石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙AB的分析方法及应用

摘要

本发明石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法及应用，其特征在于：采用高效液相色谱技术，通过优化HPLC分析条件一次性分离检出4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，建立一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的高效液相色谱分析方法。可用于包括石榴提取物、石榴汁或石榴饮料等多种石榴产品中4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的分析检测，用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。本发明的方法快速简便、灵敏度高、回收率高、通用性强、线性相关性和稳定性良好。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物分析检验及应用领域，特别涉及石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B分析方法的建立，以及该方法在石榴产品分析检测中的应用。

背景技术

石榴属于石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica），是一种营养价值很高的水果。石榴常用于鲜食，或加工成石榴汁饮料、石榴酒、石榴酱等，产品种类繁多。石榴不仅含有普通植物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质等成分外，还富含多种活性成分，如多酚、黄酮、花青素、生物碱等。多酚化合物因具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗衰老、保护心血管系统、保护消化系统、降血糖等生理活性功能，备受人们关注。随着人们健康意识的提高，天然产物中活性成分的分离提取、分析检测和功能性评价研究成为关注的热点。

石榴资源丰富，是很好的抗氧化活性多酚的生产原料。不同部位来源的多酚组成和含量不尽相同。石榴汁中多酚含量约为0.21%，主要包括没食子酸、鞣花酸和儿茶素。石榴皮中多酚含量约为10.4%~21.3%，主要包括安石榴甙、鞣花酸和没食子酸。石榴籽油中多酚含量很低，仅为0.015%。这些多酚化合物严重地影响着石榴的营养价值，同时石榴所具有的一些重要的保健医疗功效也主要归功于没食子酸、鞣花酸、安石榴甙等多酚化合物，如石榴果汁在体内的减少氧化应激、抗动脉粥样硬化和减少血小板凝聚功效，石榴皮提取物在体外的抗氧化、抑制微生物生长和抑菌功效。没食子酸是一种很强的抗氧化剂，具有抗真菌、抑制细菌、保护细胞免受氧化破坏等功效，被广泛应用于制药领域。安石榴甙是一种很有潜力的抗氧化剂，研究发现安石榴甙有两个可逆的A和B（α-和β-）异头物，可以预防对油脂、氨基酸和鸟嘌呤核苷的氧化破坏作用，但是β-异构体比α-异构体具有更强的抗氧化能力。鞣花酸是一个膳食多酚，具有很强的抗氧化、抗癌和抗动脉粥样硬化等功效。

目前，对于石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的研究，主要集中在分离提取和功能性评价方面，关于分析检测的研究在国内外比较少。文献检索发现目前几乎没有关于石榴产品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B分析方法的研究。考虑到这些多酚化合物的重要保健医疗功效，非常有必要建立一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的新型快速检测方法，并探讨其在石榴产品分析检测中的应用前景。本发明中所测定的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的结构式如图3－5所示。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术中的不足，第一方面提供一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的新型快速检测方法，第二方面提供了该方法在石榴产品分析检测中的应用。

本发明的第一方面提供的技术方案为石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法，其特征在于：采用高效液相色谱技术，通过优化HPLC分析条件一次性分离检出4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，建立一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的高效液相色谱分析方法。

石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法，具体按照下述步骤进行：（1）准确称取没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准品适量，依次用HPLC级水、NaOH溶液和甲醇溶解，混匀，配制成标准储备溶液，避光-18 ℃保存；临用时，用HPLC级水、NaOH溶液和甲醇稀释上述标准储备溶液，配置成不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液，避光-18 ℃保存；

（2）用HPLC级水、磷酸和乙腈来配制流动相A和B；

（3）开启高效液相色谱系统，设定高效液相色谱分析条件；

（4）由稀至浓依次将不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，确定没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的检测波长、保留时间、检出限、定量限、线性关系和相关系数、方法回收率和稳定性，建立4种多酚化合物的线性方程；

（5）将经过预处理的石榴样品溶液，用0.2 μm微孔滤膜过滤即得供试石榴样品溶液；

用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，根据4种多酚化合物的线性方程，计算即获得不同石榴样品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的含量。

其中所述的步骤中（1）中安石榴甙A&B中含有51.54%安石榴甙A和48.46%安石榴甙B； NaOH溶液的浓度为0.06 mol/L；标准储备溶液的浓度：没食子酸为299.40mg/L，鞣花酸为570.00 mg/L，安石榴甙A&B为1905.36 mg/L。

