用于减少心血管疾病风险的油体缔合蛋白质的组合物和方法及其用途

摘要

提供用于减少高胆固醇血症并因此减少心血管疾病风险的组合物和方法。该组合物可以包括分离的油体缔合蛋白质。另外提供已经添加了一种或多种油体缔合蛋白质的食品。本发明所使用的组合物可以进一步包括例如基本上抗消化的皂角苷、异黄酮、磷脂、碳水化合物或其组合的添加化合物。本发明的方法和组合物可用于降低受试个体中胆固醇和其他脂类的水平以减少心血管疾病的风险。

说明书

本申请是申请日为2003年4月17日，申请号为038140152的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。 

本申请要求2002年4月18日提交的美国临时专利申请系列号60/373,460的优先权，其所公开的全部内容在此具体引入作为参考。 

发明领域

本发明涉及用于减少胆固醇水平并减少心血管疾病风险的新的组合物、多肽和方法。更特别地，本发明涉及用于预防和治疗升高的胆固醇和心血管疾病，包括油体缔合蛋白质的新的组合物及其用途。 

发明背景 

心血管疾病是人类群体内发病和致死的主要原因。尤其是在美国和西欧国家。许多的病因因素已经涉及心血管疾病的发展。这些因素中的部分包括该疾病的遗传诱因，例如吸烟和日常饮食的生活方式因素、年龄、性别、高血压和高脂血症，包括高胆固醇血症。许多因素，特别是高脂血症和高胆固醇血症，促进了动脉粥样硬化这一心血管疾病的根本原因的发展。 

高血液胆固醇浓度是人类中一种主要的心血管疾病危险因素。升高的低密度脂蛋白胆固醇(“LDL”)和总胆固醇直接与冠心病风险的增加相关。(Anderson等人，1987)。尽管总胆固醇和LDL的高水平在发展动脉粥样硬化和血管疾病中是危险因素，高密度脂蛋白胆因醇(“HDL”)最近也被认为是发展这些状况的附加危险因素。几个临床试验支持HDL针对动脉粥样硬化的保护性作用的理论。一种这样的研究已经证明在女性中，血液中每增加1-mg/dl的HDL，就降低3％的冠状动脉血管的疾病风险。(Gordon等人，1989)。 

研究已经表明在人类中饮食的变化可以减少胆固醇。在此中，特殊的研究已经表明所摄取蛋白质的质量以及数量极大地影响了血清胆固醇水平。(Carol和Hamilton，1975；Nagaoka等人，1992；Potter，1995)。在日常饮食中摄取植物蛋白物质代替动物性蛋白质与心血管疾病的较低风险相关，其可反映为血清胆固醇水平的降低。特别地， 大豆蛋白质，一种植物蛋白，已经显示相对于动物蛋白酪蛋白能降低血清胆固醇的水平(Nagaoka等人，1999)。更近的关于大豆蛋白质摄取对人类中血清脂类影响的变化分析已经显示规定饮食的大豆蛋白质与人类中总胆固醇和LDL血清浓度的降低显著相关，并且不显著影响HDL-胆固醇浓度(Anderson等人，1995)。 

担负大豆蛋白质能够降低胆固醇职责的一种因子是高分子量级分(HMF)。HMF组成了在蛋白水解消化后仍保持完整的大豆蛋白质的不易消化的部分。因此该级分由许多不同的肽或肽片段组成。大豆蛋白质的HMF实际上已经在动物和人类研究中显示显著地减少血清胆固醇。相信不易消化的HMF通过防止经刷缘膜的胆固醇被动摄取或通过防止蛋白质介导的胆固醇摄取而防止胆固醇的摄取。相比之下，低分子量级分、大豆蛋白质的可消化级分，已经事实上显示增加血清胆固醇(Sugano等人，1988)。 

尽管大豆蛋白质和特别是HMF的潜在治疗价值是作为降低胆固醇的因子，但是还没有确定担负其非消化和胆汁过少活性的特异组分。因此仍然需要致力于鉴定这些活性组分，以提供更有效地减少胆固醇和其他与心血管疾病相关的危险因素的治疗剂。 

发明概述 

在一个方面，本发明提供制备食品的方法，包括下列步骤：(a)获得所选择的食品；以及(b)向该食品添加分离的油体缔合蛋白质，其中消耗有效量的该食品降低了需要该食品的受试个体的血清胆固醇。在某些实施方案中，该方法进一步包括添加至少一种选自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物的化合物。油体缔合蛋白质可以包括脂蛋白和/或油质蛋白。在一个实施方案中，食品是以大豆为基础的。该组合物可能在添加的步骤之前缺乏或包括油体缔合的本体蛋白质。食品的实例包括，但不具体限于，大豆细粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、豆奶粉、大豆蛋白质浓缩物、大豆蛋白质分离物和分离的大豆多肽。在本发明的某些实施方案中，大豆蛋白质分离物是用蛋白酶处理的大豆物质的高分子量级分。在进一步的实施方案中，分离的大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白或其片段，和/或是大豆球蛋白或其片段。 

在另一个方面，本发明提供用于治疗或预防高胆固醇血症的组合物，包括：(a)大豆球蛋白和/或β-伴大豆球蛋白或其片段；和(b)油体缔合蛋白质，其中大豆球蛋白和/或β-伴大豆球蛋白和油体缔合蛋白质是以在需要其的受试个体中提供治疗或预防高胆固醇血症的协同效应的有效量存在.在一个实施方案中，大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白至少部分地受到酶或酶混合物的水解。在进一步的实施方案中，该组合物包含大豆球蛋白或其片段和纯化的油体缔合蛋白质，而在另一个实施方案中包括β-伴大豆球蛋白或其片段和纯化的油体缔合蛋白质。在本发明的某些实施方案中，该组合物可以包括大约1％-大约5％，大约5％-大约10％，大于大约10％，或大约30％-大约50％重量的油体缔合蛋白质。 

本发明提供的组合物可以进一步包括至少一种添加化合物，包括基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。植物雌激素的实例包括异黄酮。异黄酮的实例包括染料木黄酮、二分体玉米醇溶蛋(diadzein)、牛尿酚、鸡豆黄素A、芒柄花黄素及其各自天然存在的糖苷和糖苷共轭物。碳水化合物的实例包括高直链淀粉、低聚果糖和大豆子叶纤维。在本发明的一个实施方案中，磷脂选自卵磷脂、溶血卵磷脂和具有改进的脂肪酸组分的卵磷脂。在进一步的实施方案中，皂角苷选自大豆皂角苷A、皂角苷B、皂角苷E、皂草精醇A、皂草精醇B和皂草精醇E。油体缔合蛋白质可以包括脂蛋白，包括哺乳动物脂蛋白、蛋黄脂蛋白或脂肪球膜蛋白质。油体缔合蛋白质也可以是油质蛋白，包括油质蛋白的低分子量级分。 

在本发明的一个实施方案中，油体缔合蛋白质包括包含两亲性序列的多肽片段。其中该组合物包括大豆球蛋白，可以包括大豆球蛋白的碱性亚基，包括B-1b亚基。该组合物也可包括β-伴大豆球蛋白，包括其α’亚基或片段。该组合物可进一步被定义为包含40％以上的β-伴大豆球蛋白或其片段。该组合物可进一步被定义为包括一种或多种多肽序列，选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。 

在另一个方面，本发明提供用于治疗或预防高胆固醇血症的方法，包括步骤：(a)向所选择的食品中添加油体缔合蛋白质；以及(b) 将该食品以足够治疗或预防高胆固醇血症的数量提供给需要其的受试个体。该方法可进一步包括向食品中添加至少一种选自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物的化合物。在一个实施方案中，油体缔合蛋白质包括例如油质蛋白的脂蛋白。在另一个实施方案中，食品是以大豆为基础的。食品的实例包括，大豆细粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、豆奶粉、大豆蛋白质浓缩物、大豆蛋白质分离物和分离的大豆多肽。在添加的步骤前食品可能缺乏或包括油体缔合的本体蛋白质。大豆蛋白质分离物可包括用蛋白酶处理的大豆材料的高分子量级分。在本发明的某些实施方案中，分离的大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白或其片段，和/或是大豆球蛋白或其片段。 

另一方面，本发明提供用于治疗或预防高胆固醇血症的方法，包括对需要其的受试个体施用包括治疗有效量的纯化的油体缔合蛋白质的药物组合物。药物组合物可以任何方式给药，包括作为丸剂或胶囊剂或作为营养增补剂给药。在该方法中，心血管疾病可通过降低总的血清和/或肝的胆固醇或甘油三酯的浓度而预防。血清胆固醇浓度可通过降低低密度脂蛋白的浓度，以及增加高密度脂蛋白的浓度而下降。 

在另一方面，提供具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或具有与其有至少95％的序列同源性并具有与其相同的生物活性的氨基酸序列的多肽。 

附图简述 

本发明的这些和其他细节、方面以及优势将在下列说明书、所附的权利要求和附图方面进行更透彻地理解，其中： 

图1描绘来自大豆的油质蛋白蛋白质P24油质蛋白同工型A(P89)的序列，登记号P29530，并相应于SEQ ID NO：12。 

图2描绘来自大豆的油质蛋白蛋白质P 24油质蛋白同工型B(P91)的序列，登记号P29531，并相应于SEQ ID NO：13。 

图3描绘来自玉米(Zea mays)的油体缔合蛋白质17kDa油质蛋白(oleo 17)的氨基酸序列(登记号AAA68066)，并相应于SEQ ID NO：14. 

图4描绘来自玉米(玉米属)的油体缔合蛋白质16kDa油质蛋白(oleo 16)的氨基酸序列(登记号AAA68065)，并相应于SEQ ID NO： 15。 

图5描绘来自玉米(玉米属)的油质蛋白KD18(KD18；L2)的氨基酸序列(登记号AAA67699)，并相应于SEQ ID NO：16。 

图6描绘向日葵油质蛋白的氨基酸序列(登记号CAA55348)，并相应于SEQ ID NO：17。 

图7描绘包含来自称为OBAP(+)的大豆蛋白质分离物的HMF，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的凝胶条带的5种多肽。 

图8描绘在聚丙烯酰胺凝胶上纯化和分离的油体缔合蛋白质(P34和油质蛋白).

图9描绘包含来自由缺乏G1大豆球蛋白的大豆产生的用胃蛋白酶消化的大豆蛋白质分离物的HMF的凝胶。 

图10描绘的图表说明，对照OBAP(-)大豆蛋白质分离物，从OBAP(+)分离的HMF对Caco-2细胞中胆固醇摄取的剂量依赖性抑制. 

