塞尔托利细胞微胶囊化方法、所获得的微胶囊及其用于预防和治疗1型糖尿病的用途

摘要

本发明涉及经微胶囊化制成水凝胶类微胶囊的塞尔托利细胞(SC)，用于预防和/或治疗1型糖尿病(T1 DM)，以及涉及用于制造形状优选为微球体的微胶囊的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及经微胶囊化制成水凝胶类微胶囊的塞尔托利细胞(sertoli  cell)(SC)在预防和/或治疗1型糖尿病(T1DM)方面的用途，以及涉 及一种用于制造形状优选为微球体的微胶囊的方法。本发明的产品目标在 于能够诱导被糖尿病病理破坏的β-细胞的新生并且“切断”导致T1 DM的 这种破坏的同一自身免疫过程。

微胶囊化SC的治疗允许预防和治疗T1 DM，而无需借助任何黑索金 (hexogen)胰岛(人或动物)移植。应当注意，由SC微胶囊化获得的产 品足以与“传统”药物相比。

背景技术

目前全世界1型糖尿病(T1 DM)发病率为一年约30,000新病例。 主要但并非仅影响青年和青少年的1型DM发病机理主要是自身免疫机制 破坏了产生胰岛素的大多数胰腺β-细胞。简言之，有机体失去了对负责胰 岛素制造的胰腺β-细胞的免疫耐受性，并诱导主要由细胞介导的、与自身 抗体的产生关联、导致β-细胞自毁的免疫应答。

基于施用黑索金胰岛素的现行T1 DM疗法倾向于将糖类稳态恢复为 尽可能接近于在生理状态下所观察到的状态。然而，胰岛素疗法不能重现 (reproduce)正常β-细胞对促分泌刺激的应答所特有的胰岛素分泌的脉动 节奏(脉动节律，pulsating rhythm)。

所以，生理和稳定的内分泌-胰腺功能的恢复代表从根本上解决病理 问题的最终目标。为此，提出了新策略，如移植所有胰腺或移植从人供体 胰腺中分离的胰岛。

当前使用的黑索金胰岛素疗法无论如何都无法代表治疗T1 DM的最 终疗法。为了解决这个问题，早已提出这样的途径，其设想了移植全部胰 腺器官或从人或动物供体的胰腺中分离出的胰岛。

胰岛移植与全部胰腺移植相比侵袭性较小但具有类似问题，特别是：

1、来自死亡供体的人胰腺的有效性降低，结果胰岛的有效性降低。

2、使得接受者需要接受终身的一般药理免疫抑制方案。然而，用于 阻止移植组织免疫排斥的此种治疗选择方案受副作用困扰，该副作用当前 仍了解很少，但潜在地非常严重。

3、异源性胰岛的移植排斥，因为当前使用的免疫抑制药物中没有一 种能够有效地阻止它们。

4、经移植的胰岛组织随着时间的推移存活率较低。

塞尔托利细胞(SC)的功能最近被再次评价，并从仅睾丸精小管的 结构支撑上升为有无数营养和免疫功能的真正生物化学实验室。特别地， 已证明，SC培养物产生了抑制B和T淋巴细胞(1)增殖的分子。而且， 为了增强它们的免疫调节功能，该SC可以诱导T、B细胞的细胞凋亡和， 通过使其配体FAS连接到被靶细胞(2)表达的FAS的天然杀伤物(natural  killer)。

SC实施其免疫调节作用的另一种机制是制造转化生长因子-β (TGF-β)(3)。这种分子影响了对Th2型(保护性免疫)的偏爱高于Th1 型(非保护性免疫)的T CD4+淋巴细胞分化的表型。总之，塞尔托利 (Sertoli)活性因此可以对T1 DM具有直接的临床重要性，因为β-细胞被 主要由淋巴细胞Th1(INF-γ阳性)组成的渗入物破坏。

而且，SC免疫调节效果与分化和抗细胞凋亡的数个生长因子的产生 相关联，如转化生长因子(TGF-D)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、 白介素-1(IL-1)、干细胞因子(cKit-配体)、Fas/Fas配体(Fas-L)、激活 素A和最终BCL-w(4)。

