极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法

摘要

本发明公开了一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，步骤包括初始质粒、含有要敲除靶基因上下游同源片段的自杀质粒和含酵母核酸内切酶I-SceI基因的诱导质粒的构建，自杀质粒和诱导质粒向嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的接合转移，发生第一次同源重组单交换子和第二次同源重组双交换突变株的筛选和鉴定。本发明首次实现了嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除，能快速、稳定、高效地敲除该菌的基因，不仅可用于该菌基因的功能和代谢机制研究，进行遗传性状改造，构建高效浸矿工程菌；而且获得的突变株不携带任何抗性基因，既可以作为出发菌株进行后续不同位点的基因敲除和改造，还可以安全用于大规模工业生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于同源重组原理的基因敲除方法，尤其涉及一种基于同源重组原理的 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法。

背景技术

极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，简称A.ferrooxidans)是一类 典型的专性化能自养细菌，能够从亚铁离子(Fe²⁺)及还原性硫化合物(RISCs)的氧化过程 中获得能量进行生长，是目前硫化矿生物冶金应用中的优势高效浸矿菌种，同时也是研究浸 矿微生物铁、硫氧化代谢机制的模式菌。但是，A.ferrooxidans专性自养，生长十分缓慢，细 胞得率低，遗传操作非常困难，极大地限制了A.ferrooxidans的基础研究和工业应用，因此 有必要对其进行遗传改造。

发明人的实验室在国际上率先建立了大肠杆菌--极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的接合转移 系统(J B Peng，W M Yan，and X Z Bao.，J Bacteriol.1994 May；176(10)：2892～2897.)，并实现 了A.ferrooxidans中以质粒形式携带外源基因进行表达(Ji-Bin Peng，Wang-Ming Yan，and  Xue-Zhen Bao.，Appl Environ Microbiol.1994 July；60(7)：2653～2656.)。基于这一策略，成功地 实现了对A.ferrooxidans的遗传改造，提高了其外源有机质利用能力和重金属抗性。但是由 于在A.ferrooxidans生长的pH＜2.0的极端酸性条件下，能稳定有效地发挥作用的抗生素种类 非常少(目前仅卡那霉素和链霉素)，在A.ferrooxidans中能够进行自主复制的广泛宿主范围 特性质粒分子量大，拷贝数少，质粒的稳定性也有限，不能同时改造多个性状，而且质粒携 带的抗性基因的使用不利于生物安全，也无法实现工业应用。因此，有必要建立更稳定的染 色体水平的遗传操作——基因敲除。

基因敲除技术是研究基因功能、改造遗传性状的重要手段，目前已经在各种模式生物中 得到广泛的应用。但是由于遗传操作非常困难，在嗜酸性硫杆菌属中仅有两例报道，其中— 例是极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Zhenying Liu，Nicolas Guiliani，Corinne Appia-Ayme， Borne，Jeanine Ratouchniak，and Violaine Bonnefoy，J Bacteriol.2000 April；182(8)： 2269～2276.)，另一例是该属中的极端嗜酸性喜温硫杆菌(Leonardo J.van Zyl，Jolanda M.van  Munster，and Douglas E.Rawlings，Appl Environ Microbiol.2008 September；74(18)： 5686～5694.)。这两例基因敲除方法不仅效率低，而且都是通过同源重组标记替换，在靶基因 内部插入抗性基因的方式实现的。这种方式虽然可以使靶基因丧失功能，但是由于每敲除一 个基因会使一种抗性基因保留在染色体上，因此带来了诸多不便之处，如抗生素的使用以及 多位点敲除的限制等。

发明内容

针对以上A.ferrooxidans中质粒载体的不稳定性，较少种类抗生素的可使用性，已有敲 除方法中抗生素抗性基因的残留，不便进行多基因敲除研究的问题，本发明提供了一种基于 同源重组原理的A.ferrooxidans无标记基因敲除方法。

本发明实现A.ferrooxidans的高效无标记基因敲除所采用的技术方案是：构建含有卡那 霉素抗性基因、酵母内切核酸酶I-SceI特异识别作用位点、能够进行接合转移的初始质粒， 将要敲除的靶基因上、下游同源片段分别按一定方向克隆至初始质粒上，获得能够进行基因 敲除的自杀质粒，将自杀质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A.ferrooxidans中，在选择 平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的A.ferrooxidans单交换子， 然后构建含有链霉素抗性基因、酵母内切核酸酶I-SceI基因、具有接合转移功能的广泛宿主 范围特性质粒作为诱导质粒，将诱导质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A.ferrooxidans 单交换子中，实现I-SceI基因在A.ferrooxidans单交换子中表达，表达产物I-SceI内切酶 能够切断染色体上的I-SceI位点，诱导第二次同源重组，在选择平板上获得发生第二次同源 重组且实现靶基因敲除的A.ferrooxidans突变菌株，最后在无选择压力的条件下转接3～5次 连续传代培养，获得质粒丢失的A.ferrooxidans靶基因敲除突变株。