图11描绘的图表说明，在二氢谷甾醇存在下的胆固醇吸收与在大豆球蛋白-无效的和α/α’β-伴大豆球蛋白-无效的HMF存在下的胆固醇吸收之间的差异，从而证明机理上的差异。 

图12描绘的凝胶说明在每一样品中存在油质蛋白。 

图13描绘的凝胶说明在标明的样品中存在或缺少油质蛋白。 

发明详述 

本发明通过鉴定具有心血管健康益处的组合物来克服现有技术的限制。特别地，本发明的一个方面涉及发现能够降低胆固醇水平的油体缔合蛋白质。同时，植物成分，例如大豆蛋白质，已经公知具有低血胆固醇活性，但负责该活性的特定成分先前没有表征。因此，现在的发明涉及发现油体缔合蛋白质，包括油质蛋白和蛋黄脂蛋白能够赋予植物蛋白质降低胆固醇的特征性能力。同样地，本发明涉及这些特定成分与例如大豆食品的植物材料的协同组合。没有结合任何特别的理论，相信油体缔合蛋白质预防存在于大豆物质中的生理活性肽的消化并从而协同增加该组合物的低血胆固醇活性。另外，本发明涉及与大豆物质结合成分的协同组合以及选自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂、以及碳水化合物，或其任何组合的添加剂成分，以进一步增加该组合的低血胆固醇活性。本发明也包括这些肽单独的或与 其他化合物结合的治疗用途，可用于降低血液中的总胆固醇浓度，并且特别地减少LDL-胆固醇浓度，抑制心血管疾病的发展。 

油体是包裹储藏的三酰基甘油酯的小的、球形的亚细胞器，是许多植物所使用的能量储备。尽管在大多植物和不同的组织中发现，它们在含油种子的种子中特别丰富，但是它们通常的大小范围为直径1微米-几微米。油体一般由三酰基甘油酯和周围的脂蛋白和蛋白质组成。“油体缔合蛋白质”包括与油体物理上相关的任何以及所有的这些蛋白质和脂蛋白。在植物中，主要的油体缔合蛋白质是油质蛋白。已经从许多植物来源，包括谷物、油菜籽、胡萝卜和棉花克隆并且测序了油质蛋白。来自不同种属的油质蛋白一般是高度保守的。 

I.缩写和定义 

为了有助于理解本发明，在此所使用的许多术语和缩写如下定义： 

HMF＝高分子量级分 

如在此所使用的，“高分子量级分”是指水解或化学性消化该分离物后的保留的植物蛋白质分离物的级分，其可通过于pH 6-7在4,000-10,000×g离心15-20分钟而分离。 

如在此所使用的，“添加化合物”总体地是指被加入本发明的组合物的单个化合物或一组化合物。这些化合物选自皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。 

如在此所使用的，使用术语“氨基酸”的广义，并且包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸，包括氨基酸类似物和衍生物。后者包括包含氨基酸部分的分子。本领域的技术人员可认识到，鉴于该广阔的定义，在此所参考的氨基酸包括，例如天然存在的蛋白质性的L-氨基酸；D-氨基酸；化学上修饰的氨基酸，例如氨基酸类似物和衍生物；天然存在的非蛋白质性的氨基酸，例如正亮氨酸，(β-丙氨酸，鸟氨酸等；以及具有本领域已知的表现氨基酸特征特性的化学上合成的化合物.如在此所使用的，术语“蛋白质性的”表明氨基酸可能在细胞中通过代谢途径被整合到肽、多肽，或蛋白质中. 

如在此所使用的，术语“药物学上可接受的盐”包括通常用于形成碱金属盐和游离酸或游离碱的加成盐的盐。如果它是药物学上可接 受的，盐的特性不是决定性的。 

如在此所使用的，“分泌序列”或“信号肽”或“信号序列”是指，指导重新合成分泌蛋白或膜蛋白到达并且通过内质网的膜，或穿过细菌内膜从胞质到周质，或从线粒体基质到内部空间，或从叶绿体基质到囊片中的序列。这种序列与将在异源宿主中表达的基因的融合体确保该重组蛋白质从宿主细胞分泌出来。 

如在此所使用的，“多肽”和“寡肽”是可互换使用的，并且指至少2个氨基酸通过肽键连接在一起的聚合体。 

如在此所使用的，“序列”指线性序列，其中单体存在于聚合体中，例如，多肽中氨基酸的顺序或多核苷酸中核苷酸的顺序。 

如在此所使用的，“粉碎的完整大豆”包括，例如，由薄片或磨碎的完整大豆形成的大豆物质，包括大豆的外皮和胚。粉碎的完整大豆物质可包含大豆固有的脂肪或可能是脱脂的。 

如在此所使用的，“大豆细粉”包括，例如，在无水分基础上，包含小于65％重量的大豆蛋白质含量的大豆物质，其由去皮的大豆组成并且具有150微米或更小的平均颗粒大小。术语“大豆细粉”可包括，例如，豆奶粉。大豆细粉可包含大豆固有的脂肪或可能是脱脂的。 

如在此所使用的，“大豆粒”包括，例如，在无水分基础上包含小于65％重量的大豆蛋白质含量的大豆物质，其由去皮的大豆组成并且具有150微米-1000微米的平均颗粒大小。大豆粒可包含大豆固有的脂肪或可能是脱脂的。 

如在此所使用的，“大豆粗粉”包括，例如，在无水分基础上包含小于65％重量的大豆蛋白质含量的大豆物质，其由去皮的大豆组成，其不属于大豆细粉或大豆细粒的定义内。大豆粗粉可包含大豆固有的脂肪或可能是脱脂的。 

如在此所使用的，“大豆片”包括，例如，大豆蛋白质物质是在无水分基础上包含小于65％重量的大豆蛋白质含量的由薄片去皮大豆形成的薄片状大豆物质。大豆片可能包含大豆固有的脂肪或可能是脱脂的。 

如在此所使用的，“大豆蛋白质浓缩物”包括，例如，从高质量完整的、干净去皮的大豆种子制备的大豆蛋白质物质。大豆蛋白质浓缩物可通过除去大部分的油和水可溶解的非蛋白成份来制备并且在无 水分基础上一般包含不少于65％的蛋白质。在另一个实施方案中，“大豆蛋白质浓缩物”也可以被解释成另外包括大豆蛋白质和磷脂的混合物，其中在无水分基基础上的总的蛋白质在大约65-大约90％的蛋白质之间。一般地，这由去皮的脱脂大豆通过3个基本的步骤制备：酸浸泡(大约pH4.5)，用醇提取(大约55-80％)，并且在用水提取前用湿热变性蛋白质。低水溶性的(含水醇提取法)大豆蛋白质浓缩物受到加热(蒸汽注入或喷气蒸煮)和机械加工(均化作用)以提高溶解度和功能性。当涉及大豆蛋白质和磷脂的混合物，其中在无水分基础上的总的蛋白质是65-90％蛋白质，这种物质可通过组合大豆蛋白质分离物和磷脂或通过分馏来自大豆的磷脂：蛋白质复合物而制备(即，油体蛋白质和缔合的磷脂)。术语“大豆蛋白质浓缩物”可包括，例如，豆奶粉。 

如在此所使用的，“大豆蛋白质提取物”包括，例如，在某些大豆蛋白质中富集的大豆蛋白质浓缩物或分离物。从完整的大豆蛋白质物质分馏的大豆蛋白质物质可例如从大豆蛋白质配料废物或乳清流(醇或酸性水提取步骤)制备。 

如在此所使用的，“大豆蛋白质分离物”包括，例如，大豆蛋白质物质，它是从去皮大豆通过除去大部分非蛋白质的化合物而制备的大豆的主要蛋白质级分，优选地在不含水分基础上不包含小于90％蛋白质。在另一实施方案中，“大豆蛋白质分离物”也可被解释成另外包括某些类型的大豆蛋白质例如，例如，β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和油质蛋白，或备选地缺乏某些类型的大豆蛋白质，例如油质蛋白中富集的大豆蛋白质物质。一般从未加热的脱脂大豆片用水或温和的碱，在8-9的pH范围内提取蛋白质，然后通过离心除去不溶的纤维状残基；调节所得到的提取物到pH 4.5，其中大部分的蛋白质沉淀物是凝块；通过离心从可溶解的低聚糖分离凝块，然后是多次洗涤，用氢氧化钠或氢氧化钾中和(以使其更易溶解和更有功能)，加热处理(例如利用喷气-蒸煮)和喷雾干燥。在热处理步骤前加入蛋白酶也可用于部分水解蛋白质并且增加大豆蛋白质分离物的溶解度。 

如在此所使用的，“肽”和“蛋白质”是可互换使用的，并且指由通过肽键方式连接的两个或多个氨基酸组成的化合物。 

如在此所使用的“重组蛋白质”指不管是否包括天然或突变的主 要氨基酸序列的蛋白质，是通过在除了其中基因和/或蛋白质是天然存在的细胞中表达携带重组DNA分子的基因获得的。换言之，该基因是与其表达的宿主异源的。应该注意到基因的任何变化，包括加入编码基因的亲合纯化部分的多核苷酸，使得基因相对于该定义的目的是非自然的，并且因此该基因不是在任何细胞中“天然地”存在的。 

如在此所使用的，“靶序列”指在蛋白质或肽的范围内，“靶序列”指编码氨基酸序列的核苷酸序列，其存在导致蛋白质导向细胞内特定的目的地。 

短语“治疗-有效的”表明该试剂能够预防或改善疾病的严重度，同时避免一般与替代疗法相关的不良副作用。可以理解短语“治疗-有效的”相当于短语“有效用于治疗或预防的”，并且都是用来限定，例如，用于本发明方法的组合物的数量，其可实现降低心血管疾病风险或预防所述的疾病，同时避免一般与替代疗法相关的不良副作用的目的。 

II.本发明的多肽 

申请人已经鉴定分离了来自大豆物质，更具体地来自具有低血胆固醇活性的大豆物质的HMF的多肽的序列。这些序列编码来自大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白的肽。蛋白质大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是种子贮藏的蛋白质。大豆球蛋白具有320千道尔顿(“kDa”)的近似分子量并且由6个亚基组成，每个亚基由酸性的和碱性的亚基组成。此外，β-伴大豆球蛋白具有150kDa的近似分子量，并且由3个不同的亚基(α，α′，和β)以不同的比例组成。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白类型的蛋白质在不同的植物品种中是高度保守的。 

因此本发明的一个方面，包括来自大豆球蛋白蛋白质的一个到几个分离的多肽或多肽片段。在一个实施方案中，分离多肽的序列在SEQID NO：1中提供并且相应于VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK。 

