃，尤其是 在啤酒酵母和氢氧化钠的情况下。

进行水解反应的时间从数分钟，例如5分钟(特别对于碱水解)到数 天(对于酸水解)。

在优选的实施方案中，酸水解进行至少2小时，具体地至少3小时， 更具体地至少5小时，具体地至少6小时，且更具体地至少7至8小时， 且更具体地至少8-24小时。水解可能适合进行小于48小时，更优选小于 32小时或更优选小于24小时，更优选小于12小时，具体地小于10小时， 且更具体地小于9小时。在优选的实施方案中，水解进行2至6小时，优 选3至5小时，且最优选约4小时。

酸水解优选在pH约2至3的酸，和约30℃至90℃的温度下进行2至 48小时。

在优选的实施方案中，碱水解进行至少1分钟，更优选至少5分钟， 更优选至少10分钟，更优选至少30分钟，更优选至少约10分钟至1小 时，更优选15分钟至45分钟，20分钟至约40分钟或约30分钟。

在另一个优选的实施方案中，增加反应时间，并使用降低的温度和/ 或碱浓度，且反应持续至少1小时，更优选至少1.5小时，更具体地至少 2小时，更具体地至少3小时，具体地至少4小时，且更具体地至少5至 8小时，且更具体地至少1-4小时或至少1-8小时。水解可能适合进行小于 48小时，更优选小于24小时，更优选地小于12小时，具体地小于10小 时，且更具体地小于9小时。在优选的实施方案中，水解进行1至6小时， 优选1至5小时，且最优选约1-3小时。

应认识到，诸如55℃或更高的温度可加强焦糖化反应，且对某些产 物不利，需要较少颜色的焦糖化产物的产物优选在较低温度下进行较长的 反应时间。

碱水解可能适合进行至少10分钟、30分钟、1小时、具体地至少2 小时，和至少3、4、5、6、7或8小时。水解可能适合进行小于12小时、 具体地小于10小时，且更具体地小于9、8、7、6、5、4或3小时。酸水 解可能适合进行1至8小时，2至6小时，优选3至5小时，且最优选约 4小时。酸水解可能适合进行至少30分钟、1小时、具体地至少2小时， 和至少3、4、5、6、7或至8小时。

在优选的实施方案中，碱水解的进行是通过在pH约9至13和约10℃ 至90℃的温度下，使酵母细胞材料经受碱水解约10分钟至8小时。

反应中酸的优选浓度

本发明涉及最少量的酸和碱的使用。该过程中酸的优选最终浓度依据 反应混合物中干物质的量。在优选的实施方案中，作为干物质酵母粗材料 的量是约5-70％，更优选5-50％，更优选5-30％，更加优选10-25％，更加 优选15-25％或约20％。应认识到，来自发酵过程的优选浓缩废酵母，诸 如废啤酒酵母的使用浓度包括诸如干重的约20％的优选的酵母干重的量。 在另一实施方案中，中度浓缩为干重的约30％，或在另一实施方案中，高 度浓缩为干重的约40％。优选的中度浓度范围为干重的20％至40％，更优 选22％至38％，更优选25％至35％，更加优选干重的27％至33％。优选 的高浓度范围为干重的30％至60％，更加优选干重的30％至50％，更加优 选32％至48％，更加优选35％至45％。在优选的实施方案中，本过程包括 优选的酸水解和碱水解，并使用酵母干物质的优选浓度，更优选中度或高 浓度范围，或其任何组合。优选高浓度以改善过程有效性和能效。

应认识到，酸的最佳效果的获得是通过向酵母材料加入浓酸和或碱， 进而调节酵母材料的pH。浓酸或碱可具有0.1至10M，优选0.5M至约8 M的浓度。酸或碱的浓度高于每反应体积所需施用的酸浓度几个数量级。

本发明涉及优化的约0.1至0.75M的低酸量，更优选0.1-0.5M，和与 浓缩粗材料一起使用的至的较高酸量，或以较低pH范围(例如pH 0.5-1.5) 和约0.5M至1.5M，更优选0.75M至1.25M的较高浓度。在优选的实施 方案中，使用低酸量和磷酸。应认识到，优选每反应体积较高的施用浓度 (最终浓度)为约0.3M至约2.0M，更优选约0.3M至约1.5M，优选约0.5 M至约1.5M，或0.75M至1.25M的较高量，以获得优选的聚糖的较高溶 解。

优选的强无机酸；盐酸、硫酸或磷酸(H₃PO₄)的优选的施用的最终 浓度是约0.3M至约2.0M，更优选约0.3M至约1.5M，优选约0.5M至约 1.5M或0.75M至1.25M，并获得聚糖的较高溶解，此时反应在约80摄氏 度的温度(优选70-100摄氏度之间，更加优选70和95摄氏度之间，更加 优选75和85摄氏度之间)下进行。优选的反应时间是约4小时，优选2 至8小时，更优选3至5小时，最优选3.5至4.5小时。在优选的实施方 案中，使用最终浓度范围，以将pH调节至优选的值，优选在pH 1.5-4.0 之间，更优选在2.0和3.5之间，更加优选在2.0和3.0之间。

优选地施用碱以获得优选的pH。每反应体积施用的碱浓度优选约0.01 M至约10M，更优选约0.050M至约5.0M，更优选约0.05M至约4.0M。

优选的酸包括无机酸，诸如磷酸(H₃PO₄)、盐酸和硫酸。在优选的实 施方案中，该酸是磷酸(H₃PO₄)。

应认识到，如果温度增加，则酸/碱的量和反应时间可能降低，反之亦 然。

所得材料如果水解步骤的后期包括酸，则优选使用碱中和，如果后期 水解步骤包括碱，则用酸中和。酸和碱优选适合于人类或动物使用，优选 食品级。

在优选的实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中至少酸水解和碱 水解以及任选的中和步骤是在一个容器或反应器中进行。应认识到，这有 益于增加效力，并减少该方法的成本。

来自水解步骤的，含有不溶和可溶成分两者的，优选被中和的所得材 料在水解步骤中使用的物质中的较低干物质含量/浓度进一步稀释，并使材 料与水溶液接触合适的时间，优选约30分钟至约2小时，更优选约45分 钟至1h 15分钟，和最优选约1小时。水解的，且优选中和的材料与水溶 液的接触，增强了材料的可溶组分的溶解(参见图1和2)。

在可选择的实施方案中，在水解步骤之前，将酵母细胞材料分离成不 溶和可溶组分，对分离的酵母细胞材料组分进行碱和酸的水解，并将可溶 成分从水解的酵母细胞材料分离，并合并可溶成分。在合并可溶组分之前， 将两种组合与水溶液接触，以增加可溶成分的溶解。本发明的可选择的实 施方案显示于图2。

在可选择的实施方案中，酵母细胞材料首先用碱处理，任选地中和， 分离不溶和可溶组分，并对分离的组分进行酸水解步骤。应认识到，在较 高酸量和/或较高反应温度和/或较长反应时间的条件下，优选地水解不溶 材料。酸水解后，合并可溶组分。合并可溶组分之前，两种组合可与水溶 液接触，以增加可溶成分的溶解。

在可选择的实施方案中，酵母细胞材料首先用酸处理，任选地中和， 分离不溶和可溶组分，并对分离的组分进行碱水解步骤。应认识到，在较 高碱量和/或较高反应温度和/或较长反应时间的条件下，优选地水解不溶 材料。碱水解后，合并可溶组分。合并可溶组分之前，两种组合可与水溶 液接触，以增加可溶成分的溶解。

在另一实施方案中，酵母细胞材料可分离成可溶和不溶组分，其可用 根据本发明的水解步骤处理，并且例如在中和步骤之前或之后，可以合并 由此获得的材料，接触水溶液，混合并分级分离成可溶和不溶成分。由此 获得的可溶成分包括根据本发明的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物。

优选地中和的，并任选地稀释于低干物质含量/浓度的水解步骤中使用 的物质中的所得材料优选地通过离心或过滤，被分离成可溶和不溶成分， 并将(水)溶液不溶材料弃去或再循环到水解步骤中(参见图1和2)。

获得的可溶成分可经受分级分离步骤，通过色谱方法和/或相分离溶液 方法和/或具有某些尺寸排阻标准的超滤。色谱方法包括但不限于带电和或 亲脂(疏水)杂质的吸收、尺寸排阻色谱或亲和色谱。

可进行具有1000Da、2000Da或3000D的尺寸排阻或截留或更高分 子量截留的超滤。优选的截留为约1000Da，更优选的截留为约3000Da， 且最优选的截留为约2000Da。滤掉盐、降解杂质和其他小分子，诸如糖 类单体，并将免疫刺激糖类组分保留在分级分离并浓缩的可溶成分中。

优选的分级分离方法包括具有合适容量且可分级分离优选的分子的 工业方法，优选凝胶过滤、超滤或沉淀，更加优选沉淀或超滤。

优选的沉淀方法包括用溶剂，优选地在低温下从来自水解步骤的任选 地含大量的盐的酸水解和碱水解产物，或从脱盐产物沉淀。

进行优选的分级分离，以从产物分离较低活性的分子，低分子量成分， 优选地，低分子量分子小于约500-5000Da。在优选的实施方案中，被分 离的低分子量分子具有低于500Da的分子量，更加优选地具有低于约1000