最相关的现有技术(参考文献5)描述了将SC引入到超纯藻酸盐微 胶囊中的方法，所得微胶囊平均直径为520±14μm。

在写本文时，在国际水平上这样的胶囊是令人满意的：直径为约500 μm并且“尾部(tail)”百分比不大于5％。该胶囊直径和尾部百分比都是 非常重要的参数。该第一个参数应尽可能减小从而允许更有效的代谢物交 换，对于该第二个参数，最近发现甚至＜5％的尾部百分比都可能会引发具 有非常重大影响的炎症，因为形成了“抵抗减弱部(loci minoris  resistentiae)”，其中细胞抗原将被暴露。

发明内容

本发明人意外地发现一种能够在不存在尾部结构的情况下制造较小 尺寸的均匀微胶囊的方法，该尾部结构可以封装SC同时保持它们的活力 和功能不受影响。

考虑到上面情况，本发明人首次提出，通过在不存在黑索金胰岛组织 的情况下移植经微胶囊化制成水凝胶类微球体的SC来预防和/或治疗T1 DM的可能性。

因此，本发明的目的在于制造包含根据权利要求1所述的塞尔托利细 胞(SC)的水凝胶类微胶囊的方法。

附图说明

本说明书附有九个附图，其示出：

图1.猪SC的微观照片。A：免疫细胞化学，通过将该制剂和抗苗勒 氏(anti-mullerian)抑制因子(MIS)抗体一起孵化获得。B：免疫细胞化 学，通过将该制剂与抗波形蛋白(anti-vimentin)抗体一起孵化获得。C-D： 为了证明间质细胞和管周细胞的存在较少，利用组织化学技术对该制剂进 行处理，从而评价用坚牢红染色的碱性磷酸酶(管周细胞特有的)(C)， 和用硝基蓝四唑染色的3-β-羟基-类固醇脱氢酶活性(间质特有的)的存在 率(D)。

图2.通过“空气-单喷射器(air-monojet)”制造经微胶囊化制成藻酸 盐类水凝胶的SC的设备(组A)。组B示出所设计系统的最重要的组件。

图3.利用BaCl₂(A-C)和CaCl₂+多鸟氨酸(B-D)作为胶凝剂，通 过雾化系统“空气-单喷射器”获得的藻酸盐类微颗粒的微观照片。

图4.在植入后4个月的NOD大鼠腹腔中回收之后，与钡(A)和钙 (B)离子交联的多糖微颗粒透明区(亮场，clear field)的微观照片。图 C示出用EB/FDA双重染色之后，通过荧光显微镜观察装入到海藻酸钡中 的微胶囊化的SC所获得的微观照片。

图5.由NOD大鼠(Taconic)供应者宣称的T1DM自发发病的百分 比(85％)(A)可与用空微胶囊治疗的“自然(naive)”对照组的前驱糖 尿病动物显示的那些(B)相比。另一方面，组C示出用胶囊化SC治疗 的前驱糖尿病动物的T1DM发病百分比大大降低，仅为9％(预防效果)。

图6.用微胶囊化SC治疗的患有明显自发性糖尿病的NOD大鼠(组 E)移植后平均血糖值(治疗效果)。

图7.用微胶囊化SC治疗的动物脾细胞的RT-PCR分析。结果表明 对于组C和组E动物(参见部分VII)，SC的治疗可以增大阳性的体内 Foxp3细胞数目。这个结果表示T细胞数目有着重要的增长，该T细胞具 有调节特征，即，能够调节免疫应答涉及的数个细胞的活化和增殖。

图8.前驱/糖尿病NOD大鼠(A)和自发性糖尿病大鼠(B)的胰岛 的组织学分析。该图片表明该胰岛完全不受岛周和岛内胰岛素渗入物 (insulitic infiltrate)约束。组C和D示出用空胶囊治疗的前驱糖尿病“自 然”NOD大鼠(C)和患有自发性糖尿病大鼠(D)的胰岛的组织学分析。