本发明的又一个方面提供来自β-伴大豆球蛋白蛋白质的一个到几个分离的多肽或多肽片段。在一个实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：2中提供，并且相应于LRMITLAIPVNKPGRFESFFL。在另一个实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：3中提供，并且相应于IFVIPAGYPVVVNATSHLNFFAIGI。在另一实施方案中，分离多肽的序列 在SEQ ID NO：4中提供，并且相应于LQESVIVEISKK.在另一个实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：5中提供，并且相应于QQQEEQPLEVRK。在另一实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：6中提供，并且相应于NQYGHVR。在另一个实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：7中提供，并且相应于AIVILVINEGDANIELVGL。在另一实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：8中提供，并且相应于NILEASYDTKFEEINK。在另一实施方案中，分离多肽的序列在SEQ ID NO：11中提供，并且相应于IFVIPAGYPVVVNATSDLNFFAFGI。 

申请人也已经鉴定了表明有低血胆固醇活性的油质蛋白的序列。油质蛋白主要是在植物油体的膜成分中发现的。油质蛋白蛋白质由3个结构域组成；蛋白质的2个末端，N-和C-末端，基本上是亲水的并且保留在油体暴露于细胞液的表面上，同时油质蛋白高度疏水的中部核心稳固地锚定在膜和三酰基甘油酯内。油质蛋白在C-末端或其附近也包含两亲性的α-螺旋结构域。来自不同种属的油质蛋白代表蛋白质的一个小家族，其显示相当多的氨基酸序列保守区，特别是在蛋白质的中心区域。在个别的种属内可能存在少量不同的同工型。 

因此本发明的另一个方面，包括来自油质蛋白蛋白质的一个到几个分离的多肽或多肽片段。在一个实施方案中，油质蛋白是来自大豆的P24同工型A(P89)(登记号P29530；SEQ ID NO：12)，其相应于图1。在另一实施方案中，油质蛋白是来自大豆的P24同工型B(P91)(登记号P29531；SEQ ID NO：13)，其相应于图2。在另一个实施方案中，油质蛋白是来自玉米(玉米属)的油体缔合蛋白质17kDa油质蛋白(oleo 17)(登记号AAA68066；SEQ ID NO：14)，其相应于图3。在另一实施方案中，油质蛋白是来自玉米(玉米属)的油体蛋白质16kDa油质蛋白(oleo 16)(登记号AAA68065；SEQ ID NO：15)，其相应于图4。在另一实施方案中，油质蛋白是来自玉米(玉米属)的油质蛋白KD18(KD18；L2)(登记号AAA67699；SEQ ID NO：16)，其相应于图5。在另一个实施方案中，油质蛋白是向日葵油质蛋白(向日葵)(登记号CAA55348；SEQ ID NO：17)，其相应于图6。在进一步的实施方案中，分离的油质蛋白多肽的序列在SEQ ID NO：9中提供，并且相应于VKFITAATIGITLLLL。在另一实施方案中，分离的油质蛋白多肽的序列在SEQ ID NO：10中提供，并且相应于 YETNSSLNNPPSR。 

本发明也包括与油质蛋白和SEQ ID NOs：12、13、14、15、16、17的序列具有90％，优选95％，更优选97％，以及更优选99％的序列同源性的多肽。本发明进一步的实施方案提供与SEQ ID NO：1-11的任何一个序列具有90％，优选95％，更优选97％，以及更优选99％的序列同源性的多肽。 

“同源性”，如本领域中所很好理解的，是通过比较序列所确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同源性”也指通过这种序列符号串之间的匹配所确定的多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度。“同源性”可通过已知的方法轻易地计算，包括但不限于在Computational Molecular Biology，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，1993；Computer Analysis of Sequence Data，部分I，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，1987；Sequence Analysis Primer，1991；以及Carillo和Lipman，1988中所描述的方法。确定同源性的方法是设计成能给出待测试序列之间的最大匹配。此外，确定同源性的方法编集成公众可利用的程序。可用于确定2个序列之间的相同性/同源性的计算机程序包括但不限于，GCG(Devereux等人，1984)；一套5个的BLAST程序，3个设计用于核苷酸序列查询(BLASTN，BLASTX和TBLASTX)以及2个设计用于蛋白质序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，1994；Birren等人，1997)。BLASTX程序是公众可从NCBI和其他来源得到的(BLAST Manual；Altschul等人，1990)。还可使用公知的Smith Waterman算法确定同源性。 

本发明也涉及分离的蛋白质。如在此所使用的，术语蛋白质包括大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白或油质蛋白蛋白质的片段、类似物和衍生物。本发明的蛋白质可以是天然的蛋白质、重组蛋白质或合成蛋白或多肽。 

本领域的普通技术人员知道改变肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列可导致同等物或可能改进的子二代肽等，当与原始的氨基酸序列相比时，其显示同等的或更高的功能特性。本发明因此包括这种改变的氨基酸序列。改变可包括氨基酸插入、缺失、替换、截短、融合体、亚基序列的重组等，条件是通过这种改变产生的肽序列具有与在此所公 开的天然存在的对应序列基本上相同的功能特性。生物活性或功能可通过例如，如在下列实施例中所表明的蛋白质降低总的血清胆固醇的能力而确定。 

在产生这种变化时可考虑的一个因素是氨基酸的亲水指数。在赋予蛋白质相互作用的生物功能中，亲水的氨基酸指数的重要性已经由Kyte和Doolittle(1982)论述。公认氨基酸的相对亲水特性促进合成的蛋白质的二级结构。这依次影响蛋白质与例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等分子的相互作用。 

根据其疏水性和电荷特性，各个氨基酸的亲水指数已经指定如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酸盐/天冬氨酸/天冬酰胺酸(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。 

如本领域已知的，肽或蛋白质中的某些氨基酸可被其他具有相似亲水指数或积分的氨基酸置换，并且产生具有相似生物活性的合成肽或蛋白质，即仍然保持生物功能。在产生这种变化时，优选亲水指数为±2之内的氨基酸彼此置换。更优选置换是其中氨基酸亲水指数在±1之内的氨基酸。最优选置换是其中氨基酸亲水指数在±0.5之内的氨基酸。 

类似的氨基酸还可根据亲水性被置换。美国专利号4,554,101公开了蛋白质的最大的局部平均亲水性取决于其邻近氨基酸的亲水性，与蛋白质的生物学性质有关。下列亲水性的值已经指定到氨基酸：精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐/谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。因此，肽、多肽或蛋白质中的一种氨基酸可被另一个具有相似亲水性积分的氨基酸置换并且仍然产生具有相似生物活性，即仍然保持正确的生物功能的合成蛋白质。在产生这种变化时，亲水指数在±2之内的 氨基酸优选相互置换，亲水指数在±1之内的氨基酸是更优选的，而亲水指数在±0.5之内的氨基酸是最优选的。 

如上述所论述的，本发明的肽中氨基酸的置换可取决于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。为了产生导致所提供的肽内沉默变化的保守氨基酸变化，考虑到多种上述特征的例证性的置换可选自天然存在的氨基酸所属分类的其他成员。氨基酸可被分成下列四组：(1)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性的极性氨基酸；和(4)中性的非极性氨基酸。这些各个组内的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷的)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷的)氨基酸，例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性的极性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性的非极性氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。应该注意到不被预期为有益的变化，如果其可导致生产功能性的序列，也可以是有用的。 

术语蛋白质也包括已经加入了一种或多种取代基团的蛋白质形式。取代是通过置换另一个原子或原子团而被引入分子的原子或原子团。这种基团包括但不限于脂类、磷酸基、糖和碳水化合物。因此，术语蛋白质包括，例如脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白和磷脂蛋白。 

III.本发明的组合物和方法 

本发明的另一个方面提供用于治疗或预防心血管疾病的组合物。一个实施方案中的组合物包括已经加入了分离的油体缔合蛋白质的以植物为基础的食品。在本发明的一个实施方案中，食品是以大豆为基础的。在另一实施方案中，组合物包括分离的大豆物质、分离的油体缔合蛋白质和至少一种选自由基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物组成的添加化合物。在本发明的某些实施方案中，分离的油体缔合蛋白质可以是分离自植物蛋白的纯化级分。例如，分离的油体缔合蛋白质可以相对于天然的植物蛋白富集1、10、100、200、1000或以上倍。在本发明的某些实施方案中，可以富集分离的油体缔合蛋白质，为的是相对于，例如纯化级分如HMF油体缔合蛋白质被富集1、5、10、50或100以上倍。 

用于本发明的分离大豆物质可从任何大豆植物制备和分离，达到分离的大豆物质包含为了使该分离大豆物质显示所需要的低血胆固醇活性所必需的成分的程度。分离的大豆物质可包括，例如，粉碎的完整大豆、大豆细粉、豆奶粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、大豆浓缩物、大豆蛋白质分离物和大豆蛋白质提取物。在一个实施方案中，大豆物质是大豆浓缩物。在另一实施方案中，大豆物质是大豆蛋白质的分离物。在进一步的实施方案中，大豆物质是大豆蛋白质的提取物。本领域已知的任何方法，包括在此详述的方法，可用于分离特定的大豆物质。 

本发明的一个方面提供富含某些大豆蛋白质或肽，例如β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和油质蛋白的分离的大豆物质。这些大豆物质可从分离物、浓缩物或从分离物和浓缩物产品的废液制备。它们还可从具有改进的蛋白质组成的大豆制备，例如具有两倍于正常水平的β-伴大豆球蛋白和低水平的大豆球蛋白的大豆(例如在美国专利号6,171,640中所描述的)。 

食物制品对于本领域的技术人员来说是众所周知的。就大豆来说，常见的食品用途包括但不限于，例如种子、豆芽、烘焙大豆的产品，用于各种烘焙产品的全脂大豆细粉，用作糕饼、大豆果仁酱、大豆咖啡的烘烤大豆，以及其他东方食品的大豆衍生物。大豆蛋白质产物(例如，粗粉)，可分为兼备食品/饲料以及工业用途的大豆细粉浓缩物和分离物。大豆细粉和颗粒经常用于肉类补充剂和类似物、宠畜食品、焙烤食品配料和其他食品产品的制造。从大豆细粉和分离物制备的食品产品包括婴儿食品、糖果产品、谷类、食品饮料、面条、发酵粉、啤酒、麦芽酒等。 