其中所述的步骤中（3）中高效液相色谱分析条件为：Kinetex C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）和KrudKatcher Ultra在线过滤预柱，进样量10 μL，流速1.8 mL/min，柱温30 ℃，PDA检测波长200~600 nm；流动相组合为：流动相A：0.1%（v/v）磷酸水溶液，流动相B：0.1%（v/v）磷酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：1%B等梯度洗脱0~1.5 min，1%~4.5%B递增线性洗脱1.5~3.0 min，4.5%B等梯度洗脱3.0~5.0 min，4.5%~7.0%B递增线性洗脱5.0~6.5 min，7.0%B等梯度洗脱6.5~8.5 min，7.0%~25.0%B递增线性洗脱8.5~13.73 min，25.0%~90.0%B递增线性洗脱13.73~14.39 min，90.0%~1.0%B递减线性洗脱14.40~16.39 min。采用Masslynx软件来控制整个HPLC系统和收集试验数据，用Masslynx软件的QuanLynx功能来处理试验数据。

本发明的第二方面提供的上述方法在石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B分析方法的应用：可用于包括石榴提取物、石榴汁或石榴饮料等多种石榴产品中4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的分析检测，用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。

本发明的优点：1、本发明的方法快速简便、灵敏度高、回收率高、通用性强、线性相关性和稳定性良好。2、本发明的方法可以定性和定量地检测出多种石榴产品中的4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，可以用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。

附图说明

其中图1为石榴提取物的HPLC色谱图，其中GA-没食子酸，PA-安石榴甙A，PB-安石榴甙B，EA-鞣花酸。

图2分别为石榴汁(A)、Honest Ade石榴饮料(B)、Langers 100%石榴饮料(C)、All Natural 100%石榴饮料(D)和POM Wonderful 100%石榴饮料(E)的HPLC色谱图。

图3没食子酸的结构式1，图4为鞣花酸的化学结构式，图5为安石榴甙A&B (c)的化学结构式。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。

高效液相色谱分析方法如下：

（1）准确称取没食子酸、鞣花酸（Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州，美国））和安石榴甙A&B（51.54%安石榴甙A和48.46%安石榴甙B）（ChromaDex公司（欧文，加利福尼亚州，美国））标准品适量，依次用HPLC级水、NaOH溶液（0.06 mol/L）和甲醇溶解，混匀，配制成299.40、570.00和1905.36 mg/L的标准储备溶液，避光-18 ℃保存。临用时，用HPLC级水、NaOH溶液（0.06 mol/L）和甲醇稀释上述标准储备溶液，配置成不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液，避光-18 ℃保存。

（2）用HPLC级水、磷酸和乙腈来配制流动相A和B。

（3）开启高效液相色谱系统（Waters公司（米尔德福，马萨诸塞州，美国）），设定高效液相色谱分析条件。系统条件为：Kinetex C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）和KrudKatcher Ultra在线过滤预柱（Phenomenex公司（托兰斯，加利福尼亚州，美国）），进样量10 μL，流速1.8 mL/min，柱温30 ℃，PDA检测波长200~600 nm；流动相组合为：流动相A：0.1%（v/v）磷酸水溶液，流动相B：0.1%（v/v）磷酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：1%B等梯度洗脱0~1.5 min，1%~4.5%B递增线性洗脱1.5~3.0 min，4.5%B等梯度洗脱3.0~5.0 min，4.5%~7.0%B递增线性洗脱5.0~6.5 min，7.0%B等梯度洗脱6.5~8.5 min，7.0%~25.0%B递增线性洗脱8.5~13.73 min，25.0%~90.0%B递增线性洗脱13.73~14.39 min，90.0%~1.0%B递减线性洗脱14.40~16.39 min。采用Masslynx软件（4.0版本）来控制整个HPLC系统和收集试验数据，用Masslynx软件的QuanLynx功能来处理试验数据。

（4）由稀至浓依次将不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，确定没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的检测波长、保留时间、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、线性关系和相关系数、方法回收率和稳定性，建立4种多酚化合物的线性方程，每个项目测定3个平行样取平均值，所得结果见表1和2。

（5）取预处理过的石榴样品溶液，用0.2 μm微孔滤膜过滤即得供试石榴样品溶液，用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，根据4种多酚化合物的线性方程，计算获得不同石榴样品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的含量。

表1  4种多酚化合物的保留时间、检测波长、检出限（LOD）和定量限（LOQ）

多酚化合物检测波长(nm)保留时间(min)LOD(mg/L)LOQ(mg/L)没食子酸2702.450.120.23安石榴甙A3787.611.533.07安石榴甙B37810.201.442.89鞣花酸25413.410.227.13