Da的分子量，更加优选地具有低于约2000Da的分子量，更加优选地具有 低于约3000Da的分子量。本发明揭示了，与葡萄糖聚合物标准定义的 Mw相比，主要部分的活性糖类分子基本上大于5000Da。因此，在具体 的实施方案中，优选增加分级分离步骤(例如过滤)的速度，并通过除去 更大分子(优选具有低于约4000Da的分子量)，甚至是除去具有低于5000 D的分子量的分子的方法，除去低分子量材料。应认识到，截留水平2000 和3000除去作为单价分子无用的寡糖，和产物的特性结构不需要的肽， 并除去低于2000的低Mw成分，或在优选的实施方案中。

本发明尤其涉及通过尺寸分级分离过程产生的新的分级分离的产物， 该尺寸分级分离过程基本上使得分子具有高于除去的低分子量成分的分 子量，优选至少高于500Da，更加优选高于1000Da，更加优选高于2000Da 或最优选高于3000Da，且在高制备功效过程的具体实施方案中，除去低于 5000Da或更优选4000Da的Mw的成分。

通过迫使由本文描述的过程产生的提取物，诸如可溶成分在压力下通 过超滤器，可进行超滤步骤。超滤器适当地包括一个或多个半透膜。半透 膜或超滤器可具有例如至少1000Da，具体地至少1500Da，且更加具体地 至少2000Da的分子量截留。在一些实施方案中，对于高功效方法，可优 选使用至少3000Da，甚至截留4000或更大，更加优选截留5000Da或更 大。应理解，超滤器可具有本文引用的那些之间的任何值的分子量截留， 包括但不限于500Da、1000Da、1500Da、2000Da、2500Da和3000Da的 分子量截留，且在具体的实施方案中，3500Da、4000Da、4500Da和5000Da 的分子量截留。合适的超滤器膜包括但不限于可购自A/G Technology Corp， Needham，Mass的中空纤维膜，或Millipore的纤维素膜滤器。应认识到， 本领域技术人员可使用可用的滤膜和合适的分子量标准，测试并优化用于 在超滤中分离所需的低分子量成分的合适截留，所述分子量标准优选包括 具有己糖单糖残基的糖分子量标准。

在优选的实施方案中，分子滤器截留是实践值，类似于纤维素膜截留， 更优选Mw 1000Da的Millipore纤维素膜，或3000Da的Millipore纤维 素膜，或在其他优选的实施方案中，截留对应于与具有以下标称截留(基 于具有Mw 1000和3000的膜的截留)的相应膜相似的截留：500-2500Da， 更优选500-2000Da，更优选1000-2000D和更高范围(接近截留3000)， 2000-5000Da，更优选2000-4000之间或更优选2500和3500Da之间。应 认识到，超滤膜可截留次要部分的低Mw分子，并允许高Mw分子通过。

超滤步骤可任选地包括使可溶成分通过不同分子量截留的两个或更 多个超滤器。最终成分包括富集的糖类组合物，其中大多数糖类具有在超 滤器的分子量截留之间的分子量，对于这样的成分，下限是根据本发明除 去的较低Mw成分的大小。

可溶成分可进一步经受分级分离步骤，以纯化、离析或分离糖类成分。 纯化、离析或分离可以与以上或实施例中所描述地相似方式进行。

根据本发明获得的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物基本上无臭无 味。当在制备食品补充剂、药物和营养制品中使用含糖类成分的可溶免疫 刺激组合物时，这些特征是有用的。根据本发明获得的无臭无味(免疫刺 激)糖类成分可用于制备食品补充剂、添加剂、药物和营养制品。

根据本发明的可溶免疫刺激组合物的糖类成分通常包括甘露聚糖、β 1，6葡聚糖和小于8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％或0.05％ 的β-1，3葡聚糖干物质。在一个更优选的实施方案中，糖类成分基本上不 含β-1，3葡聚糖。

以上描述的这一示例性过程显示于图1的流程图和图2中的可选择的 过程。

在含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的制备的优选的实施方案中，该 方法包括以下步骤，提供酵母细胞材料，优选啤酒酵母细胞材料，并使酵 母细胞材料在pH约12至13和约20°至60℃或约60°至90℃的温度下经 受碱水解约0.5至5小时，并在pH约2至3和约70°至90℃的温度下经 受酸水解约3至5小时，随后中和所得材料，使材料与水溶液接触，从而 增强可溶组分的溶解，优选在水解步骤中使用的酵母细胞材料中的低浓度 或干物质含量，将可溶和不溶成分从获得的材料分离，并使前述步骤的可 溶成分经受超滤分级分离，优选使用约1000至2000或3000Da的截留， 并将超滤成分缩减成固体材料。

本发明的制品和组合物和成分的干燥可通过任何合适的方法，包括但 不限于冷冻干燥、滚筒转鼓式干燥、烘箱干燥、喷雾干燥、环式干燥及其 组合和/或使用薄膜形成设备干燥，且可使用任一种而不用进一步加工，或 可使用任何合适的技术碾磨。

在一个实施方案中，酵母细胞材料可以被破碎，或该方法的各步骤中 的任何材料可以用热处理和/或机械处理、气动处理和/或流体静力学处理， 从而增加糖类成分的溶解度，和/或从酵母细胞材料释放甘露聚糖和葡聚 糖，和/或从该方法的任何步骤中获得的材料释放甘露聚糖和葡聚糖。在本 发明的方法的步骤i)之前，可均化酵母细胞材料，例如啤酒酵母或啤酒 酵母细胞膏。在一个可选择的实施方案中，对于本发明的方法中获得的任 何材料可进行物理均化和/或热处理，或气动、机械和/或流体静力处理。

优选的纯化、离析或分级分离方法包括除去主要的非糖类组分的一部 分，诸如1)脱盐，在优选的实施方案中，通过沉淀盐，诸如通过钙或其 他离子沉淀磷酸盐，或使用超滤，2)通过特异性吸附剂，诸如疏水或离 子交换基质除去离子性分子或疏水性分子，和/或3)除去不溶材料。

纯化或分离增加糖类成分的糖类含量。在强磷酸水解后，超滤脱盐增 加了制品中糖类的量。优选地，优选通过超滤获得的，并含有糖类成分的 可溶成分基本上无味无臭，并且非常适合于食品添加剂和补充剂，和饮料 和药物组合物。

可溶糖类成分的分级分离、纯化或离析

本发明还涉及包含一种或几种糖类的具有增加的生物和免疫刺激活 性的纯化的或富集的糖类成分。

优选的纯化方法包括以下及其组合：

a)色谱方法，诸如

i.吸收带电和或亲脂(疏水)杂质的色谱

ii.尺寸排阻色谱，特别是除去低分子量杂质的凝胶过滤

iii.具有结合糖类或其部分的基质的亲和色谱，优选活性炭载色谱

和/或

b)相分离溶液方法，诸如用溶剂提取和/或沉淀杂质或糖类。在优选 的实施方案中，使用有机溶剂用于沉淀，优选醇或酮，诸如甲醇或乙醇， 更优选乙醇；或丙酮用于沉淀优选尺寸的糖类。

和/或

c)离心及溶液与沉淀的分离

和/或

d)化学或酶促方法，以降解所需组分，优选温和的碱水解以降解碱 不稳定的杂质，和/或含Glcα的糖原/淀粉型糖类的酶促水解。

溶剂，例如以上提到的那些，可用于沉淀和/或洗涤本方法的任何步骤 中的材料。在一个实施方案中，碱水解步骤在溶剂(优选醇，诸如乙醇) 的存在下进行。

在一个实施方案中，在制备含本发明的糖类成分的可溶免疫刺激组合 物的方法期间，酶可被用于降解细胞组分和/或增强糖类的提取。

酶促步骤可在碱性pH，例如至少8.5，具体地至少9，且更具体地至 少9.2的pH下利用高pH蛋白酶。pH还可适当地为小于10.5，具体地小 于10，且更加具体地小于9.5。蛋白酶处理可适合于在至少45℃，且具体 地至少50℃的温度下进行。蛋白酶处理可适合于在小于70℃，具体地小 于65℃，且更具体地小于60℃的温度下进行。蛋白酶处理可适合于进行 至少5小时，具体地至少8小时，更具体地至少10小时，更加具体地至 少12小时。蛋白酶处理可适合进行小于48小时，具体地小于36小时， 更具体地小于24小时，且更加具体地小于18小时。在蛋白酶酶促步骤之 前或之后，用葡萄糖淀粉酶(例如来自曲霉属)、淀粉酶(例如来自枯草 杆菌(Bacillus subtili)、米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶；来自黑 曲霉(Aspergillus niger)或根霉(Rhizopus mold)的淀粉葡萄糖苷酶)和/ 或脂酶(例如来自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、皱褶念珠菌 (Candida rugosa)和爪哇毛霉(Mucor javanicus)的脂酶；通常按重量计 为约0.05％-1％)孵育，用葡萄糖淀粉酶、淀粉酶和/或脂酶孵育适合在中 性至略酸性的pH和升高的温度下进行。例如，pH的范围可适合于从至少 3.5，具体地从至少4，且更具体地从至少4.5开始。例如，pH的范围还可 适合于从小于7，具体地小于6，且更具体地小于5.5开始。进行用葡萄糖 淀粉酶、淀粉酶和/或脂酶孵育的温度可适合于从至少40℃，具体地至少 45℃，且更具体地至少50℃开始。温度可适合于从小于70℃，具体地小 于65℃，更具体地小于60℃开始。可适当使用至少60℃、至少65℃、 至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃或至少90℃的温度，特别 是如果蛋白酶、淀粉酶或脂酶是热稳定的酶。还可在用碱性蛋白酶孵育之 后或之前，用葡萄糖淀粉酶和脂酶的组合、淀粉酶和脂酶的组合或葡萄糖 淀粉酶、淀粉酶和脂酶的组合孵育。