上述初始质粒携带接合转移必需的oriT区，能够通过接合转移导入A.ferrooxidans中； 携带能在大肠杆菌中复制、而不能在A.ferrooxidans中复制的复制原点；携带酵母内切核酸 酶I-SceI特异识别并作用的位点；携带多克隆位点MCS；携带在酸性条件下对A.ferrooxidans 稳定有效的卡那霉素的抗性基因。

上述自杀质粒是通过将A.ferrooxidans染色体上要敲除的靶基因上游和下游、长度为 0.5～2.0kb的同源序列片段分别按一定方向克隆至初始质粒的多克隆位点获得。

上述自杀质粒转化到具有接合转移能力的大肠杆菌中作为供体菌，A.ferrooxidans作为 受体菌，收集对数期的供体菌细胞和稳定期的受体菌细胞，以1∶2的比例混匀，涂布到放置 于2∶2接合培养基表面的滤膜上，28～32℃培养5～9天，使供、受体菌充分接触以实现质粒的 接合转移过程。

上述筛选和鉴定A.ferrooxidans单交换子的方法是收集接合滤膜上的菌体，用2∶2无机 盐溶液悬浮菌体并涂布于含80～110ug/mL卡那霉素的2∶2固体培养基平板，28～32℃培养12～16 天平板上长出单菌落，即为A.ferrooxidans单交换子；挑取A.ferrooxidans单交换子到10mL 9K亚铁培养基中复苏，28～32℃培养5～7天后转接到30mL含250～300μg/mL卡那霉素的9K 硫粉培养基，28～32℃培养5～7天后离心收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩 增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。

上述诱导质粒携带具有广泛宿主范围特性的复制原点，能够在大肠杆菌和A.ferrooxidans 中都能自主稳定复制；携带接合转移必需的oriT区，能够通过接合转移导入A.ferrooxidans 中；携带在酸性条件下对A.ferrooxidans稳定有效的链霉素的抗性基因；携带酵母内切核酸 酶I-SceI基因，能在A.ferrooxidans中表达出有活性的I-SceI内切核酸酶。

上述获得A.ferrooxidans靶基因敲除突变株的方法是将表达酵母内切核酸酶I-SceI的广 泛宿主范围特性的诱导质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌中作为供体菌，A.ferrooxidans 单交换子作为受体菌，收集对数期的供体菌和稳定期的受体菌细胞，以1∶2的比例混匀，涂 布到放置于2∶2接合培养基表面的滤膜上，28～32℃培养2～4天，收集接合滤膜上的菌体，用 2∶2无机盐溶液悬浮菌体，并涂布于含80～110μg/mL链霉素的2∶2固体培养基平板，28～32℃ 培养12～16天后平板上长出单菌落；挑取单菌落到10mL 9K亚铁培养基中复苏，28～32℃培 养5～7天后转接到30mL含250～300μg/mL链霉素的9K硫粉培养基，28～32℃培养5～7天后 离心收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证和 Southern杂交验证；对获得的双交换靶基因敲除突变子通过不加链霉素的9K硫粉培养基和 2∶2固体平板培养基单菌落转接3～5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因敲除突变株。

上述2∶2无机盐溶液配方为：(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L，KCl 0.15g/L，MgSO₄·7H₂O 0.75g/L，pH 4.6。

上述2∶2固体平板培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L，KCl 0.15g/L，MgSO₄·7H₂O 0.75g/L， Na₂S₂O₃·5H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 2g/L，琼脂粉6g/L，pH 4.6。

上述2∶2固体接合培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L，KCl 0.15g/L，MgSO₄·7H₂O 0.75g/L， Na₂S₂O₃·5H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.075g/L，琼脂粉6g/L，酵母提取物5g/L，pH 4.6。

上述9K亚铁培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L，KCl 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，Ca(NO₃)₂ 0.01g/L，FeSO₄·7H₂O 18g/L，pH 2.5。

上述9K硫粉培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L，KCl 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，Ca(N_O3₎2 0.01g/L，升华硫5g/L，pH 3.0。

上述基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法中：

所述初始质粒优选插入酵母内切核酸酶I-SceI特异识别并作用位点的大肠杆菌质粒 pSW29T。

所述自杀质粒的构建优选把要敲除靶基因上游和下游长度为0.9～1.1kb的同源序列片段 分别按一定方向克隆至初始质粒的多克隆位点。

所述自杀质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌优选大肠杆菌SM10或S17-1λ pir。