在本发明的某些方面，向缺乏、或包含低量的某些种类，例如油质蛋白的大豆蛋白质的分离的大豆物质，添加例如油质蛋白的油体缔合蛋白质，从而改善或恢复大豆蛋白质或大豆蛋白质组合物的低血胆固醇特性。在本发明进一步的实施方案中，加入油体缔合蛋白质达到大约0.5％、1％、3％、5％、10％、20％以上重量的终浓度，包括在这些浓度内的所有中间范围。根据特定的应用，没有油质蛋白或具有降低量的油质蛋白的大豆物质可能是高度有益的。例如，油质蛋白可能被认为是不合需要的，因为它们限制了风味，导致大豆食品的风味品质相 对较差。此外，油质蛋白也是不易溶解的，并且当脱脂豆奶分散在水中时导致较大的颗粒级分。在一个实施方案中，可通过让包含油质蛋白的大颗粒级分在槽中沉淀或通过利用超滤膜而除去油质蛋白。备选地，可在pH 2.8，在存在硫酸钠和氯化钙时从大豆蛋白质分离物中沉淀油质蛋白(Samoto等人，1998)。 

本发明也包括包含分离的大豆物质和分离的油体缔合蛋白质的组合物，其中分离的大豆物质是大豆蛋白质分离物的高分子量级分(“HMF”)。用于本发明的任何组合物的HMF可从任何植物蛋白的分离物制备和分离，其中该植物蛋白分离物天然存在，达到该级分具有所需要的低血胆固醇活性的程度。在一个实施方案中，HMF从大豆蛋白质来源制备。可从中制备HMF的一般的大豆物质包括大豆、去皮大豆、大豆粗粉、大豆细粉、大豆粒、豆奶粉、大豆片(全脂和脱脂的)、大豆糖浆、大豆蛋白质浓缩物、大豆乳清、大豆乳清蛋白和大豆蛋白质分离物。在优选的实施方案中，HMF是从大豆蛋白质分离物制备的。 

为了制备HMF，所选择的植物蛋白分离物受到水解性或化学性的消化。用于该消化过程的一般试剂包括胃蛋白酶或微生物的蛋白酶。一般地，例如，将大豆蛋白质与胃蛋白酶一起孵育13-17hrs，(水相中的0.2％NaCl，38℃，pH 1.1)，胃蛋白酶是大豆蛋白质分离物的0.5-5％)，于90℃热处理20分钟使胃蛋白酶失活，在冰上冷却，用Na₂CO₃调节pH为6-7，并且于4,500g离心20分钟。然后可用水洗涤该沉淀颗粒3次并鉴定。使用胃蛋白酶的其他方法是本领域公知的。 

微生物的蛋白酶，例如可以是Sumizyme FP(黑曲霉(Aspergillus niger)蛋白酶，酶活性48800U/gm，Shin Nippon Kagaku Kabushiki Kaisha)并且与大豆蛋白质于60℃孵育5hrs.当使用这种溶液，不用调节pH，而是用水稀释溶液。然后于10,000×g进行离心10分钟。再收集沉淀物并鉴定。附加的方法是本领域已知的。参见，例如，Hori等人(1999)。 

然后通过本领域通常已知的任何方式从消化的植物蛋白分离物中分离HMF。在一个实施方案中，通过离心分离HMF。一般地，可例如通过干燥(例如，冷冻干燥)用微生物蛋白酶或胃蛋白酶(蛋白酶是总蛋白的0.5-6％)处理并且于30-70℃孵育大豆蛋白质分离物的水悬浮物离心后的级分1-20小时，进行分离步骤。附加的方法是本领域公知 的。参见，Nagoako等人，(1999)。 

此外，分离自HMF的任何肽都可用于本发明的组合物并达到该肽具有所需的低血胆固醇活性的程度。然而一般地，用于组合物的肽是至少10个氨基酸残基的长度，更一般地是大约10至大约100个氨基酸残基长度，并且最一般地是大约30-80个氨基酸残基的长度。一般说来，在自然界中肽是基本上疏水的，具有大约超过30的重量百分数到优选大约超过35的重量百分数的疏水氨基酸组成成分。此外，所使用的肽可具有0、1或更多个两亲性的区域。另外，所使用的肽可具有疏水性表面或疏水性的区域，其不是由于一系列疏水的氨基酸，而是由于肽的螺旋结构导致的. 

本发明的另一个实施方案提供包括分离自大豆物质的分离大豆多肽的组合物，其中大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的结构在上面有详细描述，并且关于它们结构的详述由Utsumi等人(1997)提供。申请人不受限于单个理论，相信这些肽具有低血胆固醇活性，因为它们能够免于消化并且被吸收到血流中或结合胆汁酸。同样是有益的，尽管是不需要的，在β-伴大豆球蛋白内存在两亲性的α-螺旋区域。不限制于应用任何单个理论，相信两亲性α-螺旋区域的存在是有益的，因为它形成促进与各种赋予低血胆固醇活性的重要受体位点相互作用的疏水性表面. 

另外，并且申请人不限制于任何单个的理论，本发明的鉴定的多肽也可作为结肠中有益细菌的氮源。这些细菌能因此产生短链脂肪酸，例如正面影响脂类代谢的丙酸。短链脂肪酸抑制肝中脂肪酸的合成，降低甘油三酯分泌的比率以及减少肝性胆固醇的合成。本发明的一方面是利用大豆蛋白质多肽促进结肠中短链脂肪酸的产生并且减少血清胆固醇和甘油三酯。未消化的大豆多肽促进结肠中有益细菌生长的有效性可能在存在未消化的碳水化合物，例如为人类结肠的微生物群提供重要燃料的高直链玉米淀粉时是最显著的。因此本发明的另一个实施方案是大豆多肽配料与未消化的碳水化合物源的组合以优化多肽对血清胆固醇和甘油三酯的有益作用。 

因此本发明的一个方面，提供具有分离自β伴大豆球蛋白的特异多肽的组合物。一般说来，这些多肽序列相应于SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11的氨基酸序列中的任何一个。这些序列可通过一种方法从β-伴大豆球蛋白中分离，例如该方法包括：(1)大豆物质的酶促水解，然后是例如通过离心分离高分子量的级分，或(2)大豆物质的酶解，然后进一步通过超滤膜、离子交换树脂柱和凝胶过滤柱色谱法进行纯化，给出大约200至大约5,000千道尔顿分子量范围的肽(参见，例如，在Yamauchi和Suetsuna(1993)中详述的方法)。肽可进一步通过使用离子交换色谱(Chen等人，1995)分级。备选地，不是从特定的β-伴大豆球蛋白亚基中分离个别的序列，而是利用具有两倍于正常水平的β-伴大豆球蛋白的大豆和仅仅从大豆分离的β-伴大豆球蛋白分离序列也是可能的。同样地，利用其中只表达特定的β-伴大豆球蛋白亚基以获得该亚基的天然制品的相同胚质也是可能的。然后在肠道中通过胃蛋白酶和胰酶水解消耗该天然制品后产生活性肽，或使用微生物酶在成分制造期间获得活性肽。因此，在本发明的另一个实施方案中提供包括与油质蛋白制品组合的β伴大豆球蛋白的特定亚基的粗制品的组合物。 

本发明的另一方面提供具有分离自大豆球蛋白的特异多肽的组合物。在一个实施方案中该组合物包含分离自大豆球蛋白碱性亚基的多肽。在另一实施方案中，该组合物包括分离自大豆球蛋白B-1b亚基的多肽。在优选的实施方案中，组合物包括分离自大豆球蛋白，相应于SEQID NO：1的氨基酸序列的肽。一般地大豆球蛋白利用本领域公知的分离方法分离自蛋白质源。这些分离方法的实例是用于分离如上述列出的其他蛋白分离物的方法。 

本发明的组合物一般也包含油体缔合蛋白质。如在此所使用的，术语“油体缔合蛋白质”包括与油体结构或胞内脂类颗粒物理上相关的任何蛋白质、脂蛋白或肽。一般说来，来自例如植物、哺乳动物、非哺乳动物细胞、藻类和酵母种属的大多数真核细胞包含胞内脂类颗粒。这些颗粒被称为脂质体、脂质小滴或，特别是在植物中根据种属的不同，被称为油体、油质体或圆球体。真核细胞的脂类颗粒由中性脂类的高度疏水核心，主要为甘油三酯和/或固醇酯，由磷脂单细胞层与少量包埋的蛋白质围绕组成。分离自玉米的油体的典型组合物是三酰基甘油(95％)、二酰基甘油(4％)、磷脂(0.9％)和蛋白质(1.4％)。 

可在本发明的组合物中使用的一般的油体缔合蛋白质包括油体蛋 白质，例如脱辅基蛋白形式的油质蛋白，或脂蛋白以及与油体缔合的34-kD的大豆种子贮藏液泡蛋白质。因此本发明的一个方面提供包括分离的大豆物质和分离自油体缔合蛋白质的肽的组合物，其中该肽是油质蛋白或来自油质蛋白的肽片段。油质蛋白可由P24油质蛋白同工型A(P89)，登记号P29530的序列表示，如SEQ ID NO：12所提供的，并且相应于图1；P24油质蛋白同工型B(P91)，登记号P29531，如SEQID NO：13所提供的，并且相应于图2；油体缔合蛋白质17kDa油质蛋白(oleo 17)，登记号AAA68066，如SEQ ID NO：14所提供的，并且相应于图3；油体蛋白质16kDa油质蛋白(oleo 16)，登记号AAA68065，如SEQ ID NO：15所提供的，并且相应于图4；油质蛋白KD18(KD18；L2)登记号AAA67699，如SEQ ID NO 16所提供的，并且相应于图5；以及向日葵油质蛋白，登记号CAA55348，如SEQ ID NO：17所提供的，并且相应于图6。更一般地，用于组合物的肽来自于分子量近似为17千道尔顿的低分子量油质蛋白。在某些实施方案中，肽来自于油质蛋白，并且相应于SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。 

用于本发明组合物的油质蛋白肽可分离自完整的油体。因此，完整的油体可从作为油体缔合蛋白质源的种子分离。例如在WO 00/30602中，提供了所能使用的方法和种子类型的列表。用于制备油体的方法也在日本专利申请公开号2002-101820中有描述。油可用二乙醚从油体中提取，使分界面物质(油质蛋白和磷脂)留在含水的级分中。磷脂可利用氯仿/甲醇(2∶1，vol/vol)或其他合适的有机溶剂提取。特别地，油质蛋白以聚集的级分形式分离(Tzen和Huang 1992)。此外，如果存在高pH提取法，则可用于除去P34蛋白质。P34蛋白质具有低于6.5的等电点pH，因此，可在高pH中溶解，其中油质蛋白具有其自己的等电点pH并且沉淀下来。 

油质蛋白也可分离自浸水的完整大豆或来自脱脂大豆粉。油质蛋白可利用本领域公知的分离方法分离自蛋白质源。这些分离方法的实例是如上述所列出的，用于从脱脂大豆粉分离油质蛋白的方法。另一个实例是从完整的大豆分离油质蛋白(JP 2002-101820)。油质蛋白的另外来源包括植物细胞、真菌细胞、酵母细胞(Leber等人，1994)、细菌细胞(Pieper-Fürst等人，1994)和藻类细胞(Roessler，1988)。 