适当地，高pH蛋白酶在pH高于7时具有最佳的蛋白水解活性。合适 的蛋白酶包括但不限于从以下获得的那些：猕猴桃(Actinidia chinensis)、 菠萝(Ananas comosus)、曲霉属(例如黑曲霉、黑曲霉变种awamori、米 曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、蜂蜜曲霉(A.melleus))、杆菌属(例如枯草 杆菌、嗜碱芽胞杆菌(B.alcalophilus)、解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、迟缓芽胞杆菌(B. lentus)、藓样芽胞杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B. stearothermophilus)、嗜热溶蛋白芽孢杆菌(B.thermoproteolyticus))、番 木瓜(Carica papya)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、栗疫菌 (Endothia parasitica)、无花果(Ficus glabrata)、乳酸克鲁维斯酵母、桔青 霉(Penicillum citrinum)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、雪白根霉 (Rhizopus niveus)，来自牛、羊或牛的胃，或猪的胰腺，及其组合。合适 的蛋白酶包括但不限于市售的酶，诸如枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶 BPN′、枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶 168、Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Durazym^TM、Esperase^TM和Kannase^TM(购自Novo Nordisk A/S)；Maxatase^TM、Maxacal^TM、 Maxapem^TM、Optimase^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(购自Genencor International Inc.)；和Validase^TM AFP、Validase^TM  FP浓缩物、Validase^TM FP 500、Validase^TM FP II、Validase^TM TSP浓缩物、 碱性蛋白酶浓缩物、菠萝蛋白酶(购自Valley Research，South Bend，Ind.) 及其组合。

合适的淀粉酶包括植物、动物、细菌或真菌源的那些淀粉酶，及其组 合。淀粉酶包括但不限于获自以下葡萄糖淀粉酶或α-淀粉酶：杆菌属(例 如藓样芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、枯草杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌)、米 曲霉、黑曲霉、黑曲霉变种awamori(Aspergillus niger var.awamori)、蛾 微杆菌(Microbacterium imperiale)、绿色热单孢菌(Thermomonospora  viridis)、大麦芽(大麦属)、猪的胰腺(猪属Sus spp.)，及其组合。有用 的淀粉酶的实例包括但不限于市售的淀粉酶，诸如葡萄糖淀粉酶浓缩物、 Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(购自Novo Nordisk A/S)； Rapidase^TM和Purastar^TM(购自Genencor International Inc.)；和Validase^TM  BAA、Validasem^TM HT340L、Validase^TM FAA、Validase^TM AGS、Validase^TM  GA、Validase^TM RGA(购自Valley Research，South Bend，Ind.)，及其组合。 淀粉酶可适当地以至少0.001％，具体地至少0.01％，且更加具体地至少 0.02％的最终浓度使用。淀粉酶可适当地以小于0.1％，具体地小于0.05％， 且更加具体地小于0.1％的最终浓度使用。

本发明中有用的脂酶包括但不限于来自以下的脂酶：腐质霉属 (Humicola)(同义词嗜热真菌Thermomyces)，例如来自柔毛腐质霉(H. lanuginosa)(疏绵状嗜热丝孢菌T.lanuginosus)、特异腐质霉(H.insolens)； 假单胞菌属脂酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞 菌(P.pseudoalcaligenes)、洋葱假单胞菌、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、萤 光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705、威斯康辛假单胞菌 (P.wisconsinensis)；杆菌脂酶，例如来自枯草杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌或 短小芽胞杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)；米曲霉、黑曲霉、溶脂念珠 菌(Candida lipolytica)、皱褶念珠菌、爪哇毛霉、娄地青霉(Penicillum  roqueforti)、米赫根毛霉、德氏根霉(Rhizopus delemar)、雪白根霉、米根 霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)，及其组合。市售的 脂酶包括但不限于Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novo Nordisk A/S)，以 及真菌脂酶8000和胰腺脂酶250(购自Valley Research，South Bend，Ind.)。

新的组合物

组合物结构的研究是通过实施例2所示的NMR，和实施例3中的色 谱。

本发明涉及新的可溶免疫刺激组合物，其含有糖类成分，且其中糖类 成分包括甘露聚糖和β-1，6葡聚糖和小于1％的β-1，3葡聚糖干物质，优 选β3-葡聚糖的量小于β6-葡聚糖的50％，且其中组合物基本上无臭无味。

优选的糖类组合物是在水中可溶的，优选至少95％可溶，更加优选98％ 可溶，更加优选99％可溶，且最优选100％可溶，至少为1％w/w溶液，在 优选的实施方案中，也为1.5％或2.0％的溶液。在优选的实施方案中，组 合物在水中的总溶解度在98％和100％之间，优选100％，为1％w/w溶 液。

发明人使用NMR谱来揭示根据本发明的可溶甘露聚糖和b6-葡聚糖组 分的量。NMR用内标校准，并且如实施例2和图3所示，依据揭示以下 组分的NMR谱的积分分析单糖表位的量。优选的组合物包括难溶的β1-6 葡聚糖，为0.001-10％，更优选0.005-5％，更加优选0.01-3％，且最优选 0.01-1.5％w/w，且在优选的实施方案中，干重的约0.32％。

优选的组合物包括新的可溶甘露聚糖，为干重1-50％，更优选2-50％， 更加优选3-50％，更加优选4-50％，更加优选4-40％，更加优选5-35％， 最优选5-25％或10-20％，且在优选的实施方案中，为约14％w/w。

数据揭示了与增加可溶分子的量的优化的酸水解方法相比，该方法明 显增加了组合物中可溶甘露聚糖而非β6-聚糖的量。在优选的实施方案中， 新组合物包括4.4μmol对0.016μmol(14％对0.32％)的比的可溶甘露聚 糖和β6-葡聚糖。相比于仅使用酸水解并产生少得多的甘露糖聚糖的方法 相比，这是非常不同的配比(ration)。

从本发明的方法获得的糖类成分包括14∶0.32或高于40∶1的比的甘露 聚糖∶葡聚糖，或β6-葡聚糖或β-葡聚糖，或以干重计优选小于20％w/w， 更优选小于10％w/w，更优选小于5％w/w，更优选小于4％，更加优选 小于3.5％，更加优选小于2.5％，且最优选小于2.3％的甘露聚糖。

在优选的实施方案中，可溶β-葡聚糖和甘露聚糖的量为组合物干重的 至少约14％w/w，更优选至少约15％w/w，且其可通过优化和/或除去淀 粉而被明显增加，优选至少至19％w/w。

从本发明的方法获得的产物包括以干固体计(w/w)，总产物的至少约 10％，具体地至少约14％，更具体地至少15％的糖类，更加具体地至少约 16％的糖类。其中糖类是可溶β-葡聚糖和α-甘露糖寡/多糖材料，优选基本 上为多糖。组合物任选地包括约5％至50％，优选10-25％的可溶淀粉残 基。在优选的实施方案中，例如通过淀粉酶处理，除去淀粉，并因此增加 可溶β-葡聚糖和α-甘露糖寡/多糖材料的量。

从本发明的方法获得的糖类成分包括以干固体计，总细胞壁β6-葡聚 糖和α-甘露聚糖糖类的至少75％，具体地至少80％和更具体地至少85％的 甘露聚糖。

在一个具体的实施方案中，从本发明的方法获得的糖类成分包括以干 固体计，总糖类的至少1％，具体地至少2％，更具体地至少2.2％和更具 体地至少2.3％的β1-6葡聚糖。

产品还适合包括以干固体计，总细胞壁β6-葡聚糖和α-甘露聚糖糖类 的小于8％，具体地小于2％，更具体地小于1％，更具体地小于0.5％， 更具体地小于0.1％，更加具体地小于0.06％的β1-3-葡聚糖。

产品还适合包括以干固体计，总组合物质量的小于8％，具体地小于 2％，更具体地小于1％，更具体地小于0.5％，更具体地小于0.1％，更加 具体地小于0.05％，更加具体地小于0.01％的β1-3-葡聚糖。

如图3和实施例2所示，NMR数据还揭示了可溶a-甘露聚糖的主要 结构特征。该组合物包括末端Manα3(Manα2)_mManα6-和Manα2Manα6-和 Manα2(Manα2)_nManα6结构，其中m和n独立地是1至10的整数，且Manα6- 结构可形成包括Manα6-残基的聚合物的多价载体，且优选地存在约等摩尔 量的Manα2-和Manα3-非还原末端结构，优选地与从NMR谱所观察到的 相似。

新的可溶甘露聚糖和葡聚糖的大小分布

糖类成分中总甘露聚糖的至少80％(w/w)，具体地至少85％(w/w)， 更具体地至少90％(w/w)，更加具体地至少91％(w/w)可具有大于3000 Da的分子量。

在优选的实施方案中，甘露聚糖和葡聚糖具有至少500Da，更优选至 少1000Da的分子量。

如图4所示，还参见实施例3，发明人还通过凝胶过滤色谱研究了优 选的组合物，且当5000的Mw标志在约10.5分钟、Mw标志在约15.8分 钟从Superdex Peptide 10/300GL柱洗脱，且总洗脱体积为18ml，柱长度 30cm，且所述糖作为还原末端的二氨基苯(2-AB)标记的结构进行分析 时，优选的组合物包括在空体积和5000Da的己糖多糖Mw标志位置之间 洗脱的葡聚糖和甘露聚糖糖类材料作为主要部分，和任选地，在1000和 5000Da的Mw标志之间洗脱的材料作为次要部分。

