高效液相串联质谱分析系统及其分析法

摘要

本发明公开了一种高效液相串联质谱分析系统及其分析法，该系统包括：高效液相色谱仪、质谱仪、脉冲进样器、电子脉冲装置、数据自动处理模块；其分析方法，包括：(1)待测样品经体外的生物孵育实验后，生成体外的生物样品；(2)加入终止溶剂，终止反应；(3)终止后的生物样品经过离心，取上清，经稀释后进样，进行高效液相串联质谱分析。本发明能够大大地节约分析时间，提高仪器使用率，节约人力等方面的成本，从而也为在新药筛选阶段节约了大量的时间，加快了实验进程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种液相串联质谱分析(LC-MS/MS)系统及方法，特别是涉及一种用于药物 筛选及生物样品分析的高效液相串联质谱分析系统及其分析法。

背景技术

高通量筛选(high throughput screening，HTS)技术是新药开发过程中不可缺少的一 环。新药研发的长周期要求必须提高开发效率，因此，高通量筛选方法得到了大力推广。

LC-MS/MS是液相色谱与质谱仪串联使用的一种分离分析检测仪，它主要利用液相色谱出 色的分离效果以及质谱的高灵敏度，高选择性的特点来完成化合物在医药领域内的高通量筛 选以及更进一步地研究。

LC-MS/MS联用方法有很多种，目前使用较多的有普通HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)、CTC自动进样器(瑞士CTC公司)与质谱串联使用，也有 自带自动进样器的HPLC或者UPLC(Ultra Performance Liquid chromatography，超高效液相 色谱)与质谱串联使用，这两者的缺点在于自动进样器的延迟时间太长导致整个样品分析的 时间延长导致浪费，此外还有因为自带的自动进样器板位少，所以一次所能承载的样品数比 较少不利于充分利用仪器。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于药物筛选及生物样品分析的高效液相串联质谱 分析系统及其分析法。本发明可以减少进样体积、缩短进样时间，并且能根据不同项目的要 求最大限度地减少分析物残留(Carry over)的影响，以及能更进一步地提高被分析物的检 测灵敏度。

为解决上述技术问题，本发明的用于药物筛选及生物样品分析的高效液相串联质谱 (HPLC-MS/MS)分析系统，包括：高效液相色谱仪、质谱仪，还包括：

脉冲进样器，用于调整脉冲进样体积，确保样品分析的稳定性、准确度以及精密度；

电子脉冲装置，用于反冲进样阀，辅助完成洗针过程；

数据自动处理模块，用于经高效液相色谱仪和质谱仪分析得到的批量数据，通过运用宏 来完成自动化处理。

所述高效液相色谱仪中，色谱柱为2～3cm长的反相C18色谱柱。

所述脉冲进样器为杰尔森自动进样器。

所述电子脉冲装置为电子脉冲反冲阀，其组成部分包括：220V电源、交流适配器、中间 继电器、时间继电器、计量泵和杰尔森限位开关六部分组成；其连接关系为Gilson(杰尔森) 限位开关接中间继电器；中间继电器和时间继电器接220V电源；中间继电器和计量泵接24V 直流电源；计量泵接中间继电器和时间继电器。电子脉冲反冲阀的运作原理是外部限位开关 给中间继电器一个12V信号，中间继电器开始工作；利用中间继电器常开状态供给时间继电 器220V电源，时间继电器开始工作；通过调节可使时间继电器在规定时间内闭合和断开其控 制线路的频率；线路开闭控制计量泵工作。

所述数据自动处理模块为：以DiscoveryQuant 2.0和Microsoft Excel VBA(Microsoft Corporation)为基础设计的数据处理模块；其中，DiscoveryQuant 2.0包括 DiscoveryQuant-Optimize和DiscoveryQuant-Analyze(Applied Biosystems Inc.)