图9.根据本发明的设备的布局。

具体实施方式

首先，制造了SC的均匀多糖悬浮液：该溶液纯度就细胞组分而言为 90％，该溶液是在浓度为1至5％w/v，有利地为1至3％w/v的超纯海藻 酸钠盐水溶液中获得的。所使用的海藻酸盐是超纯的，因为它表现出的内 毒素含量不大于20EU/g且蛋白质含量＜0.4％；空气有利地用作流体。SC 预先用胰蛋白酶和EDTA处理(2min)，以便获得均匀的细胞悬浮液。利 用下面技术对它进行评价：

·免疫细胞化学技术，将该制剂与抗苗勒氏抑制因子(MIS)抗体 和荧光素抗波形蛋白抗体一起孵化，其分别标记仅被SC表达的 MIS和波形蛋白分子。

·组织化学技术，以便评价管周细胞特有的碱性磷酸酶(用坚牢红 染色)的存在率，以及另一方面为间质细胞特有的3-β-羟基-类固 醇脱氢酶(用硝基蓝四唑染色)的存在率。

用此种组织化学分析法获得的结果可以证明管周细胞和间质 (Leydig)细胞的存在率为5-8％；而且，这些细胞群体(当以这些比例 存在时)对确保有利于SC正确功能的分子“串扰(cross-talk)”有用。

以10至60ml/min的速率抽吸这种悬浮液，通过利用流体流，有利 地受控压力下的空气吸入和挤出从而产生连续的尺寸均匀的微滴流。将如 此抽吸的悬浮液引入到针状元件中从而使其分成高度均匀的微滴。有利 地，该针状元件在其侧表面上有钮孔开口，通过该钮孔开口以3-7升/分钟 的速率引入流体流从而获得连续的均匀尺寸的微滴流。该流体流从发生器 中获得并在使用之前经受以下步骤处理：经受降低压力，从而在瞬变流- 非瞬变流之间获得不小于0.3巴的压力降；经受调节，从而在瞬变流-非 瞬变流之间获得高重现性并在旋转数和分散流体流之间获得线性关系，在 0至10NL/min之间调节和控制输出流。

该微滴的平均直径为300至700μm，标准偏差小于40μm。将所获 得的微滴引入到水溶液中，有利地使用包含二价阳离子或聚阳离子物质的 注射制剂用无菌水，F.U，从而发生胶凝化并获得所述微胶囊。

本发明的进一步目的是作为单独治疗剂预防和根治T1 DM的塞尔托 利细胞。

有利地，根据本发明的工艺，该抽吸可以通过蠕动泵以10至16ml/min 流速连续进行，并且所述挤出通过“空气-单喷射器”系统利用3至7l/min 的流体流，优选空气进行。在该工艺中，先前方法(包括“最相关现有技 术”中使用的方法)中不存在的下面系统组件确保了，所述空气流的精确 校准、整个方法的特征元件。在与所述阶段b)的所述悬浮液接触之前， 利用下述设备对所述空气流进行下述操作；

·膜压减小器Swagelok(KPR1JRF411A20000)，其能够确保输出 压力的高重现性并以便在瞬变流/非瞬变流之间获得小于0.3巴 的非常小的压力降，用于稳定空气流和使空气流运送到可再生的 挤压机中；

·通过微米阀Swagelok(SS-SS6MM)调节，向压力调节器输出， 该压力调节器允许以在瞬变流/非瞬变流的高重现性非常精细地 调节输出空气流(0-10NL/min)，并维持旋转数和分散流之间的 线性关系；

·在该微米阀下游安设由Precision Fluid(RAGK41-TOSS-SSNNN -M741A-TTCGN^*A)供应的旋转浮标型流量计(ROTAMETRO) Yokogawa，其允许精确而快速地阅读输出流(0-10NL/min)，因 而允许通过该微米阀对其进行调节。