实施例3中分析的数据揭示了，优选的组合物包括至少约50％，更优 选至少约70％，更加优选至少约73％，更优选至少约80mol％，且在优 选的实施方案中，至少约85％，更优选至少约87％的大于5000Da的材 料，和约13-20mol％在1000和5000Da的Mw标志之间洗脱的材料。

基于摩尔量和分子量分布，可评价本组合物包含非常少量的寡糖材 料，尤其是在具有1000Da的截留，且更加优选具有2000Da或3000Da 的截留的凝胶过滤后。按重量计，该组合物包括至少约91％(w/w)的大 于5000Da的可溶糖类，优选甘露聚糖材料，包括根据本发明的全部三种 α-甘露聚糖类型，更优选至少95％w/w，更加优选至少97％w/w，更优选至 少98％w/w，且最优选至少95％w/w。应认识到，对于针对可溶寡糖组合 物而优化的发明人的先前PCT专利申请的酸水解产物，这是非常困难的， 所述酸水解产物包括优选至少超过10％的具体甘露聚糖寡糖。

具体地，本发明的优选的较高分子量的多糖组合物包括小于10％更优 选小于5％，更优选小于2％w/w的Manα3Manα2-甘露糖寡糖或在12-16分 钟之间洗脱的为非衍生糖类的其他甘露糖糖类，此时计算为总的含 Manα3Manα2-甘露糖的糖类的比例。

如凝胶过滤实验所示，本发明揭示了可能产生具有相对分子量的可溶 多糖。优选的组合物包括在Superdex柱的空体积洗脱的主要部分的糖类材 料，和在空体积在约7分钟的高峰肩(high shoulder of the peak)洗脱的另 一主要部分，如图4所示。本发明涉及在实施例3的凝胶过滤和标记实验 条件下，具有与如图4所示2AB标记的轭合物相似的吸光度特性曲线和吸 收率的可溶多糖材料。

具体实施方案

本发明涉及根据本发明的新的组合物，结构的分子量高于4000Da或 5000Da，且材料溶于水。

本发明涉及的新的组合物呈基本上干的形式。应认识到，干形式的组 合物尤其有用。优选至少当生产或包装组合物时，干形式含有优选小于 30％，更优选小于20％，更加优选小于10％，且最优选小于5％的水。

本发明涉及包含根据本发明的组合物的食品补充剂、药物或营养制 品。

本发明涉及选自以下的组的包含根据本发明的组合物的治疗组合物： 药物、具有药物活性的临床营养组合物、用作药物的具有药物活性的营养 治疗组合物。

本发明涉及根据本发明的治疗组合物，其中该组合物用于预防或治疗 其中需要免疫调节活性的疾病，和/或用于针对病原体的抗粘连治疗。

本发明涉及权利要求中任一项所述的组合物在制备用于治疗需要免 疫调节治疗或抗粘连治疗的疾患的药物中的用途。

本发明涉及包括向患者施用本发明的治疗组合物的步骤的治疗方法。

根据本发明的制品和组合物被认为在例如食品补充剂、药物(例如改 善免疫反应)、动物饲料和营养制品中具有价值。例如，治疗组合物或药 物、食品或动物饲料可适当地含有0.050g至50g，更优选0.1g至30g的 制品/kg食品或饲料。适当地，按重量/重量计，制品可占食品或饲料总重 量的至少0.005％，具体地至少0.01％，更具体地至少0.02％，更具体地至 少0.05％，且更加具体地至少0.1％，且小于5％，具体地小于2％，更具体 地小于0.5％，且更加具体地小于0.3％。合适的动物饲料包括但不限于牛、 马、猪、家禽、鱼(例如甲壳动物、贝壳类动物)、鸟和宠物(例如猫、 狗)饲料。液体组合物可含有按重量计0.1％-1％的根据本发明的制品。根 据本发明的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单独的糖类成分还具有 许多用途。例如含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单独的糖类成分可在 动物饲料工业中使用，其有利地具有结合真菌毒素并还结合病原细菌的能 力，防止细菌在肠道中定居。

在优选的实施方案中，本发明涉及高度有效的治疗/药物/食品/饲料组 合物，其含有小于2％(重量/重量)的根据本发明的组合物，更加优选小 于1％，且最优选小于0.5％，在优选的实施方案中，活性浓度在 0.0001％-2％之间，更加优选0.001％-1％之间，更加优选0.001％-0.5％之间， 更加优选0.001％-0.1％之间，更加优选0.001％-0.05％之间，更加优选 0.001％-0.04％之间，更加优选0.001％-0.025％之间，且更加优选 0.001％-0.01％之间。这些高度有效的浓度特别优选地用于免疫调节。在优 选的实施方案中，抗粘连的组合物以5倍的先前浓度应用，例如在0.0005％ -10％，0,005-5％，和0.005％-0.2％，和0.005％-0.05％之间，或以10倍 的先前浓度应用，例如0.0010％-20％，和0.010-10％，和0.010％-0.4％ 和0.01％-0.1％。在产物是补充剂的情况下，浓度优选地计为人类患者或 动物使用的最终制剂浓度。应认识到，具有增加的量的有效化合物的本组 合物可以较低剂量使用，减少了成本和可能的治疗副作用。

例如，包括根据本发明制备的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单 独的糖类成分的(食品)补充剂可适合于用作动物和人类的食品和饮料、 药物或软化剂、减少胆固醇的剂中的免疫刺激剂。如果加入到软化剂、洗 液或乳膏，并用于治疗疾患，则含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单独 的糖类成分可适当地以至少0.05％，具体地至少0.1％，且更具体地至少 0.5％，且小于10％，具体地小于5％，且更具体地小于2％的浓度(w/w) 存在。适当地，根据本发明制备的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单 独的糖类成分可用于治疗湿疹，例如通过掺入乳膏、洗液或软化剂。湿疹 包括多种炎症皮肤疾患，包括特应性皮炎(“特应性湿疹”)，并且影响约 10％至约20％的儿童期的世界人口。湿疹显示为机体免疫系统的异常反应。

因此，在本发明的一个方面中，优选的实施方案包括但不限于用于营 养或治疗的组合物，优选包括例如食品组合物、食品补充剂组合物、膳食 组合物、包括处方和OTC药物组合物的药物组合物、临床营养组合物、 局部药物组合物、天然药物组合物、营养组合物和营养添加剂。组合物的 目的是用于需要该组合物的受治疗者或患者，优选用于人类或动物，且最 优选用于人类受治疗者。认为，根据本发明的药品或药物的定义包括处方 药和OTC药，治疗性临床营养组合物、局部药物组合物、天然药物组合 物、具有治疗作用的营养组合物和具有治疗性的营养添加剂。

还可能将根据本发明的物质用于人类和动物的食物或营养组合物，例 如用于食品、牛奶、酸奶酪或其他乳制品，饮料组合物和婴儿配方食品。 本文描述的营养组合物或食物不是天然的人乳。优选地将根据本发明的物 质用作所谓的功能或功能性食品的一部分。所述功能食品通过免疫刺激作 用，或通过抑制或防止病原体与靶细胞或组织(尤其在胃肠道中)的结合， 而对人或动物的健康具有积极的作用。根据本发明的物质可以是限定的食 品或功能食品组合物的一部分。功能食品可含有被视频管理当局(如美国 的食品和药品管理局)所接受的其他已知食品成分。根据本发明的物质还 可以用作营养添加剂，优选地用作食品或饮料添加剂，以生产功能食品或 功能饮料。食品和食品组合物或补充剂含有至少一些固定的主要营养物， 诸如脂肪、蛋白质和糖，和优选地少量需要的营养物，诸如维生素、矿物 质和盐。

本发明还涉及新的糖类成分在制备药物和/或治疗和/或营养组合物的 方法中的用途，优选当组合物的目标是用于需要免疫调节或免疫刺激或抗 感染治疗的受治疗者或患者。

包含通过本发明的方法生产或制备的含糖类成分的可溶免疫刺激组 合物或单独的糖类成分的本食品添加剂或(功能食品)补充剂可口服或肠 内施用。包含含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的食品添加剂或补充剂将 要施用的形式(例如粉剂、片剂、胶囊、悬浮液、溶液、乳剂)将依据患 者和特定的治疗。所施用的制品、补充剂或组合物的量将基于个体来确定， 并将部分基于对以下的考量：受治疗者的疾患、受治疗者的总体健康和待 治疗或缓解的免疫刺激病症的严重性。