在本发明优选的实施方案中，油质蛋白是从植物细胞获得的，包括来自花粉、孢子、种子和营养体植物器官的细胞，其中存在油质蛋白或油体类细胞器(Huang，1992)。更优选地，本发明的油质蛋白从植物种子获得，并且最优选地植物品种包括：油菜籽(芸苔属Brassica spp)、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(Gossypium spp)、落花生(Arachis hypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Ricinus cummunis)、红花(Carthamus tinctorius)、芥菜(芸苔属和白芥sinapis alba)、芫荽(Coriandrum sativum)、squach(笋瓜Cucurbita maxima)、lineseed/亚麻(Linum usitatissumum)、巴西果(Bertholletia excelsa)、希蒙德木(Simmondsia chinensis)、玉米(Zea mays)、海甘蓝(Crambe abyssinica)，以及毛虫(Eruca sativa)。 

本发明的另一方面包括包含分离的大豆物质和分离自其中肽是脂蛋白的油体缔合蛋白质的肽的组合物.脂蛋白是在动物和植物细胞中发现的中性脂类、磷脂和蛋白质的非共价的、非化学计量的颗粒复合物。在一个实施方案中，脂蛋白是哺乳动物脂蛋白。在另一实施方案中，脂蛋白是蛋黄脂蛋白(关于蛋黄结构的评述，参见实施例，Bringe(1997)，其内容由此引入作为参考)。在另一个实施方案中，脂蛋白包含脂肪球蛋白的膜蛋白。 

脂蛋白可利用本领域公知的方法分离自油体缔合蛋白质来源.这些分离方法的实例是如上述所列出的，用于从脱脂大豆粉分离油体蛋白质或油质蛋白的方法。此外，蛋黄脂蛋白可利用本领域公知的分离方法分离自油体缔合蛋白质来源。 

这些分离方法的实例是，蛋黄脂蛋白可通过利用超临界状态的二氧化碳提取甘油三酯和胆固醇而分离(参见实施例，Bringe和Cheng，1995)。本发明进一步的方面提供包含与油体缔合蛋白质和添加化合物结合的大豆物质的组合物。添加化合物可包括治疗性地增强该组合物的任何化合物。然而一般地，添加化合物选自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。一般说来，不受任何特别的理论的约束，相信这些添加化合物基本上通过预防分离的大豆物质中降低胆固醇的多肽的消化而增强组合物的低血胆固醇活性。由于这些特性，本发明的添加化合物增加组合物的治疗能力。因此在优选的实施 方案中，本发明的组合物可具有上述鉴定的特异添加成分与分离大豆物质和分离油体缔合蛋白质组合的任何组合。 

因此在一个实施方案中，本发明的组合物可包括一种到几种皂角苷作为添加化合物。皂角苷可通过任何已知的方法分离自其天然存在的植物来源，例如Gurfinkel等人(2002)的方法，或可通过任何已知的方法合成制备。皂角苷适合用于本发明，达到使所选择的化合物能增强组合物用作为低血胆固醇试剂的特性的程度。然而一般地，所使用的皂角苷分离自例如紫花苜蓿或大豆植物的豆类，或来自燕麦或其他植物的种子。更一般地，皂角苷分离自大豆种子，以及具体地可分离自大豆胚。皂角苷的来源包括，例如，大豆、皂树属、苜蓿和皂树soapwart。大豆皂角苷包括例如，皂角苷A、B、E，和皂草精醇A、B和E。 

此外本发明的组合物可包括一种到几种植物雌激素作为添加化合物。植物雌激素可通过任何已知的方法分离自其天然存在的植物来源，例如美国专利号5,855,892或WO 00/30663中所详述的方法，或可通过任何已知的方法合成制备。任何植物雌激素适合于在本发明中使用，达到所选择的化合物增强该组合物用作低血胆固醇试剂的特性的程度。一般地，用于组合物的植物雌激素是异黄酮。更一般地，异黄酮是染料木黄酮、大豆黄酮(包括其代谢物o-去甲安格拉紫檀素、二氢claidzein和牛尿酚)、鸡豆黄素A、芒柄花黄素及其各自天然存在于大豆或三叶草中的糖苷和糖苷共轭物. 

本发明的组合物也可包括一种到几种磷脂作为添加化合物。磷脂可来自各种来源，但一般分离自例如种子，并且更一般地来自大豆植物的含油种子.这些磷脂包括卵磷脂和溶血卵磷脂。另外，可使用具有改进的脂肪酸成分的磷脂。这种磷脂可以是酶改进的大豆磷脂。酶改进的磷脂可例如从大豆磷脂(SLP；真卵磷脂，Mie，日本)通过用磷脂酶A2(Novo工业，Bagsvaerd，丹麦)处理而制备(Nagaoka，等人，1999)。另外，具有改进的脂肪酸成份的磷脂可从已经被遗传改变以产生具有改进脂肪酸成份的磷脂的植物或植物种子获得。具有改进的脂肪酸成份的磷脂的实例是具有改进的脂肪酸成份的卵磷脂。本领域公知的其他方法也可用于改进磷脂的脂肪酸成份。 

另外，本发明的组合物也可包括一种到几种碳水化合物。任何碳 水化合物可在本发明的组合物中使用，达到使所选择的化合物增强该组合物用作低血胆固醇试剂的特性的程度。然而一般地，所使用的碳水化合物是基本上抗消化的碳水化合物。如在此所使用的，当用于描述碳水化合物时，“基本上抗消化”在本领域中定义为，一般是指例如，碳水化合物大于大约70％抗消化，优选大于大约80％抗消化，以及更优选大于大约90％抗消化。一般说来，直链淀粉或纤维中富含的碳水化合物是特别适用于该组合物的。在一个实施方案中，例如，组合物中所使用的碳水化合物是高直链淀粉、低聚果糖或大豆子叶纤维。此外，实施方案是例如，物理上难接近的淀粉(部分碾碎的谷粒和种子)、抗性的颗粒(生的马铃薯、未成熟的香蕉、一些豆类和高直链淀粉)、退行性淀粉(蒸煮并冷却的马铃薯、面包和玉米片)，以及化学上改性的淀粉(醚化的、酯化的或交联的淀粉(用于加工食品))(Topping和Clifton，2001)。 

在存在或缺少至少一种添加化合物时，分离大豆物质和分离油体缔合蛋白质的任何组合可组合形成本发明的组合物。下列表1，例如说明用于组合物的不同实施方案的许多一般配方。 

表1.组合物的配方 

在本发明的一个实施方案中，组合物具有的分离大豆物质的含量不少于组合物重量的50％，并且油体缔合蛋白质含量不少于组合物重量的0.5％。然而更优选地，组合物具有的分离大豆物质含量不少于组合物重量的大约70-大约90％，并且油体缔合蛋白质含量占组合物重量的大约1至大约5％。当出现时，添加化合物例如异黄酮或皂角苷化合物一般包含不少于10mg/100g组合物，并且可进一步包含大约30-300mg的添加化合物/100g组合物。此外，当出现时，添加化合物例如基本上抗消化的磷脂或碳水化合物一般占不少于组合物重量的2％并且可进一步占组合物重量的大约10-50％。 

本发明的组合物可作为预防或治疗动脉粥样硬化和血管疾病的试剂而施用于哺乳动物。更具体地说，本发明的组合物可施用于哺乳动物，优选地用于人类，以降低总的血清胆固醇浓度，降低低密度脂蛋白的浓度，提高高密度脂蛋白的浓度，降低肝中胆固醇的浓度，并且降低血清甘油三酯的浓度。一般说来，不结合任何特别的理论，相信本发明的组合物通过预防胆固醇的吸收，基本上抑制胆汁酸的再吸收和/或可用作哺乳动物结肠中细菌的氮源而发挥它们的低血胆固醇活性。 

IV.药物组合物和给药 

可以把本发明的任何组合物配制为药物或营养组合物。这种组合物可通过口服、非肠胃方式，通过吸入喷雾、直肠、皮内地方式、透过皮肤或局部给药，以包含所需要的常规无毒性的药物学上可接受的载体、辅剂和载体的剂量单位剂型给药。局部的给药也可包括使用透过皮肤起作用的给药，例如透过皮肤起作用的小块或离子电渗装置。如在此所使用的，术语非肠胃方式的包括皮下的、静脉内、肌内的、或胸骨内的注射或输注技术。药物的剂型在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，(1975)，以及Liberman和Lachman(1980)中有论述。 

可注射的制剂，例如，无菌可注射的含水或油质的悬浮体，可根据本领域已知的，利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射的制剂也可以是在无毒性的非肠胃方式的可接受的稀释剂或溶剂，例如，1，3-丁二醇溶液中的无菌可注射溶液或悬浮液。可使用的可接受载体和溶剂是水、Ringer′s溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的固定油类作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于可注射的制剂中。可使用二甲基乙酰胺、表面活性剂包括离子的和非离子的洗涤剂，以及聚乙二醇。例如上述讨论到的溶剂和润湿剂的混合物也是有用的。 

在此论述的用于化合物的直肠给药的栓剂可通过混合活化剂和合适的无刺激性赋形剂，例如可可脂、合成的单、二或三酸甘油酯、脂肪酸或聚乙二醇而制备，它们在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，并且因此能在直肠中融化并释放药物。 

用于口服的固体剂型可包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，本发明的化合物通常与一种或多种适于指明给药途径的辅剂混和。如果口服给药，该化合物可与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、白明胶、阿拉伯树胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇混合，然后压成片剂或装入胶囊用于方便的给药.这种胶囊剂或片剂可包含可控制释放的剂型，例如可以 以活性化合物在羟丙基甲基纤维素中的分散相体形式提供。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括例如柠檬酸钠或碳酸钙或碳酸镁或碳酸氢盐的缓冲剂。片剂和丸剂可另外用肠溶衣制备。 

为了治疗的目的，用于非肠胃方式给药的剂型可以是含水的或无水的等渗无菌注射溶液或悬浮液的形式。这些溶液和悬浮液可从无菌的粉末或具有一种或多种所提到的供口服剂型之用的载体或稀释剂的颗粒剂制备。化合物可溶于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠和/或各种的缓冲液。其他的辅剂和给药模式是药物学领域中非常普遍已知的。 

用于口服的液体剂型可包括药物学上可接受的包含本领域通常所使用的，惰性稀释剂例如水的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。这种组合物还可包括辅剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂，以及甜味剂、调味剂和芳香剂。 

所施用的治疗性活性化合物的数量和使用本发明的化合物和/或组合物治疗心血管疾病状况的剂量方案取决于多种因素，包括受试个体的年龄、重量、性别和医学状况、疾病的严重程度、给药的途径和频率，以及所使用的特定化合物并因此可广泛地变化。通常可接受的和有效的每日剂量可以是每日大约0.1-大约6000mg/Kg体重，更一般地为每日大约100-大约2500mg/Kg，以及最优选地为每日大约200-大约1200mg/Kg. 