本发明的进一步目的是包含可根据本发明工艺获得的SC的微胶囊， 其特征之一在于与所表现出的微胶囊化SC的IGF-1分泌与非微胶囊化SC 或“游离”SC的相同。

本发明的进一步目的是有利地为根据本发明工艺微胶囊化的塞尔托 利细胞，作为单独的治疗剂来制造预防和根治T1 DM的药物的应用。

根据本发明，可以对获得的微胶囊执行洗涤操作，和/或用天然和/或 人工聚合物进一步包覆。

与现有技术相比，本发明工艺允许a)制造较小尺寸、直径固定(从 300μm开始)，优选为均匀的微胶囊，而不存在“尾部”结构，且没有使微 胶囊化SC的活力和功能丧失；b)使微胶囊化SC的数目从每毫升海藻酸 盐10⁶个SC增加到每毫升海藻酸盐20⁶个SC，这可想象地暗示着在最小 的可能体积的聚合物中植入大量SC的可能性，和c)增加微胶囊化SC的 功能，特别是与IGF-1制造相关的功能，其分泌物从50ng/ml/20×10⁶个细 胞变化为基本等于“游离”SC的80ng/ml/20×10⁶个细胞。

参考本发明，应当注意

1、首次提出将微胶囊化SC作为诱导被自身免疫过程破坏的患者β- 细胞新生的最终治疗途径。

2.已获得了对微胶囊化工艺的最优化，其导致制造具有改进的特征 的微胶囊，如平均尺寸减小、多分散性降低以及不存在微胶囊的形态畸形 (“尾部”和聚结)。

本发明的进一步方面是包含SC的组合物，该SC与生理上可耐受的 载体一起容纳在可通过本发明工艺获得的微胶囊中，用于预防和治疗T1 DM。载体的实例由用于腹膜内施用的盐水组成。

下面是本发明的详细方面。

聚合物的纯化

市场上无法购得可用于微胶囊化SC的高纯形式聚合物，该高纯形式 是肠胃外施用，如人移植所需应用所严格要求的。在这些情况下，实际上， 需要严格的国际认可的“质量控制”标准(参见guidelines of the Ministry of  Health and of U.S.Pharmacopeia)。

实际上，大多数商业产品的内毒素水平都非常高(一般在30,000和 60,000EU/g之间)，这使得它们完全不适合于移植程序，移植程序要求内 毒素水平不大于100EU/g。因为上面的原因，用于制造微颗粒的所有聚合 物都适合经受随后的纯化循环，该循环使得存在的内毒素大幅减少。

SC的分离

可从一般为青春期前的各种动物来源中分离和纯化出SC。麻醉之后， 对动物执行双侧睾丸切除术。在除去副睾之后，对该睾丸执行多酶消化 (multienzymatic digestion)处理。该消化处理完成后，过滤管状组织。将 如此获得的小管放置在37℃、5％CO₂气氛下的培养物中。在孵化器中 48小时之后，该SC开始粘附到培养皿中，形成细胞单层。对所得SC的 纯度、活力和功能进行分析。该细胞活力测试通常在分离之后常规地立即 进行、在培养的第二天，以及紧接在微胶囊化过程之前和之后进行。

微胶囊化塞尔托利细胞的制造

可将该SC固定到由各种水凝胶组成的微胶囊中，该水凝胶由单独使 用或混合使用的亲水性聚合物组成。该微胶囊工艺的起始阶段设想了获得 连续和校准的微滴流。可以利用各种程序获得微滴：(a)“空气-单喷射器” 微胶囊包装器、(b)自动振动式胶囊包装器、(c)静电式微胶囊包装器、 (d)微流控芯片系统(microfluidic lab-on-a-chip system)。

一旦获得具有受控和均匀尺寸的微滴流后，这些通过凝胶化程序转化 成固体微球体。例如，处理聚集的SC单层从而获得均匀的细胞悬浮液， 将该SC重悬在各种超纯聚合溶液(按“纯化聚合物”部分中描述的方法获 得)中，最后，洗涤和分离在凝胶浴中获得的微胶囊。所制造的微胶囊可 以照原样使用或用各种天然、半合成或合成的聚合物层进一步包覆。因此， 所提出的方法允许(如图3中的图所示)将SC固定在尺寸高度均匀的微 胶囊中，而没有形态缺陷(存在聚结或“尾部”结构)，从而确保该胶囊化 细胞的活力和功能特征得以维持。