包含含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单独的糖类成分的补充剂 或添加剂可在室温或低温时，以液体或固体形式口服施用，或可通过饲管 肠内施用。含糖类成分的可溶免疫刺激组合物，或含该可溶免疫刺激组合 物的任何补充剂或添加剂可单独施用，在生物可接受的载体(例如盐水或 水)中与其他成分(诸如维生素和矿物质)一起施用，或作为完全营养食 品(complete-nutritional food)的一部分施用。例如，含糖类成分的可溶免 疫刺激组合物或单独的糖类成分可作为高纤维液体食品中的组分口服施 用，通过连续或间歇滴注到饲管(例如鼻胃、鼻十二指肠、空肠)肠内喂 养。包含含本发明的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物或单独的糖类成分 的制品，或包含其的任何补充剂或添加剂，可任选地包括其他组分，这将 主要通过组合物所施用的方式来确定。例如，以片剂或粉剂形式口服施用 的制品或组合物除了含糖类成分的可溶免疫刺激组合物之外，还包括填充 剂(例如玉米淀粉、蔗糖、乳糖)、粘合剂(例如羧甲基纤维素、阿拉伯 树胶、明胶)、佐剂、调味剂、着色剂和/或包衣材料(例如蜡或增塑剂) 和/或其他营养补充剂。以液体形式施用的包含含糖类成分的可溶免疫刺激 组合物的制品可包括通过本发明的方法制备的组合物，和任选地，乳化剂、 稀释剂(例如水、无菌盐水)和/或着色剂或调味剂，或合并到将口服或通 过到消化道的饲管施用的完全喂养配方中。完全喂养配方可包含所有的营 养需求。例如，这种用于口服或肠内施用的喂养配方可含有本发明的方法 制备的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物、水、糖来源(例如蔗糖、水解 玉米淀粉)、油(例如玉米油或大豆油)、选定的维生素来源(例如胆碱、 氯化物、抗坏血酸、乙酸维生素E、烟酰胺、泛酸钙、硫胺、核黄素、叶 绿醌、维生素B12、维生素D₃)；选定的矿物质来源(例如柠檬酸钾、氯 化镁、磷酸三钙、柠檬酸钠、氯化钾、硫酸锌)；蛋白质来源(例如大豆 蛋白分离物、酪蛋白酸钙)和卵磷脂。

进一步纯化

本发明还涉及根据本发明的方法获得的可溶糖类成分，或通过对所述 成分的进一步纯化步骤获得的可溶糖类成分。进一步纯化可优选地选自以 下的组：通过色谱方法优选疏水或离子交换或反相方法或进一步的大小分 级分离除去蛋白质、脂质、芳族分子或离子型分子。进一步纯化的优选目 的是将甘露聚糖和/或b-聚糖材料任选地与可溶淀粉组分分离。在一个具体 的实施方案中，淀粉被淀粉酶降解，在优选的实施方案中，在至少一个水 解步骤之后，优选在酸水解之后，且通过根据本发明的分级分离或单独的 分级分离除去所得葡萄糖和/或低聚麦芽糖(malto-oligosaccharides)。

本发明还涉及糖类成分在用于人或动物的免疫刺激中的用途，和用于 制备在人或动物中用于免疫刺激和/或抗粘连的食品或饮料或治疗剂或药 物或药品的用途。

本发明还涉及根据本发明的方法，还包括在人或动物的食品或饲料中 使用步骤iii)或iv)的可溶成分。

本发明还涉及根据本发明的方法，还包括在选自食品补充剂、药物、 化妆品和营养制品的产品中使用步骤iii)或iv)的可溶成分。

本发明还涉及可溶酵母源的组合物，其包括根据本发明的糖类成分或 进一步纯化的糖类组合物，其用于人或动物中的免疫刺激，和/或用于制备 用于人或动物中的免疫刺激的食品或饮料，优选其中食品是固体食品或乳 制品或包括牛奶组分的食品或婴儿配方，或其中饮料是治疗性饮料或乳饮 料产品或婴儿配方，或用于通过加入液体产生乳饮料产品或婴儿配方的组 合物。

使用酸和碱的高收率过程

一般方法

高于pH 9的碱水解

优选的方法包括与强酸水解组合的碱处理。

优选的碱处理包括最终反应pH高于8，更优选高于9，更优选高于9.5， 更加优选高于10，更加优选高于11，更加优选高于11，更加优选高于12， 更加优选13或更加优选高达13.5的处理碱溶液。碱条件的优选范围是从 pH 9至14，更优选从9.5至13.5变化。碱处理的时间是10分钟至24h， 更优选0.5h至18h，对于短反应，更加优选1h至12h，在优选的实施方 案中，1小时和8小时之间，且在另一个优选的实施方案中，对于快速反 应，在1小时和6小时之间，更加优选1.5小时和3.5小时之间，最优选 约2.25小时，边际+/-1小时、+/-0.5小时、+/-0.25小时。优选的长反应 在8-30小时之间，更优选8-24小时之间，更优选8-20小时之间。

优选的碱性反应温度在0-100摄氏度之间，更优选10-90摄氏度之间。 温和反应的优选的温度是从0-60摄氏度，优选10-60度之间，对于最低范 围(在包括洗涤反应的实施方案中)，优选10-45度之间，优选15-40度之 间，更优选18-35度之间，最优选20-30摄氏度之间，且对优化的温和反 应避免降解的较高范围在35-60摄氏度之间，更优选40-60度之间，更优 选45-60摄氏度之间。优选的较高范围是60-100摄氏度之间，更优选65-100 摄氏度之间，更优选70-100摄氏度之间，更优选70-95摄氏度，且最优选 70-90摄氏度之间，或约80摄氏度+/-边际7度、更优选5度且最优选4度。

碱水解的优化和酸/碱水解的顺序

实施例12和13显示出实施例提供了用于制备的高效高收率水解方 法，和优化的碱水解作用表1和表2显示的高甘露糖含量。

一般方法

优选的方法包括与强酸水解组合的碱处理。

包括洗涤的用强碱的温和反应

碱处理包括的温和碱条件具有优选低于或接近室温的范围，包括0至 60摄氏度，更优选10-45度之间，且在其之内。温和条件包括用不溶解多 糖的溶剂洗涤，所述溶剂包括优选地相当安全的溶液和无毒性溶剂(诸如 醇，优选乙醇)，其包含含有碱的溶液，例如pH 9-14之间，更优选pH 9-13 之间，更优选pH 9-12.5之间，更优选pH 9.5-12之间，更优选pH 10-12 或约11.0。反应时间非常快，从0.1h至3h，或更优选0.5-2h，或快速反 应在1小时和6小时之间，和其中优选的范围。优选的醇是乙醇，溶剂的 功能是保持多糖呈固态，通过具有一些水解和洗涤作用。碱(诸如碱性氢 氧化物，诸如NaOH)的浓度优选在1mM或1M之间，优选约0.1M范 围+/-0.7M(即0.3-1.7M)，更优选+/-0.5M，更优选+/-0.3M。乙醇的浓 度优选在65-95％之间，更优选在70-90％之间，更优选在73-87％之间，更 优选在75-85％之间，或约80％。调节乙醇的浓度，将碱保持在溶液中。

表2显示了用碱洗涤可令人惊讶地增加酸水解甘露聚糖产物的纯度约 15％至约20％。这将相当大地增加收率。在具体地实施方案中，在酸水解 之后进行碱洗涤。

中强碱水解处理

本发明揭示了中强碱性反应有效地产生了高纯度的聚糖组合物。例 如，实施例14和表2显示了，根据实施例12，在其中酵母材料首先在pH

10然后在pH 2.5水解的过程中，获得了甘露聚糖的最高相对量(纯度)， 提取产物的23.5％(w/w)。如实施例13所描述，当水解步骤逆转，也获 得了19.3％(w/w)的高纯度的甘露聚糖。

在不同的优选的实施方案中，本发明涉及其中首先酸水解，随后碱水 解的反应，且在其他实施方案中，优选首先进行碱水解，然后酸水解。优 选中强碱水解，这是由于纯甘露聚糖的高收率和有限的副反应，诸如显色 反应。

中强碱水解的进行是在例如pH 8.5-14之间，更优选在pH 8.5-13，更 优选在pH 9-12.5，更优选在pH 9-12，更优选在pH 9.0-11.5，更加优选在 pH 9.0-11，或约10，具有0.7，更优选0.5和最优选0.3pH单位的+/-边际 (例如pH 9.7和10.3之间)。优选地，较高温度范围内的中强碱水解的反 应温度是在60-100摄氏度之间，更优选在65-100摄氏度之间，更优选在 70-100摄氏度之间，更优选在70-95摄氏度，且最优选在70-90摄氏度之 间，或约80摄氏度，具有7度，更优选5度和最优选4度的+/-边际。反 应时间是10分钟至24h，更优选0.5h至18h，对于短反应，更加优选1h 至12h，在优选的实施方案中，1小时和8小时之间，且在另一个优选的 实施方案中，对于快速反应，在1小时和6小时之间，更加优选1.5小时 和3.5小时之间，最优选约2.25小时，边际+/-1小时、+/-0.5小时、+/-0.25 小时。在不同的实施方案中，优选的长反应在8-30小时之间，更优选8-24 小时之间，更优选8-20小时之间。

强碱水解处理

本发明揭示了强碱性反应有效地产生最高量的优选的聚糖组合物。例 如，实施例14和表2显示了用pH 13的最高碱性条件获得了优选的甘露聚 糖的最高总收率，和总提取物的最高量。

强碱水解的进行例如在pH 11-14之间，更优选在pH 11.5-14之间，更 优选在pH 11.5-14之间，更优选在pH 12-14之间，更优选约13，具有0.7， 更优选0.5，且最优选0.3pH单位的+/-边际(例如pH 9.7和10.3之间)。

优选地，限定了强碱水解的反应温度和时间。在不同的优选的实施方 案中，本发明涉及其中首先进行碱水解，随后酸水解的优选的反应(在实 施例12和13中最高甘露聚糖总收率超过5％)，且在其他实施方案中，优 选地，首先进行酸水解，然后碱水解。优选强碱水解反应，这是由于相对 纯的甘露聚糖的最高收率。