提供上面的发明详述是为了帮助本领域的技术人员实现本发明。即使如此，该发明详述不应被视为不适当的限制本发明，正如在此所论述的实施方案中的改变和变化可通过本领域的普通技术人员产生，而不背离本发明的发现的精神或范围。 

在本申请中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献在此全部引入作为参考，正如单独的出版物、专利、专利申请或其他参考文献被具体地并且分别地指明引入作为参考。 

不用进一步地详细描述，相信本领域的技术人员能够利用在前的说明书，最大程度地应用本发明。因此下列优选的具体实施方案仅仅被认为是例证性的，而不是以任何方式限制所公开的其余内容。 

V.实施例 

实施例1 

来自大豆蛋白质的HMF的鉴定 

存在于大豆蛋白质HMF中的多肽具有有效降低胆固醇的特性(参见实施例2)。进行研究以鉴定这些多肽的源点和部分序列。所使用的方法如下： 

A.聚丙烯酰胺凝胶电泳。 

根据本领域已知的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。本发明使用几种不同的方法，如下进行： 

B.Tris-甘氨酸十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 

通过冷冻完整的或磨碎的大豆制备用于分析的大豆蛋白质样品，将其在研钵中粉碎(粉碎不是为大豆蛋白质分离物所必需的)，并且利用0.03M Tris，0.01M 2-巯基乙醇在pH＝8.0，于室温下提取蛋白质1hr。制备这些蛋白质的4mg/ml的SDS溶解溶液(0.0625M Tris，2.3％SDS，5％β-巯基乙醇，10％甘油，pH6.8，微量的溴酚蓝作为示踪染料)。在70℃加热样品10分钟，冷却5分钟，然后离心沉淀不溶的物质。将5μL(20μg)的各个样品上清液加载到10-20％总的丙烯酰胺凝胶上(如Laemmli(1970)所描述的)并通过在每凝胶15-30mA(恒定电流)或60-100伏(恒电压)下电泳分离。当示踪染料在凝胶底部的2mm内时终止电泳。SYPRO橙可代替Malone等人，(2001)中的第2种方法后的考马斯。 

C.通过NuPAGE凝胶电泳分析SDS-PAGE 

利用4×NuPAGE LDS样品缓冲液(NOVEX目录号NP0003，以1/4的样品体积和1/10样品体积的500mM二硫苏糖醇，如Tris甘氨酸SDS-PAGE小节中所详述的制备样品。将4μL(16μg)的各个样品上清液加载到Novex 4-12％丙烯酰胺Bis-Tris凝胶上。用NuPAGE MES电泳缓冲液(50mM MES，50mM Tris，3.5mM SDS，1.025mM EDTA，pH＝7.7)充满Novex Xcel12小凝胶槽，并通过在200伏(恒压)下电泳直到示踪染料到达凝胶底部的齿缝而分离蛋白质。如在Tris-甘氨酸SDS-PAGE 方案中所详述的对凝胶染色。 

D.大豆蛋白质的2-D PAGE 

如在Tris-甘氨酸SDS-PAGE小节中所详述的提取大豆蛋白质。补充样品使其包含8M尿素，2％CHAPS，0.35％二硫苏糖醇，0.2％两性电解质和15％异丙醇，达到包含0.6-1.05mg总蛋白的450μL的终体积。利用430μL的该溶液使18cm的pH 3-10固定的pH梯度(IPG)的干胶条再溶胀24-30小时(再溶胀时用矿物油覆盖胶条)。利用水浸的电极胶条，使用下列电压斜线上升的方法聚焦IPG胶条(用矿物油覆盖)50,000-70,000伏-小时。从在100伏(v)1hr开始，然后在200v 1hr，在400v 2hrs，在400-10000伏的线性斜坡电压中14hrs，然后达到在10000伏48hrs以达到最后的伏-小时总数。在1.5mL的样品平衡溶液(62.5mM Tris，2.3％SDS，5％2-巯基乙醇，pH6.8，以及微量的溴酚蓝作为示踪染料)中浸泡各个IPG胶条3.5分钟。排干胶条，然后将每个放置在10-20％的丙烯酰胺Tris甘氨酸凝胶上，利用平衡溶液中的热的1％琼脂糖将其原位封闭。进行第二维的凝胶电泳，并且如Tris-甘氨酸SDS-PAGE小节中所详述的对其染色。 

E.蛋白质在丙烯酰胺凝胶中的原位胰酶消化 

切下凝胶条带或斑点，将其放置在1500μl硅化的微离心管中。用50％的甲醇洗涤两次(每次洗涤30分钟)以除去染料。在50％的乙腈(在200mM乙酸铵pH＝8.0中)中平衡凝胶片段15分钟。重复洗涤两次。100％乙腈洗涤15分钟，然后在Speedvac中蒸干.利用20μg/mL测序级的改进的胰蛋白酶(Promega目录号V5111)在200mM乙酸铵pH-8.0的10％乙腈中，于37℃胰蛋白酶作用16-20hrs。用50％的乙腈、0.1％的三氟乙酸(TFA)，用Nutator搅动提取肽20分钟。利用乙酸铵中的80％乙腈0.1％TFA重复提取20分钟。重复最后的提取30分钟。合并所有的上清液并在Speed-vac中干燥提取物。 

F.胰酶消化条带以提供存在于给定条带中的多肽的胰蛋白酶化多肽。 

为了提供存在于给定条带中的多肽的胰蛋白酶化多肽，根据下列 方法在凝胶中进行胰蛋白酶消化条带： 

1)切下凝胶斑点，使得任何片段的最大尺寸小于1mm。将凝胶块放置在1500μl硅化的微离心管中。 

2)用50％的甲醇洗涤凝胶块(每管200μl)2次以上(每次洗涤30分钟)以除去染色剂。考马斯染色的凝胶可能要附加洗涤次数以除去染色剂。凝胶块可保存在该溶液中。使用Nutator搅动试管。 

3)在200μl 50％的乙腈(在200mM乙酸铵中，pH＝8.0-用NH40H调节)中洗涤凝胶块两次，每次洗涤15分钟，然后另外洗涤一次30分钟。使用Nutator搅动。 

4)用100％的乙腈洗涤15分钟。 

5)从凝胶块除去溶液并且在Speedvac中蒸干(15分钟)。 

6)通过加入1ml的10％乙腈(在200mM NH40Ac中，pH 7.8-8.3-用NH40H调节)到20μg胰蛋白酶的小瓶中来制备胰蛋白酶的保存液。(使用Promega测序级改进的胰蛋白酶-目录号V5111)。 

7)通过加入刚好足够覆盖各个试管中的凝胶块的胰蛋白酶溶液消化蛋白质。一般地，20μl是足够的。 

8)于37℃孵育凝胶块16-20小时。 

9)冷却试管到室温，并且微离心试管以使水分到达底部。 

10)用200μl 50％的乙腈、0.1％的三氟乙酸(TFA)，用Nutator搅动，提取肽20分钟。 

11)分别保留各个试管的上清液，然后使用200μl的80％乙腈、0.1％的TFA，用Nutator搅动，再提取15分钟。 

12)保留上清液，加入先前保留的各个试管，然后使用200μ1 80％的乙腈、0.1％ TFA，在Nutator上搅动，最后一次提取30分钟。 

13)保留上清液，并且加入先前保留的各个试管。在Speed-vac中干燥提取物。 

G.MALDI-TOF分析 

将来自条带的胰蛋白酶化多肽利用激光解吸(用于MALDI)或电喷射(用于LC/MS和LC/MS/MS)电离以产生质谱。利用MALDI作为混合物对肽的质量进行测量；没有胰蛋白醇化肽的分离.利用略有改进的已发表的方法(Shevchenko等人，1996)制备样品用于MALDI分析。通 过向各个包含干燥肽的试管加入10μl的0.1％TFA恢复样品。通过将10mg/ml的硝化纤维素和20mg/ml的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶解于1∶1(v∶v)的丙酮与异丙醇的混合物制备基质。通过将0.5μl的基质溶液递送到MALDI平板上使基质成点。类似地，将来自各个样品的1μl样品放置到成点的基质上。容许样品在基质上干燥大约10分钟以保证肽结合硝化纤维素。最后，通过将5μl的5％甲酸沉淀到各个斑点上并且立即使用真空管吸除该溶液进行3次水性洗涤。然后将MALDI样板移动到质谱仪用于MALDI质谱分析。利用Voyager DE-STR(Perseptive生物系统，Framingham，MA)以反射的模式收集数据。利用已知的胰蛋白酶自溶峰值内部校准该谱。产生胰蛋白酶化肽的质量的峰值列表，并且针对NCBI非冗余的蛋白质序列数据库利用MS-Fit搜索工具搜索以鉴定该蛋白质(Clauser等人，(1999)。 

有时，匹配是“不明确的”并且需要证实，或数据是微弱的或根本没有显著的匹配.在这些情况下，使用纳LC/MS/MS。在该方法中，将消化的混合物注射到反相柱上以使得肽分离并且一次一个(或至少一次一对偶联)地被引入质谱仪(在该情况下为电喷射的串联质谱仪)。质谱仪测量肽的质量，通过滤掉一切别的东西分离最多量的物质，并且将肽发送到碰撞测定池中，其中该肽碰撞氩气。肽趋向于在酰胺键附近破裂成碎片，所以该片段能表现出氨基酸序列。裂解数据可被送到数据库搜索工具，其将该数据与蛋白质序列数据库相匹配。它使用胰蛋白酶化肽的部分序列和初始质量来得到匹配。可利用高置信度的单一胰蛋白酶化肽的MS/MS数据鉴定蛋白质。 

H.纳HPLC 

使用纳HPLC从纯化的蛋白质(通过电泳纯化)分离胰蛋白酶化片段，以使得一次只将一个(或一些)肽引入电喷射的串联质谱仪。将样品注入到装备有自动取样器、梯度和辅助泵的CapLC(Waters，Milord，MA)系统.将5微升经“微升捡拾”模式注射并且通过300μm×5mm的C₁₈截留柱(LC Packings，San Francisco，CA)即时脱盐。样品在高流速(30μL/min)下脱盐3分钟。在引入质谱仪前，在100μm×150mm的Magic C₁₈柱(Michrom BioResources，Auburn，CA)上分离肽。使用一般从低到高有机的反相梯度超过大约30分钟。流动相A是0.1％ 的甲酸而B是100％的乙腈，0.1％的甲酸。流速也随有机的流动相线性增加。该系统使用小的分流，产生大约300-700nL/min的柱流速。 