胶囊化SC的体内生物相容性

该微颗粒生物相容性通过腹膜内植入进行评价，该腹膜植入通过剖腹 术进行。在整个体内研究中监测每个接受动物的体重。在移植后的不同时 间，将微胶囊移出(explant)从而评价该胶囊化细胞的形态和功能。回收 的微球体的一般特征可通过显微分析确定，评价胶囊表面形态和存在的任 何炎性细胞。微胶囊化SC的活力也可以利用EB/FDA的双重染色技术评 价。

微胶囊化SC的体内活性评价

已证明盐水中微胶囊化SC的腹膜内移植能够预防和治疗人T1 DM 的“严谨型(stringent)”动物模型，如NOD大鼠，中的T1 DM。有利地， 但非绝对，从根据本发明的SC微胶囊化过程中获得的产物通过腹膜内施 用而施用，该产品用盐水运送。

本发明的进一步目的是有利地用于应用本发明工艺、用于制造微胶囊 的设备。该设备及其操作参考图9进行描述。第一容器2与流量分配装置 4配合，该分配装置4有利地为容积泵，并通过捕捉管(catching tube)3 将悬浮液1递送给针状元件5。该针状元件5在其侧壁具有钮孔开口6， 和输出孔7。联接件8允许来自发生器9并被调节装置11调节的受压流体 流10，优选空气进入到元件5的内部。通过适当地调节流10，可以中断 悬浮液流并获得均匀尺寸的微滴13，该微滴在包含存在于第二容器12中 的二价阳离子的溶液中形成凝胶。上述空气喷射仪器和所述条件适于获得 均匀的微胶囊。

可在无菌条件和GLP下使用的微胶囊包装器原型的开发

实施例

塞尔托利细胞微胶囊化成为海藻酸盐类微球体的过程以及体内生物 相容性和功能的评价

聚合物的纯化

通过相继的过滤过程获得的海藻酸钠用作制造微胶囊的原料聚合物 (base polymer)，其通常可以1-6％(w/v)溶液形式利用，并适当地储存 在4至6℃的避光场所中。随着时间的推移所述化合物可以稳定约5年， 其内毒素含量不大于20EU/g，实际上无蛋白质含量(＜0.4％-美国FDA“生 物不可见性(bioinvisibility)”的另一标准)。

从青春期前幼猪中的SC的分离

从幼猪(7-15天大)“大白猪(Large-White)”的睾丸中分离出SC。 在通过肌肉注射0.1mg/kg阿扎哌隆(azaperon)(40mg/ml， Janssen，Brusselle，Belgium)和15mg/kg开他敏(ketamine)(100 mg/ml，Gellini Farmaceutici)进行麻醉之后，对该猪执行双侧睾丸切除术。 在除去副睾之后，从白膜中剥去睾丸，将其切成小组织片段(1-3mm³)， 并立即基于HBSS(Sigma Chemical Co，St.Louis，USA)中的胶原酶P(Roche  Diagnostics，S.p.A.，Monza，Italy)(2mg/ml)对该片段进行第一次酶消化处 理。该消化持续到细精管的分离。所收集的小管然后用HBSS洗涤，并在 500r.p.m下离心。在洗涤之后，该小管用含有胰蛋白酶(2mg/ml)和DNAse  I(Sigma)的HBSS溶液孵化。在完成第二次消化之后，该胰蛋白酶溶液 用Hank′s+20％FBS进行1∶1稀释从而终止其酶活性。在用HBSS进一步 洗涤之后，通过在300rpm下的轻微离心从管周细胞中分离出小管。包含 管状组织的“球粒”适合用带有500μm网孔的不锈钢过滤器过滤。最后， 为了除去污染该制剂的任何管周细胞和间质细胞，将包含该小管的悬浮液 进一步在800rpm下离心5分钟，所得球粒用甘氨酸溶液1M和pH 7.2的 HBSS中的EDTA 2mM处理7分钟。