所述含自杀质粒的供体菌与受体菌接合培养条件优选30℃，7天，筛选A.ferrooxidans 单交换子优选含100ug/mL卡那霉素的2∶2固体培养基平板，30℃培养14天，A.ferrooxidans 单交换子的复苏条件优选含300μg/mL卡那霉素的9K硫粉培养基，30℃培养6天。

所述诱导质粒优选插入I-SceI基因的广泛宿主范围特性质粒pMSD1。

所述诱导质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌优选大肠杆菌SM10或S17-1λ pir。

所述含诱导质粒的供体菌与受体菌A.ferrooxidans单交换子的接合培养条件优选30℃，3 天，筛选A.ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子优选含100μg/mL链霉素的2∶2固体培养基 平板，30℃培养14天，A.ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子的复苏条件优选含300μg/mL 链霉素的9K硫粉培养基，30℃培养6天，对鉴定的A.ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子 优选通过不加链霉素的9K硫粉培养基和不含链霉素的2∶2固体培养基转接4次连续传代培 养，获得质粒丢失的A.ferrooxidans靶基因敲除突变株。

本发明针对A.ferrooxidans中质粒载体的不稳定性，较少种类抗生素的可使用性，已有 敲除方法中抗生素抗性基因的残留，不便进行多基因敲除研究的问题，提出了一种基于同源 重组原理的无标记基因敲除方法。本发明在国际上率先把无标记基因敲除技术应用于A. ferrooxidans，可以实现A.ferrooxidans中任何一个基因和多基因的敲除，且不残留任何抗生 素抗性基因。使用本方法第一次单交换发生频率为10^-7，第二次双交换发生频率为1.5～2.0％。

本发明能快速、稳定、高效地敲除A.ferrooxidans的基因，不仅可用于研究A.ferrooxidans 基因的功能和代谢机制，实现A.ferrooxidans的遗传性状改造，构建高效浸矿基因工程菌； 而且所得的突变株不携带任何抗生素抗性基因，既可以作为出发菌株进行后续不同位点的基 因敲除和改造，还可以安全地用于大规模工业生产。

附图说明

图1为用于基因敲除的初始质粒pKIT的结构示意图。

图2为A.ferrooxidans AFE_1807(pfkB)基因敲除的构建流程示意图。

图3为A.ferrooxidans AFE_1807基因敲除的PCR验证图。

图中：M，DNA Marker，从上到下大小依次为8,000bp、5,000bp、3,000bp、2,000bp、 1,000bp、750bp、500bp、250bp。两个Marker之间从左到右模板依次为质粒pKOT、A. ferrooxidans ATCC 23270基因组DNA、A.ferrooxidans ATCC 23270第一种单交换子基因组 DNA、A.ferrooxidans ATCC 23270第二种单交换子基因组DNA、A.ferrooxidans ATCC 23270 敲除突变子基因组DNA。其中1～5，引物是AF1F和AF1R；6～10，引物是AF2F和AF2R； 11～15，引物是K59和K629；16～20，引物是DOF和DOR。

图4为诱导质粒pMSD1-I-SceI的结构示意图。

图5为A.ferrooxidans AFE_1807基因敲除的杂交验证图。

图中MT-ApaI，A.ferrooxidans ATCC 23270敲除突变子基因组DNA/ApaI；WT-ApaI， A.ferrooxidans ATCC 23270基因组DNA/ApaI。

图6为A.ferrooxidans AFE_0029(tetH)基因敲除的构建流程示意图。

图7为A.ferrooxidans AFE_0269(sdo)基因敲除的构建流程示意图。

具体实施方式

一般性说明：

本发明所用极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌标准菌株A.ferrooxidans ATCC 23270购自ATCC (美国典型微生物菌种保藏中心)。所述质粒pSW29T的来源见Gaelle Demarre，Anne-Marie  Guerout，Chiho Matsumoto-Mashimo，Dean A.Rowe-Magnus，Philippe Marliere，Didier Mazel：A  new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid(IncW)and  RP4 plasmid(IncPα)conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology，2005，156：245～255。所述质粒pUC19RP12的来源见Gyorgy Posfai， Vitaliy Kolisnychenko，Zsuzsa Bereczki，Frederick R.Blattner：Markerless gene replacement in

Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome.Nucleic Acids Research， 1999，27：4409～4415。所述质粒pUC19购自上海生工生物工程技术有限公司。所述质粒pMSD1 购自济南鑫兴生物科技有限公司。所述大肠杆菌菌株DH5α购自TaKaRa公司。所述大肠杆菌 菌株S17-1λ pir和SM10购自济南鑫兴生物科技有限公司。细菌基因组提取试剂盒、质粒提 取试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自Omega Bio-tek公司。PCR反应使用的试剂以及TaKaRa Taq 和PrimeSTAR HS DNA Polymerase购自TaKaRa公司。酶切连接所用的各种限制性内切酶和 T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。Southern blot使用的Amersham Hybond^TM-N⁺尼龙膜购自 GE Healthcare公司，引物标记和检测杂交试剂盒(DIG High prime DNA Labeling and Detection  Starter Kit I)购自Roche公司。