I.MS/MS分析和数据处理 

对于LC/MS/MS，有分离的步骤(反相LC)，以使得胰蛋白酶的肽一次一个地被引入质谱仪(理论上)。它被称为MS/MS，或串联的MS，因为首先测量肽的质量，其次测量该肽的片段的质量。胰蛋白酶化的肽通过与稳态的气体(Ar)碰撞而成碎片并且测量片段的质量。这可能经常给出至少部分的肽序列。在Q-Tof质谱仪(Micromass，Beverly，MA)上进行数据依赖的MS/MS研究。入口是被设计成能保持兆分之一尖的改进的纳喷射源(New Objective，剑桥，MA)。根据肽的质量和电荷状态确定用于CAD的碰撞能量。通过ProteinLynx版本3.4(Micromass，Beverly，MA)处理数据以产生峰值列表文件。利用搜索引擎MASCOT(Matrix Science，伦敦，英国)针对NCBI非冗余的蛋白质序列数据库搜索数据。搜索引擎报告上端的20个记录。将不与该数据库中的任何条目相配的序列数据针对NCBI的dbEST数据库以及内部生成序列数据库进行搜索。 

J.研究1 

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自被称为富含OBAP的大豆蛋白质分离物的HMF。将包含多肽的5个条带或凝胶区域进行胰蛋白酶作用并且利用质谱法分析氨基酸序列(图7)。鉴定了条带的起源如Table 2中所示： 

表2. 

*同时对齐大豆球蛋白序列以确定G1大豆球蛋白(72296，AlaBx前体)(SEQ ID NO：1)的碱性亚基的残基401-435(VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK)(SEQ ID NO：1)： 

A VFDGELQEGR和SQSDNFEYVSFK 

B 与A中的2个相同，加上：VLIVPQNFVVAAR 

K.研究2 

上述推定的油质蛋白序列与已知的油质蛋白序列不相配。低分子量的大豆油质蛋白(～18kDa)的序列不是已知的。下列研究的目的是确定上述“推定的油质蛋白”序列是否来自于18kDa的大豆油质蛋白。在聚丙烯酰胺凝胶上纯化和分离油体缔合蛋白质(p34蛋白质和油质蛋白)(图8)。胰蛋白酶化该条带并且通过MS分析。 

在分离自HMF的12kDa条带中证实存在胰蛋白酶化的肽，其从油质蛋白右侧紧邻疏水结构域的两亲性的N-末端区域释放。每个氨基酸的平均质量是111.1道尔顿。因此，12kDa肽中氨基酸的数目是大约108个氨基酸。因此，在HMF中发现的肽必须也包含油质蛋白的一部分疏水结构域。序列YETNNSSLNNPPSR(SEQ ID NO：10)表示推定的油质蛋白的残基33-45，其刚好落在蛋白质疏水核心区域的开始部分前。 

结果：证实序列YETNSSLNNPPSR(SEQ ID NO：10)是在低分子量的大豆油质蛋白中发现的。 

表3. 

L.研究3 

在研究1中表征的HMF由具有小的β-伴大豆球蛋白的大豆蛋白质级分组成。这有助于鉴定存在于HMF中的大豆球蛋白亚基。进行下列研究确定(如果有的话)可能在HMF中鉴定出什么β-伴大豆球蛋白序列。使用缺乏G1大豆球蛋白的大豆产生大豆蛋白质分离物并且用胃蛋白酶消化该分离物以产生HMF。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离HMF(图9)并且将该条带用胰蛋白酶作用并且利用MS表征。 

结果：确定来自β-伴大豆球蛋白的多肽序列. 

表4. 

  条带   来自MALDI的蛋白质鉴定   A1   β-伴大豆球蛋白的β亚基   A2   与A1相同   A3   β-伴大豆球蛋白的α或α-主要的亚基*   A4   与A3相同的肽   A5   与A3相同的肽   A6   与A3相同的肽

*前体α-主要的β-伴大豆球蛋白(121286)：QNPSHNKCLR(SEQ ID NO：18)，和下列4191814中的序列。 

*β-伴大豆球蛋白(4191814)的α-主要的亚基：NQYGHVR(SEQ ID NO：6)，和下列7442025中的序列。 

*β-伴大豆球蛋白的α亚基(7442025)： 

NILEASYDTKFEEINK(SEQ ID NO：8)，LQESVIVEI SKK(SEQ ID NO：4)，QQQEEQPLEVRK(SEQ ID NO：5)

实施例2 

HMF对胆固醇摄取的作用 

Caco-2细胞系来源于人结肠直肠癌并且通常用于研究肠内上皮细胞的生理学。这些细胞已经用于研究胆固醇、葡萄糖、氨基酸、维生素、脂肪酸、胆汁酸和药物转运过程(Hidalgo等人，1989)；Artursson，1990；Homan和Hamelehle，1998)。这些细胞表达脂类和固醇代谢酶以及调节类似于肠细胞内转运蛋白的转运蛋白(Levy等人，1995)。此外，已知它们表达SR-B1，最近鉴定的可能在胆固醇吸收中起作用的蛋白质(Werder等人，2001)以及ATP-结合盒转运家族中的多种蛋白质，也在经肠内上皮细胞的胆固醇摄取的调节网中起一定作用(Taipalensuu等人，2001)。 

大豆蛋白质是HMF的来源。简要地，将大豆蛋白质与胃蛋白酶孵育17小时(在水相中0.2％NaCl，38℃，pH 1.1，胃蛋白酶占大豆蛋白质分离物的5％)，在90℃加热处理20分钟以使胃蛋白酶失活，在冰上冷却，用0.2M的Na₂CO₃调节pH到6.21并在4,500g离心20分钟。将该沉淀颗粒用水洗涤3次并且确定为HMF。 

A.培养Caco-2细胞用于胆固醇吸收分析 

1.用鼠尾胶原按如下方式预涂层96-孔Costar固体空白的组织-培养处理平板(Costar #_3917)： 

a)在0.02N的乙酸中制备20μg/ml的鼠尾胶原溶液(Becton Dickinson/Collaborative Biomedical产品目录号40236)： 

0.02N乙酸：加入11.5ml的17.4N乙酸/10m无菌的H₂O每10ml的0.02N乙酸加入60μl的胶原(3.32mg/ml) 

b)对于96孔平板，加入250μl的胶原溶液/孔，并且容许覆盖薄层在室温下保持过夜 

c)用1×250μl的DMEM漂洗各个孔，然后用100ml的DMEM漂洗 

2.用10ml无Ca²⁺和Mgt²⁺的Dulbeco′s磷酸盐缓冲盐水漂洗长到70 -80％满的2个T-150培养瓶(Costart #430825)的Caco-2细胞(使用传代数目在41和60之间的细胞)。 

3.向各个培养瓶加入6ml的0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液并且在37℃孵育5-10分钟。 

4.使用10ml移液管将细胞从T-150培养瓶上洗下并且打碎细胞凝块。转移细胞悬浮物到50ml的试管中。 

5.向细胞悬液中加入具有10％胎牛血清、1×非必需氨基酸、50mg/ml庆大霉素的12ml完全培养基DMEM，混合并且通过在2000rpm离心5分钟(Sorvall RT7)沉淀细胞颗粒。 

6.除去培养基并替换为20ml的完全培养基.使用10ml移液管分散细胞。[2×T 150培养瓶～80％长满～10×10⁶细胞]。 

7.将细胞以每孔3200个细胞/100μl的密度接种到96孔包涂胶原的微量滴定板中。 

8.隔日地用完全培养基培养细胞。接种13天后细胞将表达为胆固醇吸收所必需的表面受体。 

B.胆固醇吸收分析 

经Caco-2细胞的微团胆固醇的摄取是通过由Field等人(1991)所报道的改进方法进行的。我们的方法描述如下： 

1.将待检测的能够在Caco-2细胞中抑制胆固醇吸收的化合物/肽溶解在DMSO中作为贮备原液.在戊醇中从贮备原液制备待测化合物的稀释物。用于Caco-2胆固醇吸收抑制分析的稀释化合物应该比所需要分析的最后稀释物高出10倍，即吸出孔中的2mM溶液最后可得到200μM用于分析。将二氢谷甾醇用作对照的胆固醇吸收抑制剂，其最大的抑制在200mM(0％胆固醇吸收调节)。溶剂只用作100％胆固醇吸收(高dpm)。 

2.将对照和待测试的化合物/肽的稀释物一式三份地吸到聚丙烯浅孔的微量滴定板(Sigma M-4029)中。 

3.平板在GeneVac仪器中于35℃-45℃的温度下干燥过夜。在下一步前检查平板是否完全干燥。 

4.在具有隔膜衬里盖子的Trace-Clean琥珀色小瓶(VWR产品目录号15900-036)中如下制备³H-胆固醇微团混合物： 

对于1.0ml的10×原液微团溶液(10×原液微团溶液＝50mM牛磺胆酸盐、1mM油酸、1mM胆固醇)，加入37.5μl³H-胆固醇(NEN产品目录号NET-725)(0.75nmo l胆固醇)＝37.5μCi ³H-胆固醇(溶液包含0.075％胆固醇作为放射性标记＝示踪)。对于每个微滴定分析平板制备1.8ml以供超出之用。 

5.将15μl/孔的稀释剂CH₃Cl∶MeOH(1∶1)吸量到干燥平板的所有孔中以溶剂化干燥的残留物。使用聚丙烯液槽达此目的并且在冰上保持液槽以最小化溶剂的蒸发。 

6.对于相同的平板，利用冰上的聚丙烯液槽向各个孔加入15μl的 ³H-胆固醇混合物以包含放射性标记的溶液。 

7.在预加热的37℃蒸发室(VWR)中用氮气冲洗干燥平板大约20-30分钟。 

8.用50μl/孔的乙醚漂洗干燥的孔并且在蒸发室中再干燥。重复乙醚漂洗多于一次并且干燥。 

9.将平板放置在真空干燥器中过夜。 

10.利用Quadra 96操作装置吸量150μl室温的Hank′s平衡盐液(HBSS)(Sigma H-8264)到各个干燥的孔中。微团脂类的终浓度如下：5mM牛磺胆酸盐、100μM油酸、100μM胆固醇和3.75μCi/ml³H-胆固醇(或大约5μM)。 

11.用粘性密封带(Packard TopSeal-A粘合封带或Sigma聚酯薄膜封带T-2162)密封平板并且于室温在Labline平板震荡器，型号4625，(设置＝6)上摇动至少30分钟以溶解微团。 

12.用HBSS利用自动细胞洗涤仪洗涤接种在96孔平板上的Caco-2细胞(如上所述)5次。刚好在步骤13前进行。在下一步加入微团前通过在纸巾上拍打平板除去任何过量的液体。 

13.利用Quadra 96操作装置将100μl溶解的微团转递到适当标记的Caco-2细胞平板中。将平板放回37℃的恒温箱4hr。 

14.利用自动的细胞洗涤仪，用冷的HBSS中的1mM牛磺胆酸盐((1mM TC)洗涤细胞5次。 

15.利用Quadra 96操作装置吸量200μl/孔的闪烁混合物(Packard MicroScint 40，产品目录号6013641)到细胞平板中。 

16.用热封带密封平板(Packard TopSeal-S热封薄膜)并且摇 动平板(设置至少＝6)至少20分钟以混合发光物和细胞样品。

17.在黑暗中保持平板过夜。 

18.利用Packard TopCount NXT仪器计算dpm。 

19.将结果计算为占对照(没有抑制剂)的％，如下所示： 

多种来源的大豆HMF显示出经Caco-2细胞的胆固醇摄取的剂量依赖性抑制(例如，参见图10)。除β-伴大豆球蛋白测试外(4.7mg/mL)，需要减少50％胆固醇摄取的HMF的浓度在1.2-2.9mg/mL之间。 

实施例3 

HMF作用机理的分子药理学表征. 