将如此获得的小管放置在37℃，5％CO₂气氛下的HAM F12 (Euroclone)中的培养物中，该培养物补充有维甲酸0.166nM(Sigma) 和5ml/500ml胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)(Becton Dickinson#354352)。培 养48小时之后，该SC开始粘附该培养皿，形成细胞单层。为了除去残余 的生殖细胞(如所知的，如果植入在腹膜腔中其可引起无性细胞瘤 (dysgerminoms))，用缓冲液三(羟甲基)-氨基甲烷盐酸盐(TRIS)(Sigma) 处理该SC单层，该缓冲溶液可以通过渗透裂解消除残余的生殖细胞。最 后，SC在上述条件下生长，通常在75cm²烧瓶中。

对所得SC的纯度、活力和功能进行分析。通过免疫细胞化学技术评 价，SC的纯度大于90％，将该制剂与抗苗勒氏抑制因子(MIS)和荧光 素抗波形蛋白抗体一起孵化，其分别标记仅被SC表达的MIS和波形蛋白 分子的(图1A、B)。

为了证明作为可能的污染物的间质和管周细胞的减少，对SC制剂进 行组织化学评价。这些测试允许评价管周细胞特有的碱性磷酸酶(用坚牢 红染色)的存在率，和间质特有的3-β-羟基-类固醇脱氢酶(用硝基蓝四唑 染色)的存在率(图1C、D)。用这些组织化学分析法获得的结果可以证 明管周细胞和间质细胞的存在率为5-8％；而且，这些细胞群体(当以这 些比例存在时)对确保有利于SC正确功能的分子“串扰”有用。

SC的活力通过用溴化乙锭(EB)和荧光素双醋酸酯(FDA)(Sigma) 的处理确定。通过荧光显微镜观察到的细胞在所有条件下都表现出大于95 ％的活力。细胞活力测试通常在分离之后常规地立即进行、在培养的第二 天，以及紧接在微胶囊化过程之前和之后进行。

C)胶囊化塞尔托利细胞的微滴的制造

将该SC固定到由各种单独使用或混合使用的多糖聚合物组成的微胶 囊中。所选聚合物是在我们实验室超纯化的海藻酸钠。微胶囊化过程的起 始阶段设想了从在聚合物浓度可在1和5％(w/v)之间变化的水性多糖 悬浮液中的SC细胞悬浮液开始获得连续和校准的微滴流。

各种程序是并且可以用于获得微滴：(a)“空气-单喷射器”微胶囊包 装器、(b)自动振动式胶囊包装器、(c)静电式微胶囊包装器、(d)微流 控芯片系统。

特别地，该方法选择基于半自动化、紧密的、可灭菌并可运送的微胶 囊包装器(图2示出该系统的总体外观)的(a)，已允许制造包含尺寸(300 μm至700μm直径)高度尺寸均匀的SC的微胶囊，而没有任何明显的形 态缺陷(如存在聚结或“尾部”结构)，并且重要的是，没有使微胶囊化SC 失去活力和功能。

图2的组B系统化地描述了通过“空气-单喷射器”的微胶囊化过程的 程序

D)制备超纯的海藻酸盐类微胶囊

一旦获得具有受控和均匀尺寸的微滴流后，这些通过凝胶化程序转化 成固体微球体，该程序设想了根据在我们实验室开发且生效的方法由二价 离子形成离子连接物(ionic link)。

特别地，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Garndisland，USA)处理 聚集的SC单层(2min)，以便获得均匀的细胞悬浮液。洗涤后，通过血 球计算分析对该SC进行计数，并测试其活力。然后，将SC重悬在各种 超纯聚合悬浮液中，该悬浮液中AG的浓度可在1.5-2％(w/v)之间变化。 对于用“空气-单喷射器”系统制造微胶囊，通过蠕动泵，以10至16ml/min 的流速连续抽吸该聚合物中的SC悬浮液。然后通过该“空气-单喷射器”系 统(利用3至7l/min的空气流)挤出该细胞悬浮液。整个过程中，保持 SC悬浮液处在轻微搅拌状态下，从而阻止该细胞的聚集以及SC在其中非 均匀分布的微胶囊形成的可能。