实施例1：极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌磷酸果糖激酶基因(pfkB，AFE_1807基因)的无 标记敲除

(1)构建用于敲除A.ferrooxidans ATCC 23270AFE_1807基因的自杀质粒

1.构建用于A.ferrooxidans基因敲除的初始质粒

根据GenBank：AY733073.1公布的质粒pSW29T的序列信息设计引物：

29TKpnI：

5′-CGGCGGTACCTAGGGATAACAGGGTAATAGCGCTTTTCCGCTGCATAACCC-3′

29TSalI：

5′-CTAAGTCGACTGATCAACGCGTCTCGAGGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG-3′

29TKpnI和29TSalI引物以质粒pSW29T为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获 得带有oriT区的片段。其中在上游引物的Kpn I位点内侧加上18bp的I-SceI识别和作用位 点序列，在下游引物的Sal I位点内侧加上Bcl I、Mlu I和Xho I识别位点序列。PCR反应体 系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液       5μL；

25mmol/LMgCl2    4μL；

10mmol/L四种dNTP混合液  1μL；

上下游引物各    1μL；

TransEco FastPfu  0.5μL；

模板DNA 1μl，加水补至50μL；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30 个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，再用Kpn I和Sal I 双酶切后连入同样进行双酶切的pSW29T，获得初始质粒pKIT(图1)。

2.构建用于敲除A.ferrooxidans ATCC 23270 AFE_1807基因的自杀质粒

根据GenBank：CP001212.1公布A.ferrooxidans标准株ATCC 23270基因组序列中的 AFE_1807基因及其上下游基因序列设计引物：

HR1F：

5′-GACGGAATTCCCGCGGCCTGACGCTGGAAG-3′

HR1R：

5′-GCCGTCTAGACGGTCATGACCGCGCCTCC-3′

HR2F：

5′-GCCGTCTAGAGGGTACCCCAAAAAAGGCCC-3′

HR2R：

5′-GACGGAGCTCCCATCAGTATAGAACAGTCGGGG-3′

HR1F和HR1R引物，HR2F和HR2R引物，分别以提取的A.ferrooxidans ATCC 23270 基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有AFE_1807基因上游1000 bp同源臂HR1(1572178→1571179)和下游1004bp同源臂HR2(1570227→1569224)的片 段。其中根据pKIT质粒MCS中的酶切位点，分别在上游同源臂HR1的两端添加了EcoR I 和Xba I酶切位点序列，在下游同源臂HR2的两端添加了Xba I和Sac I酶切位点序列。PCR 反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液     5μL；

25mmol/LMgCl2  4μL；

10mmol/L四种dNTP混合液  1μL；

上下游引物各  1μL；

TransEco FastPfu  0.5μL；

模板DNA 1μl，加水补至50μL；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，55℃退火30s，72℃延伸70s，30 个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，上游同源臂HR1 片段用EcoR I和Xba I双酶切，下游同源臂HR2片段用Xba I和Sac I双酶切，分别连入pKIT 质粒MCS中相应酶切位点之间，获得自杀质粒pKOT(图2)。

(2)获得发生第一次同源重组的A.ferrooxidans单交换子

1.A.ferrooxidans ATCC 23270 AFE_1807基因敲除的构建流程示意图见图2。

2.将质粒pKOT转化E.coli S17-1λ pir，作为接合转移供体菌，A.ferrooxidans ATCC 23270 作为受体菌。将E.coli S17-1λ pir(pKOT)在含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 37℃，150r/min振荡培养过夜，2％转接到含100μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中， 37℃，120r/min缓慢振荡培养3～4小时至对数期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；将 A.ferrooxidans ATCC 23270培养在9K硫粉培养基中，30℃，150r/min振荡培养5～7天至稳 定期，1％～2％转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30℃，150r/min振荡培养5～7天至稳定期， 收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1∶2的比例混合、稀释，取100μL 混合菌液，约10⁸个细胞，涂布到放置于2∶2接合培养基表面的0.45μm孔径滤膜上，30℃培 养箱中培养7天。

3.将接合滤膜取出，用2∶2无机盐溶液1～2mL悬浮附着的菌体，涂布于含100μg/mL 卡那霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，平板上长出单菌落即为A. ferrooxidans单交换子。挑取A.ferrooxidans单交换子到10mL 9K亚铁培养基中复苏，30℃培 养6天后转接到30mL含300μg/mL卡那霉素的9K硫粉培养基，30℃，150r/min振荡培养6 天至稳定期。提取A.ferrooxidans单交换子的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖 凝胶电泳检测验证。