优选的反应中的酸浓度

本发明涉及最少量的酸和碱的使用。该过程中，酸的优选的最终浓度 依据反应混合物中干物质的量。在优选的实施方案中，作为干物质的酵母 粗材料的量为约5-70％，更优选5-50％，更优选5-30％更加优选10-25％， 更加优选15-25％或约20％。应认识到，来自发酵过程的优选浓缩废酵母， 诸如废啤酒酵母的使用浓度包括诸如干重的约20％的优选的酵母干重的 量。在另一实施方案中，中度浓缩为干重的约30％，或在另一实施方案中， 高度浓缩为干重的约40％。优选的中度浓度范围为干重的20％至40％，更 优选22％至38％，更优选25％至35％，更加优选干重的27％至33％。优 选的高浓度范围为干重的30％至60％，更加优选干重的30％至50％，更加 优选32％至48％，更加优选35％至45％。在优选的实施方案中，本过程包 括优选的酸水解和碱水解，并使用酵母干物质的优选浓度，更优选中度或 高浓度范围，或其任何组合。优选高浓度以改善过程有效性和能效。对于 碱水解，优选这些或相似的酵母粗材料浓度。

本发明涉及优化的约0.1至0.75M的低酸量，更优选0.1-0.5M，和与 浓缩粗材料一起使用的较高酸量(higher acid amounts from about to)，或以 较低pH范围(例如pH 0.5-1.5)和约0.5M至1.5M，更优选0.75M至1.25 M的较高浓度。在优选的实施方案中，使用低酸量和磷酸。应认识到，优 选每反应体积较高的施用浓度(最终浓度)为约0.3M至约2.0M，更优选 约0.3M至约1.5M，优选约0.5M至约1.5M，或0.75M至1.25M的较高 量，以获得优选的聚糖的较高溶解。

优选的强无机酸；盐酸、硫酸或磷酸(H₃PO₄)的优选的施用的最终 浓度是约0.10M至约2.0M，约0.3M至约2.0M，更优选约0.3M至约1.5M， 优选约0.5M至约1.5M或0.75M至1.25M，并获得聚糖的较高溶解，此 时反应在约80摄氏度的温度(优选70-100摄氏度之间，更加优选70和 95摄氏度之间，且更加优选75和85摄氏度之间)下进行。优选的反应时 间是约4小时，优选2至8小时，更优选3至5小时，最优选3.5至4.5 小时。在优选的实施方案中，使用最终浓度范围，以将pH调节至优选的 值，优选在pH 1.5-4.0之间，更优选在2.0和3.5之间，更加优选在2.0和 3.0之间。

组合的酸水解和碱水解

本发明涉及使酵母细胞材料在pH约9至14，和约10°至100℃的温 度下经受碱水解约10分钟至8小时，并在pH约1.5至4和约30°至100℃ 的温度下，经受酸水解约1至48小时，中和材料，任选地使材料与水溶 液接触。在优选的实施方案中，在pH约9至13，和约10°至90℃的温度 下进行碱水解约10分钟至8小时，并且在pH约2至3，和约30°至90℃ 的温度下进行酸水解约3至48小时。

本发明还涉及水解方法，在pH约9至13，和约10°至90℃的温度下 碱水解约10分钟至8小时，并且在pH约2至3，和约30°至90℃的温度 下进行酸水解约3至48小时。本发明还涉及水解方法，其中在pH约9至 13，和约50℃至100℃的温度下碱水解约0.5h至8小时，并且在pH约 2至3，和约60°至90℃的温度下进行酸水解约1至4小时。

本发明还涉及水解方法，其中碱水解的进行是通过在更优选10-45度 之间，用碱溶液pH 9-13洗涤0.1至3h。本发明还涉及水解方法，其中碱 水解是在pH 9-12.5之间、1h至12h的反应时间和60-100摄氏度之间的 温度范围下进行。本发明还涉及水解方法，其中碱水解在pH 11.5-14之间、 1h至12h的反应时间和60-100摄氏度之间的温度范围下进行。

本发明还涉及可溶酵母甘露聚糖组合物，其中糖类成分包括干重的 0.001-10％，更优选0.005-5％，且最优选0.01-3％，且最优选0.01-1.5％的β1-6 葡聚糖。组合物包括干重的5-25％或10-20％w/w的甘露聚糖，且β6-葡聚 糖或β-葡聚糖的量小于干重的5％w/w。如Superdex凝胶过滤实验所示， 组合物包括至少约80mol％的大于5000Da的材料，和至高20mol％分子 量在1000和5000Da之间的材料，更优选存在至少85％材料，更优选至 少90％的超过5000Da的材料。本发明还涉及组合物，其中包含 Manα3Manα2的糖类的量是所有甘露糖表位的至少5％，且更优选所有甘 露糖表位的至少8％，且更优选所有甘露糖表位的至少10％，更优选所有 甘露糖表位的至少15％，更优选所有甘露糖表位的至少17％，更优选所有 甘露糖表位的至少约20％，更优选所有甘露糖表位(或结构)的至少约23％， 更优选所有甘露糖表位(或结构)的至少约25％，更优选所有甘露糖表位 (或结构)的至少约28％，如实施例和表4所示。本发明涉及组合物，其 中基于质子H1信号积分(如实施例14所定义)，组合物具有至少约0.95 的甘露聚糖/淀粉比，和至少约0.5的甘露聚糖/多肽比，以及这些的其他优 选的配比。

本发明特别涉及优选的组合物，其中该组合物通过使用根据本发明的 方法来制备。

本发明还涉及材料的预处理，包括选自以下组的一种或几种：1)自 溶，优选通过在20至85摄氏度，更优选30至80摄氏度，在优选的实施 方案中，在30和60摄氏度之间或在60和85摄氏度之间的温度下，在约 3-7，更优选3.5和6.5之间，更加优选4和6.5之间的pH，孵育酵母粗材 料至少约0.5-48h，更优选1-24h，更加优选2-16h。完整的酵母(pH约 6)材料在实施例12和13中热处理，并且在实施例14中显示出一些良好 的结果。本发明还涉及在较强的碱水解和酸水解之前，使用碱洗涤作为预 处理，具有实施例12和13所示的良好作用。

JP2006169514是关于碱水解的相对密切的背景，然而该过程使用非常 短的酸反应来沉淀蛋白质，因此材料蓬松，且该过程产生含有基本上较高 的葡聚糖量的成分(无蛋白质/肽连接的甘露聚糖)。US2005020490的目标 是产生无b6-葡聚糖的纯甘露聚糖或葡聚糖成分，和优选不用分级分离的 对完整酵母材料的酸水解。

现在，本发明将通过仅参考以下非限制性实施例的方式详细描述。

实施例1

根据图1所示的过程加工啤酒酵母

方法

酵母细胞材料(由约20％干物质组成的浆状物)在pH 12或12.5或 13和+80℃用NaOH处理2小时，之后冷却至室温。然后，该材料在pH 2.5 和+80℃用磷酸(H₃PO₄)处理4小时，然后在室温下用NaOH中和。

将该材料用水稀释至1％的干物质，并在温和混合和室温下孵育2小 时。离心混合物(3000或4000rpm；1811或3220rcf，室温下5-20分钟)， 并弃去不溶成分。上清液在具有超滤膜(再生纤维素，Millipore)NMWL 1000或3000的搅动超滤池(Millipore)中进行超滤。

冻干高于MW 1000或3000的可溶材料(取决于使用的膜)。

市售酸水解的酵母材料用在80％乙醇中的50mM NaOH处理。弃去洗 涤物，并在水中由80％乙醇不溶成分制备1％的溶液，并如上所述地孵育。

Glucanex处理

酵母细胞材料用碱水解，并在+37℃用Glucanex(来自哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)的裂解酶，1.18U/g，Sigma)1-4mg/ml处理 6-23小时。通过在+80℃孵育0.5h终止处理。然后材料用酸处理，并如实 施例1所描述进一步加工材料。

沉淀磷酸盐的方法

中和后，在酸水解的酵母细胞材料中产生的磷酸盐用定量摩尔量的 CaCl₂在pH 8的略微碱性的溶液中沉淀。

用于分级分离的沉淀可溶产物的一般方法

酸水解后的酵母材料的可溶组分用高浓度(通常至少80％)的低毒性 溶剂(诸如醇，优选EtOH或丙酮)，通常在约1-25摄氏度，更优选1-8 摄氏度的温度下，从诸如1％的可溶产物的浓缩水溶液中沉淀，且优选从 含盐的制品或从酸水解和CaCl₂沉淀之后的酵母材料的制品沉淀。沉淀被 优化以将本发明的可溶酵母材料分离为沉淀物，和从产物分级分离较低分 子量材料。

沉淀物可能含有盐，其可通过例如在将沉淀的可溶成分溶解后通过过 滤或沉淀除去，例如通过Ca2+离子沉淀磷酸盐。

酸水解的酵母细胞材料的可溶成分或CaCl₂沉淀的酸水解的酵母细胞 材料的可溶成分用丙酮，基本上在以上的条件下孵育，沉淀物是根据本发 明的方法中的产物。

实施例2

根据实施例1产生的产物中可溶糖组分的量与市售酸水解的酵母材料 对比。将5mg(干重)实施例1型产物和市售酵母材料溶解在0.7ml 99.9％ 的重水中。1h溶解时间后，通过离心除去任何不溶的物质。取600μl溶液， 向两溶液加入在重水中的0.5μmol的苯丙氨酸甲酯作为内标定量标准。使 用在296K操作的Varian 500MHz谱仪，收集一维¹H-NMR谱。