表2  4种多酚化合物的线性关系和相关系数、回收率和稳定性

多酚化合物浓度范围(mg/L)线性方程^a相关系数(R²)回收率(%)^bCV(%)^c没食子酸0.94~29.94Y=317.6X-40.750.997101.995.13~6.61安石榴甙A3.07~98.20Y=46.71X-40.740.99385.744.73~12.13安石榴甙B2.89~92.33Y=82.30X-30.830.99481.156.60~16.74鞣花酸7.13~114.00Y=938.34X-3546.900.97881.119.53~39.00

^a线性方程是通过以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算获得的。

^b回收率是采用加样回收法，精确称取已知含量样品3份，分别精密添加5.00、10.00和10.00 mg/L浓度水平的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准溶液，计算获得的。

^c变异系数（CV）是通过每天连续进样测定3次，连续重复3天，计算获得的。

实施例 1 

固体石榴皮的预处理条件为：取湿石榴皮（Stiebs Pomegranate Products公司（马德拉，加利福尼亚州，美国）），经40 ℃热风烘干，机械粉碎至0.2 mm。准确称取（2.0±0.05）g石榴皮粉末，加入100 mL去离子水，使用转速为1200 rpm的磁力搅拌器充分搅拌混匀，25 ℃下提取2 min。在整个提取过程中，为防止因光线而造成组织成分的氧化，提取容器始终用铝箔纸包裹。提取结束后在温度为4 ℃，转速为13,000 rpm，时间为5 min的离心条件下过滤，收集上清液，用蒸馏水稀释4倍即得预处理过的石榴提取物样品溶液。

实施例 2

固体鲜石榴的预处理条件为：取鲜石榴（Safeway超市（戴维斯，加利福尼亚州，美国）），手工剥去皮和籽，用研钵捣出石榴汁囊中的汁液，收集起来获得手工制的石榴汁，然后在温度为4 ℃，转速为13,000 rpm，时间为5 min的离心条件下过滤，收集上清液即得预处理过的石榴汁样品溶液。

实施例 3

液体石榴饮料的预处理条件为：取超市购买的Honest Ade石榴饮料（Safeway超市（戴维斯，加利福尼亚州，美国）），在温度为4 ℃，转速为13,000 rpm，时间为5 min的离心条件下过滤，收集上清液即得预处理过的石榴饮料样品溶液。

实施例 4

液体石榴饮料的预处理条件为：取超市购买的Langers 100%石榴饮料（Safeway超市（戴维斯，加利福尼亚州，美国）），在温度为4 ℃，转速为13,000 rpm，时间为5 min的离心条件下过滤，收集上清液，用蒸馏水稀释4倍即得预处理过的石榴饮料样品溶液。

实施例 5

液体石榴饮料的预处理条件为：取超市购买的All Natural 100%石榴饮料（Safeway超市（戴维斯，加利福尼亚州，美国）），在温度为4 ℃，转速为13,000 rpm，时间为5 min的离心条件下过滤，收集上清液，用蒸馏水稀释4倍即得预处理过的石榴饮料样品溶液。

实施例 6

液体石榴饮料的预处理条件为：取超市购买的POM Wonderful 100%石榴饮料（Safeway超市（戴维斯，加利福尼亚州，美国）），在温度为4 ℃，转速为13,000 rpm，时间为5 min的离心条件下过滤，收集上清液，用蒸馏水稀释4倍即得预处理过的石榴饮料样品溶液。

取上述预处理过的石榴样品溶液，用0.2 μm微孔滤膜过滤即得供试石榴样品溶液。依次将6种供试石榴样品溶液用上述高效液相色谱分析条件来检测，所得的HPLC色谱图见图1和2。

同时，记录峰面积，根据4种多酚化合物的线性方程，计算获得石榴提取物、石榴汁和石榴饮料中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的含量，所得结果见表3。

表3  6种石榴样品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A 和安石榴甙B含量^a

^a所有数值都是三次重复取均值±标准偏差。

^b石榴提取物样品数据对应的是实施例1，石榴汁样品数据对应的是实施例2，Honest Ade

石榴饮料样品数据对应的是实施例3，Langers 100%石榴饮料样品数据对应的是实施例4，All Natural 100%石榴饮料样品数据对应的是实施例5，POM Wonderful100%石榴饮料样品数据对应的是实施例6。

^c代表该数值低于LOQ但是高于LOD，意味着该数值是可以被预测的。

通过上述实施例可以看出，本发明的HPLC分析方法快速简便、灵敏度高、回收率高、通用性强、线性相关性和稳定性良好，证明了该方法具有很高的技术可行性。

本发明的HPLC分析方法定性和定量检测出了多种石榴产品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，可以用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。