分别利用

K59：5′-ATACCGTAAAGCACGAGG-3′

K629：5′-CCCTGAATGAACTCCAAG-3′

检测插入染色体上的来源于质粒pKOT的Km基因(图3)；

利用

AF1F：5′-TTGCCAAAGGGTTCGTGT-3′

AF1R：5′-GGGTTGAGGGTGAGGGTAG-3′

检测发生第一种单交换的形式(图2和3)；

利用

AF2F：5′-TAACGGAAGCGCGTGTACTC-3′

AF2R：5′-TGACATGGGAATTGCGCGC-3′

检测发生第二种单交换的形式(图2和3)。

获得的A.ferrooxidans单交换子包含两种单交换情况(见图2)，二者数量比约为1∶1。单 交换子发生频率约为10^-7。

(3)获得发生第二次同源重组的A.ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变株

1.用Xba I和Pst I双酶切将质粒pUC19RP12上携带的I-SceI基因片段连接到广泛宿主 范围特性质粒pMSD1的相应酶切位点，获得诱导质粒pMSD1-I-SceI(图4)。

2.将质粒pMSD1-I-SceI转化大肠杆菌E.coli SM10，以E.coli SM10(pMSD1-I-SceI) 作为接合转移供体菌，A.ferrooxidans单交换子作为受体菌。将E.coli SM10(pMSD1-I-SceI) 在含100μg/mL链霉素的LB液体培养基中37℃，150r/min振荡培养过夜，2％转接到含100 μg/mL链霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，120r/min缓慢振荡培养3～4小时至对数期， 收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；将A.ferrooxidans单交换子培养在9K硫粉培养基中， 30℃，150r/min振荡培养5～7天至稳定期，1％～2％转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30℃， 150r/min振荡培养5～7天至稳定期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体 菌以1∶2的比例混合、稀释，取100μL混合菌液，约10⁸个细胞，涂布到放置于2∶2接合培养 基表面的0.45μm孔径滤膜上，30℃培养箱中培养3天。

3.将接合滤膜取出，用2∶2无机盐溶液1～2mL悬浮附着的菌体，涂布于含100μg/mL 链霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，平板上长出单菌落。挑取单菌落 到10mL 9K亚铁培养基中复苏，30℃培养6天后转接到30mL含300μg/mL链霉素的9K硫 粉培养基，30℃，150r/min振荡培养6天至稳定期。收集菌体，提取基因组DNA，设计引 物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测用以筛选和鉴定发生双交换的A.ferrooxidans  AFE_1807基因敲除突变株。

利用

DOF：5′-GGTGCTCACTTACAACTTCCG-3′

DOR：5′-GGCCATCTGTTACTCCTCGTC-3′

检测发生第二次双交换的A.ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变株(图3)。

在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复成野生型，另一种是AFE_1807基因 敲除突变株(原理见图2)。

4.取PCR验证的发生双交换的A.ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变子100μL菌液， 涂布于不含链霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，挑取平板上长出的单 菌落到10mL不含链霉素的9K硫粉培养基，30℃培养6天，取100μL菌液再次涂布不含链 霉素的2∶2固体培养基平板，如此转接4次连续传代培养，最后转接30mL不含链霉素的9K 硫粉培养基，30℃培养6天，收集菌体，提取基因组DNA，设计引物PCR扩增质粒上的序 列片段并琼脂糖凝胶电泳检测，进行质粒丢失的验证，最终获得不含质粒的A.ferrooxidans  AFE_1807基因敲除突变株。

利用

SMF：5′-TGTCAGAGGCGGAGAATC-3′

SMR：5′-CAAGTCAGAGGGTCCAATC-3′

扩增质粒上的链霉素抗性基因片段，检测质粒的丢失。

5.利用Southern blot验证A.ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变株的结果如图5。

利用

probe-F：5′-CGCGGAATTCGATTCATATGCAGATGATC-3′

probe-R：5′-CAGCAAGCTTGAAGTTGTAAGTGAGCAC-3′

扩增上游同源臂HR1内部364bp的片段，PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液     5μL；

25mmol/LMgCl2  4μL；

10mmol/L四种dNTP混合液  1μL；

上下游引物各  1μL；

TransEco FastPfu  0.5μL；

模板DNA 1μl，加水补至50μL；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30 个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，用EcoR I和Hind III 双酶切，连接至质粒pUC19获得重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，在含有100ug/mL氨苄青 霉素的LB培养基上获得重组子，提取重组质粒用作探针。分别提取A.ferrooxidans野生型和 AFE_1807基因敲除突变株的基因组DNA，用Apa I酶切后经琼脂糖凝胶进行检测，然后转 膜进行Southern杂交，操作步骤按Roche公司的Southern blot试剂盒的说明进行。杂交结果 见图5。

实施例2：极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌连四硫酸盐水解酶基因(tetH，AFE_0029基因) 的无标记敲除