NMR谱在图3中提供。两个谱显示了预期的可溶糖组分：淀粉、酵 母甘露聚糖和酵母β1，6-葡聚糖。通过5.40ppm的Glcα1-4残基H-1信号检 测到淀粉。酵母甘露聚糖单元清楚地反映了在5.0-5.3ppm可归属的H-1 信号：(-2)Manα1-2 H-1在5.30ppm，末端Manα1-3 H-1在5.14ppm，(- 6)(-2)Manα1-6 H-1在5.12ppm和(-2)Manα1-6 H-1在5.10ppm。5.05ppm 的大信号含有(-6)Manα1-2、末端Manα1-2以及(-3)Manα1-2的H-1信号。 通过4.53ppm的Glcβ1，6残基H-1信号显示了酵母β1，6-葡聚糖。

通过对比苯丙氨酸甲酯的芳族氢信号和甘露聚糖的H-1信号，评价了 可溶糖组分的量。间位和对位氢被用于分析。未测量淀粉。基于这一分析， 5mg(干重)的实施例1产物(图3A)产生4.4μmol(0.7mg)的Manα 残基，而5mg(干重)的市售酵母材料(图3B)产生0.54μmol(0.09mg) 的Manα残基。因此，实施例1材料的可溶部分含有14％重量/重量的甘露 糖，而市售材料含有1.8％w/w(基于干重的重量％)。

如实施例1所示制备的材料和市售酸水解的酵母材料两者都含有4.53 ppm的Glcβ1，6 H-1信号显示的β1，6-葡聚糖。发现两种材料均带有约0.1 μmol(0.016mg)Glcβ残基/5mg干样品。可溶β6-葡聚糖的量为总组合物干 质量的约0.32％(w/w)。

在两种材料中，仅观察到痕量的β1，3-葡聚糖(小于β1，6-葡聚糖的量 的1/5或20％)。因此，在某些制品中，含β3-葡萄糖结构的可溶材料的量 是约0.0604％，且依据过程，其可以被完全除去。应认识到，这一材料是 可溶的，且可含有其他结构，并与常规的酵母β3-葡聚糖材料非常不同。

实施例3

通过用2-氨基苯甲酰胺还原氨化，随后凝胶过滤色谱，获得了如实施 例1所示制备的材料中可溶糖组分的大小特征。将1mg的产物材料溶解 于含100μmol的2-氨基苯甲酰胺和0.5M氰基硼氢化钠的1ml 0.2M硼酸 钠缓冲液中。使反应混合物保持在37℃持续22h。0.2mg小份的产物材料 的色谱分析是在Superdex Peptide 10/300GL柱上以1ml/min用100mM碳 酸氢铵洗脱。洗脱的标记材料通过336nm的UV检测。通过在相同的色谱 条件下运行相似标记的葡聚糖标准品，使柱标准化。

图4显示了产物材料糖的洗脱特征曲线。在图中指示了葡聚糖5000 和葡聚糖1000的洗脱位置。源自根据实施例1制备的样品的可溶糖类成 分分别具有约74％(用碱和酸制备；截留1000Da)和87％(用酸和碱制 备；截留3000Da)的＞5000Da的和26％和13％1000-5000Da的寡糖和 多糖，计算为AB源的可溶材料的Superdex Peptide色谱的面积(336nm 的吸收单位乘以洗脱体积)。

实施例4

如实施例1所示制备的材料的免疫调节活性可通过人类白细胞测定来 体外测量，该测定基本如以下所描述：Savolainen J，Nieminen K，Laaksonen  K，Laiho T，Jacobsen L，Lahesmaa R，Terho EO，Valovirta E.Allergen-induced  in vitro expression of IL-18，SLAM and GATA-3mRNA in PBMC during  sublingual immunotherapy.(舌下免疫治疗期间，PBMC中IL-18、SLAM和 GATA-3mRNA的变应原诱导的体外表达。)Allergy 62：949-53(2007)和 Wan CP，Park CS，Lau BH.A rapid and simple microfluorometric phagocytosis  assay.(快速和简单的显微荧光测定吞噬测定)J.Immunol.Methods.162：1 (1993)和Busetto S，Trevisan E，Patriarca P，Menegazzi R.A single-step， sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of  membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils (用于吞噬嗜中性粒细胞中膜结合的和摄入的白色念珠菌的同时评价的 一步敏感性流式细胞荧光测定).Cytometry A.58：201(2004)。

为了测量根据本发明加工的酵母细胞材料的可溶成分的细胞因子调 节特征，从人类外周血中分离单核细胞(PBMC)。将PBMC应用到细胞 培养板上，并在不同浓度的根据图1或2或实施例1制备的材料(例如0.1、 1、10和100μg/ml)存在下孵育。具体地，可从患有变态反应的人类收集 PBMC，且该PBMC可用相关的变应原刺激。在典型条件，例如+37℃， 在具有5％CO₂的潮湿气氛中孵育培养物。在合适的孵育时间(例如24-72h) 后，收集细胞和上清液。可从细胞提取总RNA，以例如通过PCR技术， 测量单个细胞因子mRNA水平。可选择地，例如通过发光检查 (luminometric)技术，从细胞培养物上清液测量蛋白质水平的细胞因子。 提供信息的细胞因子包括例如白介素4、5、10、12、13、18以及干扰素-γ。

如实施例1所示制备的材料刺激了巨噬细胞的吞噬活性。其测量是通 过使用从小鼠或人类获得的巨噬细胞，或通过使用巨噬细胞型细胞系。培 养巨噬细胞，然后将其分配到例如96孔板中，并孵育，以使得细胞在可 溶成分的存在下粘连到孔上。加入荧光素连接的病原体，例如大肠杆菌或 白色念球菌细胞，并孵育合适的一段时间，以使得吞噬发生。通过加入台 盼蓝猝灭细胞外荧光，这将引起荧光素标记的细胞的典型的绿色荧光变成 红色。被吞噬的细胞保留绿色荧光。因此，通过与摄入的荧光细胞相关的 绿色荧光的强度，测量巨噬细胞的吞噬活性。在485nm激发和530nm发 射下，在孔中直接测量荧光。可选择地，通过流式细胞计测量吞噬活性， 其中绿色荧光还指示摄入的病原体细胞，而红色荧光为细胞外病原体。

实施例5

为了测量实施例1型产物的体内免疫调节活性，基本上如Smith AG， Sheridan PA，Harp JB，Beck MA.Diet-induced obese mice have increased  mortality and altered immune responses when infected with influenza virus.(膳 食诱导的肥胖小鼠当被流感病毒感染时，具有增加的死亡率和改变的免疫 反应)J Nutr.137：1236(2007)所述准备小鼠动物试验。用补充了实施例1 材料的标准饲料喂养一组小鼠合适的一段时间，优选数星期。对照组小鼠 仅用标准饲料喂养。测量典型的参数，包括饲料摄取量和体重。具体地， 测量从血液分离的巨噬细胞的细胞因子和IgA水平以及吞噬活性。任选地 进行组织学实验，以分析肠道免疫细胞。

为了分析膳食对病原体抗性的作用，建立了攻击试验。例如，通过合 适的流感病毒菌株攻击小鼠。追踪小鼠的存活率。如果在攻击中使用非致 死菌株，通过例如在呼吸道中的病毒滴定度或肺和脑中病毒抗原的免疫组 织学，追踪感染的严重性。使用获得标准饲料的对照组小鼠。

实施例6

含糖类成分的可溶免疫刺激组合物在健康快餐生产中的用途

来自实施例1的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物，或单独的糖类成 分以0.5％(w/w)和1％(w/w)被加入到饼干、点心条(snack bar)和面 包中。补充了含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的饼干、点心条和面包具 有比不含含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的饼干、点心条和面包更好的 免疫刺激作用。当摄入补充的饼干、点心条和面包时，预期含糖类成分的 可溶免疫刺激组合物刺激了肠道的自身免疫系统，并有益于消费者的免疫 状态。

实施例7

根据实施例1加工啤酒酵母细胞壁乳膏，并将可溶成分分离，并喷雾 干燥或冻干。通过例如色谱方法实施例可进一步分离糖类成分。

组合物或糖类成分是FDA的G.R.A.S.。组合物可用于在许多中食品中 补充β1，6)葡聚糖和甘露聚糖的高质量天然来源。这一生物活性材料刺激小 鼠的免疫系统，并预防病毒、细菌和其他微生物感染。

实施例8

提取物在动物饲料中的使用

根据实施例1制备了含糖类成分的可溶免疫刺激组合物。

这一组合物被用于补充保育猪(nursery pig)的膳食，持续例如断奶 后28天。补充剂与猪饲料混合，并以不同剂量，例如总饲料的0.05％、 0.1％、0.2％、0.3％、％0.5％或2％添加使用。

对照膳食含抗生素。断奶后的猪(17-22天大)基于体重，随机分到 对照膳食或治疗膳食。试验期后，对猪称重。在攻击实验中，使用引起腹 泻的大肠杆菌，诸如K88大肠杆菌(K88 e coli)。

实施例9

功能饮料和食品

根据本发明的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物被加入到饮料或食 品(例如酸奶酪)，以改善易于感染的人的健康，诸如免疫缺陷个体，剧 烈训练中的运动员，具有消耗性的生活方式或患有胃肠道问题的人。用作 无酒精饮料的合适制剂：25％胡萝卜、番茄和/或橙的果汁含量、1％(w/v) 含糖类成分的可溶免疫刺激组合物制品，或1％单独的糖类成分。