所制得的微滴利用包含二价阳离子如Ca⁺²或Ba⁺²(0.5-2.5％，w/v)的 溶液胶凝。以这种方式，将该微滴瞬间转化成凝胶微球体。然后，将该微 胶囊放在凝胶浴中，持续一段可在2和15分钟之间变化的时间。在这个 步骤结束时，用盐水对该微胶囊执行重复的洗涤循环。

所制造的微胶囊可以照原样使用或通过在包含天然、半合成或合成的 阳离子聚合物的溶液中相继孵化而被进一步包覆。例如，使用0.12％(持 续10分钟)和0.06％(持续6分钟)的聚-L-鸟氨酸(PLO)。最后，用 PLO包覆的微胶囊利用稀释的多糖溶液进一步处理，从而提供高度生物相 容的最终外包覆层。

图3示出通过均仅仅利用钡离子的上述步骤(A-C)，和用钙/聚鸟氨 酸/聚合物离子多层涂覆的步骤(B-D)获得的海藻酸盐类微胶囊的微观照 片。因此，所提出的方法允许(如图3中的图所示)将SC固定在高度尺 寸均匀的微胶囊中，而没有形态缺陷如存在聚结或“尾部”结构，并最终确 保该胶囊化细胞的活力和功能特征得以维持。

E)胶囊化SC的体内生物相容性

在通过腹膜内施用100mg/kg开他敏(Parke-Davis/Pfizer，Karlsruhe， 德国)和15mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)(Bayer，Leverkusen，德国)诱导 的全身麻醉之后，通过在雌性NOD大鼠(意大利，Harlan，重量约为25g) 腹膜腔上的小剖腹术引入该海藻酸盐微颗粒。将106微胶囊化SC植入每 只动物中。在整个体内研究过程中监测每只接受大鼠的体重。

移植4个月之后，麻醉后从该动物的腹膜腔内移出微胶囊，从而评价 其内含物的形态和功能。该微胶囊利用盐水通过腹膜洗涤回收。回收的微 球体的一般特征可通过显微分析确定，评价胶囊表面形态和存在的任何炎 性细胞。还可以利用EB/FDA的双重染色技术评价该微胶囊化SC的活力。

图4(A-B)中示出的微观照片表明该多肽微颗粒保持着高生物相容 性标准，如胶囊表面上存在最低水平的炎性细胞所示的。而且，在植入后 4个月(图4C)，海藻酸钡(图4A)和海藻酸钙(图4B)中的微胶囊化 SC都保持着优异的活力水平。

E)微胶囊化SC的体内和体外活性评价

本发明可以应用于移植生物技术领域，例如预防和治疗T1 DM。实 际上，在我们实验室我们已证明海藻酸钡微球体中微胶囊化SC的腹膜内 移植(206/大鼠)能够预防和治疗人T1 DM的“严谨型”动物模型，如NOD 大鼠的T1 DM。特别地，经微胶囊化制成海藻酸钡(BaAG)微球体的SC 在72小时的培养之后移植在前驱糖尿病NOD大鼠腹膜腔中，而且明显受 到糖尿病的影响。该植入是在全身麻醉的情况下通过剖腹术进行的。然后 每周检查受移植动物的体重以及餐前和餐后血糖。我们所依照的实验方案 设想了对多组动物进行不同的治疗，如下所指出的。

组A：“自然”前驱糖尿病对照动物(用空微胶囊治疗)

组B：自发性糖尿病对照动物(用空微胶囊治疗)

组C：通过腹膜内植入微胶囊化SC治疗的“自然”前驱糖尿病动物

组D：通过腹膜内植入“游离”SC(206/大鼠)治疗的“自然”前驱糖尿 病动物

组E：通过腹膜内植入微胶囊化SC治疗的自发性糖尿病动物

在体内研究过程中，处死一些动物从而通过收集脾、胰周淋巴结和胰 腺，用并行的组织形态学和免疫细胞化学检查评价外周免疫布局。

NOD大鼠体内实验的完整分析已可以证明在罹患自发性糖尿病的前 驱糖尿病动物中的移植的微胶囊化SC可以获得如下所示重要的治疗结 果。

-(A)微胶囊化SC能够阻止NOD大鼠的T1 DM发病。这种极好 的(sensational)结果可以通过分析T1 DM自发性发病的百分比而获得。 实际上，这种病理自发地发生在A组的85％的动物中(图5B)。这个结 果与NOD大鼠的供应商(Taconic)宣称的T1 DM发生百分比完全一致(图 5A)。