(1)构建用于敲除A.ferrooxidans ATCC 23270 AFE_0029基因的自杀质粒

1.构建用于A.ferrooxidans基因敲除的初始质粒(同实施例1，略)

2.构建用于敲除AFE_0029基因的自杀质粒

根据GenBank：CP001212.1公布A.ferrooxidans标准株ATCC 23270基因组序列中的 AFE_0029基因及其上下游基因序列设计引物：

HA1F：

5′-GCTGAATTCCTCGTCCATCATTTTTTGCGG-3′

HA1R：

5′-TACAAGCTTCTCTAGACAGATGGTGCGTTTTCC-3′

HA2F：

5′-CGCGAATTCTCTAGACCGTCTACCTGACCAACTC-3′

HA2R：

5′-GCTAAGCTTGAGCTCCGTCACGTCACTGCGAAAT-3′

HA1F和HA1R引物，HA2F和HA2R引物，分别以提取的A.ferrooxidans ATCC 23270 基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有AFE_0029基因上游1002 bp同源臂HA1(30709→31710)和下游1009bp同源臂HA2(32974→33982)的片段。其中 根据pKIT质粒MCS中的酶切位点，分别在上游同源臂HA1的两端添加了EcoR I和Xba I 酶切位点序列，在下游同源臂HA2的两端添加了Xba I和Sac I酶切位点序列。PCR反应体 系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液     5μL；

25mmol/LMgCl2  4μL；

10mmol/L四种dNTP混合液  1μL；

上下游引物各  1μL；

TransEco FastPfu  0.5μL；

模板DNA 1μl，加水补至50μL；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，55℃退火30s，72℃延伸70s，30 个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，上游同源臂HA1 片段用EcoR I和Xba I双酶切，下游同源臂HA2片段用Xba I和Sac I双酶切，分别连入pKIT 质粒MCS中相应酶切位点之间，获得自杀质粒pKIT-KtetH(图6)。

(2)获得发生第一次同源重组的A.ferrooxidans单交换子

1.A.ferrooxidansATCC 23270 AFE_0029基因敲除的构建流程示意图见图6。

2.将质粒pKIT-KtetH转化E.coli S17-1λ pir，作为接合转移供体菌，A.ferrooxidans ATCC 23270作为受体菌。将E.coli S17-1λ pir(pKIT-KtetH)在含100μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基中，37℃，150r/min振荡培养过夜，2％转接到含100μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体 培养基中，37℃，120r/min缓慢振荡培养3～4小时至对数期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗 涤两次；将A.ferrooxidans ATCC 23270培养在9K硫粉培养基中，30℃，150r/min振荡培 养5～7天至稳定期，1％～2％转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30℃，150r/min振荡培养5～7 天至稳定期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1∶2的比例混合、稀 释，取100μL混合菌液，约10⁸个细胞，涂布到放置于2∶2接合培养基表面的0.45μm孔径 滤膜上，30℃培养箱中培养7天。

3.将接合滤膜取出，用2∶2无机盐溶液1～2mL悬浮附着的菌体，涂布于含100μg/mL 卡那霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，平板上长出单菌落即为单交换 子。挑取单交换子到10mL 9K亚铁培养基中复苏，30℃培养6天后转接到30mL含300μg/mL 卡那霉素的9K硫粉培养基，30℃，150r/min振荡培养6天至稳定期。提取A.ferrooxidans 单交换子的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。

分别利用

K59：5′-ATACCGTAAAGCACGAGG-3′

K629：5′-CCCTGAATGAACTCCAAG-3′

检测插入染色体上的来源于质粒pKIT-KtetH的Km基因(图6)；

利用

D1F：5′-TGCCAAAGGGTTCGTGTA-3′

D1R：5′-GGATACCGTTCGATAG-3′

检测发生第一种单交换的形式(图6)；

利用

D2F：5′-AGTTCGGGATCGAAAGC-3′

D2R：5′-GGATGTAACGCACTGAG-3′

检测发生第二种单交换的形式(图6)。

获得的A.ferrooxidans单交换子包含两种单交换情况，二者数量比约为1∶1。单交换子发 生频率约为10^-7。

(3)获得发生第二次同源重组的A.ferrooxidans AFE_0029基因敲除突变株

1.诱导质粒pMSD1-I-SceI的构建与实施例1相同(略)。

2.将质粒pMSD1-I-SceI转化大肠杆菌E.coli SM10，以E.coli SM10(pMSD1-I-SceI) 作为接合转移供体菌，A.ferrooxidans单交换子作为受体菌。将E.coli SM10(pMSD1-I-SceI) 在含100μg/mL链霉素的LB液体培养基中37℃，150r/min振荡培养过夜，2％转接到含100 μg/mL链霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，120r/min缓慢振荡培养3～4小时至对数期， 收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；将A.ferrooxidans单交换子培养在9K硫粉培养基中， 30℃，150r/min振荡培养5～7天至稳定期，1％～2％转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30℃， 150r/min振荡培养5～7天至稳定期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体 菌以1∶2的比例混合、稀释，取100μL混合菌液，约10⁸个细胞，涂布到放置于2∶2接合培养 基表面的0.45μm孔径滤膜上，30℃培养箱中培养3天。