对本领域技术人员显然地是，虽然为了清除和理解的目的，在一定程 度上详细地描述了本发明，可对本文描述的实施方案和方法进行多种改良 和修改，而没有脱离本说明书公开的发明性概念的范围。

实施例10

实施例2的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物在湿疹治疗中的用途

患有对目前接受的皮肤洗液治疗无反应的湿疹的选择的一组患者用 含有例如1％实施例2的含糖类成分的可溶免疫刺激组合物的悬浮液的洗 液治疗。洗液一天两次应用。由皮肤病学家每周评价皮肤的损伤和疼痛的 改善。预期含糖类成分的可溶免疫刺激组合物洗液减少了与疼痛相关的损 伤，并加快损伤愈合。

实施例11

新的组合物对病原体结合的作用的优化是通过以下研究：将引起腹泻 的标记的大肠杆菌覆盖到固相固定的根据本发明的组合物(例如为拟糖脂 (neoglycolipids))，并观察对实施例1和/或通过本发明的其他优选的方法 产生的组合物或引起动物腹泻的病毒体的结合，并通过抑制细菌对组合物 或天然受体聚糖，特别是含Manα的拟糖脂或脂质的结合，诸如PCT  FI2003/00528所描述。

实施例12

酵母细胞材料(由约20％干物质组成的浆状物)用NaOH滴定至a) pH 7，b)pH 10或c)pH 13，然后在+80℃孵育2.25小时。通过孵育完整 的酵母材料(pH约6)相似地进行对照反应。然后将溶液冷却至室温，并 用磷酸(H₃PO₄)在pH 2.5并在+80℃下处理4.25小时，然后在室温下用 NaOH中和。

溶液用水稀释至1％干物质，并且在温和搅拌下在室温孵育2小时。 将混合物离心(3000或4000rpm；1811或3220rcf，5-20分钟，在RT下)， 并弃去不溶成分。上清液在具有超滤膜(再生纤维素，Millipore)NMWL 1000的搅动超滤试池(Millipore)中进行超滤，并冻干渗余物。这些提取 物的收率在表1中提供。结果显示，当酵母材料首先在碱溶液中处理时， 获得了＞1000Da材料收率的明显增加。最显著地是，如果酵母材料在pH 13 进行水解，获得了＞1000Da材料的2.7-倍的增加。

实施例13

酵母细胞材料(由约20％干物质组成的浆状物)用磷酸(H₃PO₄)在 pH 2.5并在+80℃下处理4.25小时。然后将溶液冷却至室温，并用NaOH 滴定至a)pH 7，b)pH 10或c)pH 13，然后在+80℃孵育2.25小时。然 后，反应在室温下用NaOH中和。对照反应A仅包括酸水解步骤。进行另 一对照，其中冻干酸水解材料，并用0.1M NaOH(标称pH 13)的80％乙 醇溶液洗涤。弃去洗涤物。

在水中制备每干物质的1％(w/v)溶液，并且在温和搅拌下在室温孵 育2小时。将混合物离心(3000或4000rpm；1811或3220rcf，5-20分钟， 在RT下)，并弃去不溶成分。上清液在具有超滤膜(再生纤维素，Millipore) NMWL 1000的搅动超滤试池(Millipore)中进行超滤，并冻干渗余物。这 些提取物的收率在表1中提供。结果显示，当包括碱水解时，＞1000Da 材料收率的明显增加。用碱性乙醇溶液洗涤冻干的酸水解的酵母材料去除 一些＞1000Da材料，因为收率比酸水解的材料的低。然而，如以下实施 例14所示，这些不主要是甘露聚糖，因为在碱性乙醇洗涤的材料中相对 甘露聚糖收率较高。

实施例14

通过NMR分析了根据实施例12和13制备的产物中可溶糖组分的量。 将5mg(干重)的每种产物和1.0μmol的苯丙氨酸甲酯溶解于0.6ml 99.9％ 的重水。使用在296K操作的Varian 500MHz谱仪收集一维¹H-NMR谱。 积分实施例2中列出的甘露聚糖H-1信号，并将它们的面积与苯丙氨酸环 的芳族质子的积分面积对比。这一定量分析的结果在表2中提供。

根据实施例12，在其中酵母材料首先在pH 10然后在pH 2.5水解的过 程中，获得了甘露聚糖的最高相对量(纯度)，提取产物的23.5％(w/w)。 如实施例13所描述，当水解步骤逆转，也获得了19.3％(w/w)的高量的 甘露聚糖。然而，用pH 13的最高碱性条件，获得了优选的甘露聚糖的最 高总收率和总提取物的最高量。

由NMR谱，还评价了甘露聚糖对淀粉的比。这一数据在表3中收集。 由甘露聚糖H-1信号的积分面积和淀粉源的H-1信号(Glcα1-4 H-1 5.40 ppm，Glcα1-6 H-1 4.97ppm)的积分面积计算这一比。在此，明显地是，包 括碱水解，随后酸水解的过程产生最高的甘露聚糖/淀粉比。此外，优选中 强碱水解的条件，并且在中性或约pH 6(完整材料)的洗涤和加热显示出 改进。基于质子NMR H1信号的优选的甘露聚糖/淀粉比是至少约0.85、 更优选至少约0.90、更优选至少约0.95、更优选至少约1.0、更优选至少 约1.1、更优选至少约1.2、更优选至少约1.25、更优选至少约1.3、更优 选至少约1.3、更优选至少约1.4、更优选至少约1.5、更优选至少约1.6、 更优选至少约1.7、更优选至少约1.8。约指示约0.1单位，更优选0.05单 位，更优选约0.03单位的变化。

通过对比甘露聚糖信号面积和0.8-1.0ppm的脂族质子信号面积，评 估甘露聚糖对多肽材料的比。这一质子-NMR信号面积显示了脂族氨基酸 (例如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的大多数甲基质子信号。甘露聚糖/ 多肽比数据在表3中提供。该值表示甘露糖H1信号的积分与0.8-1.0ppm 的脂族质子信号(甲基质子信号)的积分的比。在本文使用的提取方法中， 包括pH10水解步骤的方法似乎产生了最低量的脂族材料信号。洗涤程序 也产生了低蛋白质材料。优选这些产物为具有高糖含量的低蛋白质材料。 当考虑到制品中甘露糖的量时，来自较强碱水解的较高相对peptinuos(肽 /蛋白)材料含量将表明可溶糖肽也具有有用的多价聚糖供给能力 (presentation capacity)。最高pH产物的信号还表明可能可溶的蛋白组分。 应强调地是，这一分析无意给出真正的甘露聚糖/蛋白质质量比，而是产生 较高纯度的甘露聚糖的提取方法的相对功效指数。

基于质子NMR H1信号的优选的甘露聚糖/(多)肽比是至少约0.45、 更优选至少约0.40、更优选至少约0.45、更优选至少约0.5、更优选至少 约0.55、更优选至少约0.60、更优选至少约0.65、最优选至少约0.70。约 指约0.1单位，更优选0.05单位，更优选约0.03单位的变化。

NMR谱还提供Man-键比的评估。这些是由5.31ppm(-2Manα1-2  H-1)、5.14ppm(末端Manα1-3 H-1)、5.11ppm(-2，6Manα1-6 H-1和 -2Manα1-6 H-1)和5.04ppm(-6Manα1-2 H-1、末端Manα1-2 H-1和 -3Manα1-2 H-1)的积分信号面积计算。表4收集了这些积分的面积。此外， 计算了5.14ppm信号(包括末端Manα1-3 H-1)对所有Man H-1信号的比。 数据显示了，该过程略微减少了末端Manα3Manα2的相对量，这是依据中 强碱水解优选的碱强度。另一方面，在高碱强度下形成的产物如在Manα3 与Manα3Manα2Manα2之间的距离更大，并具有有用的生物活性。

实施例15.增加的溶解度，缺乏味道和气味

将来自实施例12和13的产物溶解成2、3、4、5、6、7、8、9和10％ 的溶液。观察到酸碱处理的材料的高的和增加的溶解度。本发明尤其涉及 本发明的材料，其在室温下为可溶的，或基本上溶解为2、3、4、5或6％ 的水溶液。本发明尤其涉及来自中强和强碱水解的高度可溶的产品，其可 至少以2％、更加优选以4％、更加优选以5％、最优选以6％的浓度溶解(或 基本上至少95％，更优选97％可溶)。

为了测试味道和气味，将本制品溶解于纯水中，成为浓度1％、0.5％、 0.1％和0.01％的溶液。健康的常规试验人测试味道和气味，并在低于0.5％ 浓度或低于0.1％浓度的浓度下，通常没有观察到产物的任何(或任何实际 的)味道或气味。1％的溶液可能具有一些味道或气味，但这在最佳过程 中被避免。

表1.如实施例12和实施例13中描述的可溶酵母产物的提取收率。

表2.如实施例12和实施例13中描述地制备的酵母甘露聚糖的收率。 通过实施例14中所描述的质子-NMR实验进行定量。

表3.酵母提取物中甘露聚糖对比淀粉和多肽型材料的比。由实施例 14中描述的质子-NMR谱测量丰度。甘露聚糖/多肽材料比预期描述为这一 提取系列中的比，即显示的提取类型分离甘露聚糖的功效。这不是定量的 甘露聚糖/蛋白质比。