为了确定待测试化合物/肽是否影响³H-胆固醇在制备用于胆固醇吸收分析的微团溶液中的溶解度(参见实施例2的方法)，进行下列分析： 

1.如实施例2的方法所描述的，至多到并且包括步骤#11来制备微团。 

2.利用Quadra 96操作装置将20μl溶解的微团转送到不透明的Costar平板(Costar #3917)中。 

3.利用Quadra 96操作装置吸量200μl/孔的闪烁混合物(Packard MicroScint 40，产品目录号6013641)到微量滴定板的孔中。 

4.用热封带(Packard TopSeal-S热封薄膜)密封平板并且摇动平板(设置至少＝6)至少20分钟以混合发光物和微团样品。

5.在黑暗中保持平板过夜. 

6.利用Packard TopCount NXT仪器计算dpm. 

7.将结果计算为占对照(没有抑制剂)的％，如下所示： 

8.如果待测试的化合物/肽替代来自微团的³H-胆固醇，对于较高浓度的待测试化合物/肽，将观察到待测试化合物/肽dpm的减小。否则，溶解微团中的dpms将在所测试的待测试化合物/肽的稀释范围内保 持相当地恒定。 

图11说明这与经二氢谷甾醇抑制胆固醇的主要机理形成对比。 

实施例4 

大豆蛋白质HMF的特性 

比较来自具有低量油体缔合蛋白质(OBAP(-))，富含油体缔合蛋白质的级分(OBAP(+))的大豆蛋白质分离物级分和对照的HMF的产率。所有这些由相同的大豆(品种A2247)制成。 

简要地，将大豆蛋白质的级分与胃蛋白酶孵育17小时(水相中的0.2％NaCl，38℃，pH 1.4，胃蛋白酶占大豆蛋白质分离物的5％)，在90℃热处理20分钟使胃蛋白酶失活，在冰上冷却，用0.2M Na₂CO₃调节pH到6.21并且在4,500g离心20分钟。用水洗涤沉淀颗粒2次并且冷冻干燥。将干燥的沉淀颗粒的重量与用于确定HMF产率分析的原始数量的大豆蛋白质分离物的重量相比[(最后重量/起始重量)×100]。OBAP(+)和对照的大豆蛋白质样品都产生HMF。然而，OBAP(-)级分不产生任何HMF，表明油质蛋白和或与油质蛋白相关的成分(例如皂角苷、磷脂)控制大豆蛋白质的可消化性。 

下列是用于分级大豆蛋白质成为大豆蛋白质分离物(SPI)的方法： 

A.方法1：OBAP(-) 

1.将1kg脱脂大豆片(来自Cargill)加入到15kg的去离子水中。用1N的NaOH调节pH到7.5。在室温下混合1小时。 

2.在10,000g离心混合物10分钟并收集上清液。 

3.将Na₂SO₄和CaCl₂以30mM的浓度分别加入到上清波中。 

4.用2N的HCl调节步骤3的上清液的pH到pH 2.8。10,000g离心混合物10分钟。收集上清液. 

5.用4倍的去离子水(例如，从1L到4L)稀释上清液(来自步骤4)。用2N的NaOH调节pH到4.5。在10,000g离心10分钟。收集沉淀。 

6.再溶解来自步骤5的沉淀物到去离子水中并且用2N的NaOH调节pH到7.5。 

7.在入口温度＝200℃，出口温度＝90-95℃下，喷雾干燥中 和的蛋白质混合物. 

B.方法2：OBAP(+) 

1.将1kg脱脂大豆片(来自Cargill)加入到15kg的去离子水中。用1N的NaOH调节pH到7.5。在室温下混合1小时。 

2.在10,0008离心混合物10分钟并且收集上清液。 

3.将Na₂SO₄和CaCl₂以30mM的浓度分别加入到上清液中。 

4.用2N的HCl调节来自步骤3的上清液的pH到pH 2.8。在10,0008离心混合物10分钟。收集沉淀物。 

5.再溶解来自步骤4的沉淀物到去离子水中并且用2N的NaOH调节pH到7.5. 

6.在入口温度＝200℃，出口温度＝90-95℃下，喷雾干燥中和的蛋白质混合物。 

C.方法3：对照 

1.将1kg脱脂大豆片(来自Cargill)加入到15kg的去离子水中。用1N的NaOH调节pH到7.5。在室温下混合1小时。 

2.在10,000g离心混合物10分钟并收集上清液。 

3.用4倍的去离子水(例如，从1L到4L)稀释上清液(来自步骤2)。用2N的HCl调节pH到4.5。在10,000g离心10分钟。收集沉淀。 

4.再溶解来自步骤5的沉淀物到去离子水中并且用2N的NaOH调节pH到7.5。 

5.在入口温度＝200℃，出口温度＝90-95℃下，喷雾干燥中和的蛋白质混合物. 

在一个研究中，样品的总蛋白质含量是OBAP(-)(94.8％)、OBAP(+)(91.8％)以及对照(68％)(Official Methods of Analysis of the AOAC，第16版，1995，990.02，Locator #4.2.08)。确定来自各个级分的HMF的产量。结果证明没有从OBAP(-)样品产生HMF(参见表5)。该研究表明OBAP的重要性和/或磷脂的重要性，异黄酮和皂角苷与获得HMF中的该级分相关，尽管油体缔合蛋白质不构成HMF的大部分。 

在相同的研究中，OBAP(-)、OBAP(+)和对照的大豆蛋白质分 离物的胰蛋白酶抑制剂活性分别是24、31.5和47.5TIU/mg(利用标准的AACC方法，1995，第9版，方法71-10)。这些活性不与样品的HMF的产率有关；因此，消除了OBAP(-)分离物中缺乏胰蛋白酶抑制剂活性引起HMF形成的缺乏的可能性。 

大豆蛋白质样品的胰凝乳蛋白酶抑制剂的活性不与样品的HMF的产生有关(表5)(AACC，第10版，方法22-40)。 

表5.每毫克样品的胰凝乳蛋白酶抑制单位和HMF的产量。 

   CTIU/mg   HMF产量M   大豆球蛋白   2.0   5   β-伴大豆球蛋白   2.3   14   OBAP(-)   5.2   0   BC-无效的   8.8   8   中间产物   9.2   24   OBAP(+)   24.5   8   大豆球蛋白-无效的   39.2   19

其他的大豆级分(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、中间产物)也是在爱荷华州立大学的中试工厂制备获得的(15公斤实验植物方法#2；Wu等人，1999)。这些样品中的油质蛋白的数值也通过Western印迹利用油质蛋白抗体(参见图12)确定。此外，证实具有更高量油质蛋白的样品产生更高产量的HMF(表6)。 

胃蛋白酶消化的SPI的样品(OBAP和对照)、未消化的SPI样品(对照、OBAP(-)、OBAP(+))、油体蛋白质制剂和对照大豆IA-2032的磨碎的大豆样品在18％Tris/甘氨酸凝胶上分辨，并且转到PVDF膜上。用油质蛋白的抗血清探测这些印迹(图13)。该抗血清是在兔中利用如QIAexpressionist(QIAGEN公司，Valencia，CA)所描述的在大肠杆菌中过表达并纯化的全长油质蛋白而开发的。这些印迹说明具有更高量油质蛋白的样品产生更高产量的HMF(表6)。 

实施例5 

用乙醇提取对HMF产量的影响 

为了观察来自磷脂、皂角苷和异黄酮的中间馏分达到的高产率的程度，利用70％的乙醇从该馏分提取这些成分并且重复测试该级分的HMF产量。结果是50％的低产量。将提取的级分加入低产率级分(大豆球蛋白)有助于改善那些级分的HMF产量(80％)。这些结果(参见表6)表明HMF多肽抗蛋白酶消化的能力可能部分地依赖于醇可提取成分，例如皂角苷、异黄酮和磷脂的存在。由上述实施例产生的结果也包括与表6一起的概要说明在内.由此概要得出的结论是油质蛋白、β-伴大豆球蛋白、醇可提取的物质(磷脂、皂角苷、异黄酮)和碱性的大豆球蛋白亚基促进HMF的高产量，其可能作为降低胆固醇的物质而起作用。最重要的成分是脂蛋白(油质蛋白和相关的磷脂)。可考虑到包含β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的大豆蛋白质成分的降低胆固醇特性可通过加入植物的脂蛋白(例如，油质蛋白相关的磷脂)或其他来源的脂蛋白(例如，蛋黄脂蛋白)而增强。 

表6：源材料和HMF产量的比较 

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在此公开和所要求保护的所有组合物和方法可按照所公开的内容不用过度的实验而被产生并且实行。同时本发明的组合物和方法已经按照优选的实施方案描述，对于本领域的技术人员来说显而易见的是，可将变化应用于在此所描述的组合物和方法，以及方法的步骤或步骤的顺序而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，显然某些化学上和生理学上都相关的因素可能被在此所描述的因素代替而同时获得相同或相似的结果。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，所有这类相似的置换和改变被认为是在如权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内的。 

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下列参考文献，在一定程度上提供了对在此所阐明的内容作补充的例证性方法或其他细节，其在此具体引入作为参考： 

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