3.将接合滤膜取出，用2∶2无机盐溶液1～2mL悬浮附着的菌体，涂布于含100μg/mL 链霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，平板上长出单菌落。挑取单菌落 到10mL 9K亚铁培养基中复苏，30℃培养6天后转接到30mL含300μg/mL链霉素的9K硫 粉培养基，30℃，150r/min振荡培养6天至稳定期。收集菌体，提取基因组DNA，设计引 物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测用于筛选和鉴定发生双交换的A.ferrooxidans  AFE_0029基因敲除突变株。

利用

SOF：5′-TCCGCCGCTGTTGCTGTT-3′

SOR：5′-TGGGGTTCGCATGCTGAT-3′

检测发生第二次双交换的A.ferrooxidans AFE_0029基因敲除突变株。

在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复成野生型，另一种是AFE_0029基因 敲除突变株(原理见图6)。

4.取PCR验证的发生双交换的A.ferrooxidans AFE_0029基因敲除突变子100μL菌液， 涂布于不含链霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，挑取平板上长出的单 菌落到10mL不含链霉素的9K硫粉培养基，30℃培养6天，取100μL菌液再次涂布不含链 霉素的2∶2固体培养基平板，如此转接4次连续传代培养，最后转接30mL不含链霉素的9K 硫粉培养基，30℃培养6天，收集菌体，提取基因组DNA，设计引物PCR扩增质粒上的序 列片段并琼脂糖凝胶电泳检测，进行质粒丢失的验证，最终获得不含质粒的A.ferrooxidans  AFE_0029基因敲除突变株。

利用

SMF：5′-TGTCAGAGGCGGAGAATC-3′

SMR：5′-CAAGTCAGAGGGTCCAATC-3′

扩增质粒上的链霉素抗性基因片段，检测质粒的丢失。

实施例3：极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌金属β-内酰胺酶基因(AFE 0269基因，简称 sdo)的无标记敲除

(1)构建用于敲除A.ferrooxidans ATCC 23270 AFE_0269基因的自杀质粒

1.构建用于A.ferrooxidans基因敲除的初始质粒(同实施例1，略)

2.构建用于敲除AFE_0269基因的自杀质粒

根据GenBank：CP001212.1公布A.ferrooxidans标准株ATCC 23270基因组序列中的 AFE_0269基因及其上下游基因序列设计引物：

HB1F：

5′-CACGAATTCCACGGACTGGGCGGATTAT-3′

HB1R：

5′-CACTCTAGAATCACCCCTTGTCGGCAATG-3′

HB2F：

5′-CCGTCTAGAGAGGAGTACTTAAGATGAGCAAACA-3′

HB2R：

5′-GATGAGCTCTGGTCGGTGATGACGGTACGG-3′

HB1F和HB1R引物，HB2F和HB2R引物，分别以提取的A.ferrooxidans ATCC 23270 基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有AFE_0269基因上游1022 bp同源臂HB1(244891→243870)和下游1028bp同源臂HB2(243178→242151)的片段。 其中根据pKIT质粒MCS中的酶切位点，分别在上游同源臂HB1的两端添加了EcoR I和Xba I酶切位点序列，在下游同源臂HB2的两端添加了Xba I和Sac I酶切位点序列。PCR反应体 系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液      5μL；

25mmol/LMgCl2    4μL：

10mmol/L四种dNTP混合液  1μL；

上下游引物各  1μL；

TransEco FastPfu 0.5μL；

模板DNA 1μl，加水补至50μL；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，55℃退火30s，72℃延伸70s，30 个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，上游同源臂HB1 片段用EcoR I和Xba I双酶切，下游同源臂HB2片段用Xba I和Sac I双酶切，分别连入pKIT 质粒MCS中相应酶切位点之间，获得自杀质粒pKIT-Ksdo(图7)。