另一方面，在C组动物(用胶囊化SC治疗的前驱糖尿病动物)中， T1DM发病百分比仅为9％(图5C)。最后，在D组动物(通过腹膜内植 入“游离”SC治疗的前驱糖尿病动物)中，T1 DM发病百分比相比“自然” 组动物的发病百分比(19％)大大降低，但高于C组动物(图5D)。

-(B)在植入后的7至15天，该微胶囊化SC能够使已患有自发性 糖尿病E组(N＝30)中多于60％大鼠的血糖值(达到低于200mg/dl的 血糖水平)恢复正常(图6A)。另一方面，B组动物(用空胶囊治疗的糖 尿病动物)总是保持着高血糖水平，它们在1-2周内很快死亡。最后，F 组动物(N＝30)(通过腹膜内植入“游离”SC治疗的糖尿病动物)可以使血 糖值正常化，但是百分比较低，约等于40％。

-(C)对淋巴结、胰腺和脾进行的研究已证明，SC能够“再教育 (re-educating)”C和E组动物的免疫系统，“阻挡”导致疾病的自身免疫 攻击，如与对受治疗动物脾细胞的实时聚合酶链反应(PCR)结果相关的 图7所示。特别地，此种结果表明，用SC治疗的其中一个主要效果是它 们在活体内诱导Foxp3+细胞的能力。Foxp3是T细胞的选择性标记物，该 T细胞具有调节特征，即，能够调节涉及免疫应答的数个细胞的活化和增 殖，其数目在NOD大鼠模型中降低。

-(D)对所研究的所有动物组进行的组织化学测定表明，与对照组 (A和B)相比，利用SC的治疗能够除去C组和E组动物中胰腺水平的 胰岛素单核渗入物(图8)。而且，此种效果之后即为胰腺间充质干细胞的 活化，该干细胞能够产生新β-细胞，该新β-细胞能够使利用SC治疗的动 物血糖恢复正常，因为它们不再被自身免疫攻击渐渐破坏。在用SC治疗 后，免疫应答的再调节通过活化吲哚胺2，3-二氧化酶(IDO)免疫调节途 径介导，其同种型也在SC中被表达和功能化。

参考文献

1.DeCesaris P，Filippini A，Cervelli C，Riccioloi，A.；Muci，S.；Starace， G.；Stefanini，M.Ziparo，E.Immuno-suppressive molecules produced by Sertoli  cells cultured in vitro：Biological effects on lymphocytes.Biochem.Biophys  Res.Commun.1992，1861639-1646.

2.Lynch DH，Ramsdell F，Alderson MR.Fas and FasL in the homeostatic  regulation of immune responses.Immunol.Today 1995，16：569-574.

3.Suarez-Pinzon W，Korbutt G S，Power R，Hooten J，Rajotte R V， Rabinovitch A.Testicular Sertoli cells protect islet B-cells from autoimmune  destruction by a transforming growth factor-β1-dependent mechanism. Diabetes 2000，49：1810-1818.

4.Emerich，D.F.，Hemendinger，R.，and  Halberstadt，C.R.The  Testicular-Derived Sertoli Cell：Cellular Immunoscience to Enable  Transplantation，Cell Transplantation 12，335，2003.

5.Luca，G.，Calvitti，M.，Nastruzzi，C，Bilancetti，L.，Becchetti，E.， Mancuso，F.，Calafiore R.Encapsulation，in Vitro Characterization and in Vivo  Biocompatibility of Sertoli′s Cells in Alginate Based Microcapsules.Tissue  Eng.2007，13：641-648.