(2)获得发生第一次同源重组的A.ferrooxidans单交换子

1.A.ferrooxidans ATCC 23270 AFE_0269基因敲除的构建流程示意图见图7。

2.将质粒pKIT-Ksdo转化E.coli S17-1λ pir，作为接合转移供体菌，A.ferrooxidans ATCC 23270作为受体菌。将E.coli S17-1λ pir(pKIT-Ksdo)在含100μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基中，37℃，150r/min振荡培养过夜，2％转接到含100μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体 培养基中，37℃，120r/min缓慢振荡培养3～4小时至对数期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗 涤两次；将A.ferrooxidans ATCC 23270培养在9K硫粉培养基中，30℃，150r/min振荡培 养5～7天至稳定期，1％～2％转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30℃，150r/min振荡培养5～7 天至稳定期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1∶2的比例混合、稀 释，取100μL混合菌液，约10⁸个细胞，涂布到放置于2∶2接合培养基表面的0.45μm孔径 滤膜上，30℃培养箱中培养7天。

3.将接合滤膜取出，用2∶2无机盐溶液1～2mL悬浮附着的菌体，涂布于含100μg/mL 卡那霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，平板上长出单菌落即为单交换 子。挑取单交换子到10mL 9K亚铁培养基中复苏，30℃培养6天后转接到30mL含300μg/mL 卡那霉素的9K硫粉培养基，30℃，150r/min振荡培养6天至稳定期。提取A.ferrooxidans 单交换子的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。

利用

K59：5′-ATACCGTAAAGCACGAGG-3′

K629：5′-CCCTGAATGAACTCCAAG-3′

检测插入染色体上的来源于质粒pKIT-Ksdo的Km基因(图7)

利用

SD1F：5′-GGATTTTGCCAAAGGGTTCG-3′

SD1R：5′-GGATGTAGGTGTAGGTGCTG-3′

检测发生第一种单交换的形式(图7)；

利用

SD2F：5′-GGCGGAACTCCACTTGTCAG-3′

SD2R：5′-GGGATGTAACGCACTGAGAA-3′

检测发生第二种单交换的形式(图7)。

获得的A.ferrooxidans单交换子包含两种单交换情况，二者数量比约为1∶1。单交换子发 生频率约为10^-7。

(3)获得发生第二次同源重组的A.ferrooxidans AFE_0269基因敲除突变株

1.诱导质粒pMSD1-I-SceI的构建与实施例1相同(略)。

2.将质粒pMSD1-I-SceI转化大肠杆菌E.coli SM10，以E.coli SM10(pMSD1-I-SceI) 作为接合转移供体菌，A.ferrooxidans单交换子作为受体菌。将E.coli SM10(pMSD1-I-SceI) 在含100μg/mL链霉素的LB液体培养基中37℃，150r/min振荡培养过夜，2％转接到含100 μg/mL链霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，120r/min缓慢振荡培养3～4小时至对数期， 收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；将A.ferrooxidans单交换子培养在9K硫粉培养基中， 30℃，150r/min振荡培养5～7天至稳定期，1％～2％转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30℃， 150r/min振荡培养5～7天至稳定期，收集菌体，用2∶2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体 菌以1∶2的比例混合、稀释，取100μL混合菌液，约10⁸个细胞，涂布到放置于2∶2接合培养 基表面的0.45μm孔径滤膜上，30℃培养箱中培养3天。

3.将接合滤膜取出，用2∶2无机盐溶液1～2mL悬浮附着的菌体，涂布于含100μg/mL 链霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，平板上长出单菌落。挑取单菌落 到10mL 9K亚铁培养基中复苏，30℃培养6天后转接到30mL含300μg/mL链霉素的9K硫 粉培养基，30℃，150r/min振荡培养6天至稳定期。收集菌体，提取基因组DNA，设计引 物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测用于筛选和鉴定发生双交换的A.ferrooxidans  AFE_0269基因敲除突变株。

利用

SDF：5′-ATCATCATTCAGTTTCCT-3′

SDR：5′-AGCGGTCTCGGATGTTTTC-3′

检测发生第二次双交换的A.ferrooxidans AFE_0269基因敲除突变株。

在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复成野生型，另一种是AFE_0269基因 敲除突变株(见图7)。

4.取PCR验证的发生双交换的A.ferrooxidans AFE_0269基因敲除突变子100μL菌液， 涂布于不含链霉素的2∶2固体培养基平板上，30℃培养箱中培养14天，挑取平板上长出的单 菌落到10mL不含链霉素的9K硫粉培养基，30℃培养6天，取100μL菌液再次涂布不含链 霉素的2∶2固体培养基平板，如此转接4次连续传代培养，最后转接30mL不含链霉素的9K 硫粉培养基，30℃培养6天，收集菌体，提取基因组DNA，设计引物PCR扩增质粒上的序 列片段并琼脂糖凝胶电泳检测，进行质粒丢失的验证，最终获得不含质粒的A.ferrooxidans  AFE_0269基因敲除突变株。

利用

SMF：5′-TGTCAGAGGCGGAGAATC-3′

SMR：5′-CAAGTCAGAGGGTCCAATC-3′

扩增质粒上的链霉素抗性基因片段，检测质粒的丢失。

以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件 的等同替换，均在本发明的保护范围之内。