另外，本发明还公开了一种用于药物筛选及生物样品分析的高效液相串联质谱的分析方 法，包括步骤：

(1)待测样品经体外的生物孵育实验后，生成体外的生物样品；

(2)加入终止溶剂(包括乙腈和甲醇)，终止反应；

(3)终止后的生物样品经过离心，取上清，经稀释后进样，进行高效液相串联质谱分析。

其中，步骤(1)中的体外的生物孵育实验，包括：肝微粒体代谢稳定性的孵育实验、血 浆蛋白结合的孵育实验、细胞渗透性的孵育实验、肝细胞代谢稳定性的孵育实验、待测样品 间相互作用的生物孵育实验。

本发明中的关于分析方法的建立过程中，涉及多个方面，包括：

1)挑选内标，对多个稳定的化合物进行方法考察优化其质谱参数并建立方法优化的模 板，将选定的内标化合物参数增加到数据库中备用；

2)根据需要建立不同的LC-MS/MS的方法模板；

3)化合物质谱参数的优化，应用自动化软件完成批量化合物的方法优化；

4)质谱方法的建立，从数据库中选择目标化合物的名称并同时选择一个或多个内标按 照一定的模板批次导出化合物完整的LC-MS/MS的方法；

5)用已经生成的方法对低浓度的标准品进行灵敏度考察同时进行方法的进一步优化， 包括流动相的优化，液相条件的优化；

6)电子脉冲装置的应用帮助改善残留对化合物分析的影响。

本发明具有高灵敏、高选择性、高通量等优点，因此，能广泛应用于药物的高通量筛选 及生物样品的分析。通过利用本发明的方法能够大大地节约分析时间，提高仪器使用率，节 约人力等方面的成本，从而也为在新药筛选阶段节约了大量的时间，加快了实验进程。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是杰尔森-高效液相色谱-质谱串联系统连接示意图；

图2是洗阀装置结构示意图。

具体实施方式

本实施例中的用于药物筛选及生物样品分析的高效液相串联质谱(HPLC-MS/MS)分析系 统，其系统连接图如图1所示，具体包括：

日本岛津高效液相色谱仪LC 20 AD(Shimadzu Inc)，本实施例中色谱柱为3cm长的型 号为Synergi Hydro-RP(Phenomenex.Inc)的C18反相色谱柱；日本岛津高效液相色谱仪， 该系统为二元泵色谱，它的特点在于与质谱兼容性好，操作简便并且液相泵速度比较快，主 要作用为快速提供梯度的液相变化；

API 4000质谱仪(Applied Biosystems Inc)，该质谱仪设备是分析器，其扫描速度快， 能够与本实施例中的自动进样器的快速进样匹配，灵敏度高，选择性强；

Gilson(杰尔森)自动进样器，用于调整脉冲进样体积，优化脉冲进样方式，确保样品 分析的稳定性、准确度以及精密度；而Gilson自动进样器的特点是进样速度快，延迟时间短， 可容纳12块384或96孔板；本实施例中选用Gilson 235自动进样器；

电子脉冲装置，用于反冲进样阀，辅助完成洗针过程，从而降低分析物残留；本实施例 中选用电子脉冲反冲阀(即洗阀装置，如图2所示)，其组成部分有220V电源、交流适配器、 中间继电器、时间继电器、计量泵和杰尔森限位开关六部分组成；其连接关系为Gilson限位 开关接中间继电器；中间继电器和时间继电器接220V电源；中间继电器和计量泵接24V直流 电源；计量泵接中间继电器和时间继电器；电子脉冲反冲阀的运作原理是外部限位开关给中 间继电器一个12V信号，中间继电器开始工作；利用中间继电器常开状态供给时间继电器220V 电源，时间继电器开始工作；通过调节可使时间继电器在规定时间内闭合和断开其控制线路 的频率；线路开闭控制计量泵工作；

数据自动处理模块，是以DiscoveryQuant 2.0和Microsoft Excel VBA(Microsoft Corporation)为基础设计的数据处理模块，用于经高效液相色谱仪和质谱仪分析得到的批量 数据，通过运用宏来完成自动化处理，提供工作效率；其中，DiscoveryQuant 2.0包括 DiscoveryQuant-Optimize和DiscoveryQuant-Analyze(Applied Biosystems Inc.)。 DiscoveryQuant 2.0设置于分析软件Analyst 1.4.2(Applied Biosystems Inc.)内；VBA 设置于Microsoft Excel(Microsoft Corporation)内。

利用上述系统，对生物样品进行分析，具体方法如下：

一、待分析的生物样品

1)肝微粒体代谢稳定性生物样品：采用不同种属的肝微粒体(人、大鼠、狗、猴)，在 体外模拟药物在肝微粒体中的代谢稳定性情况。

该反应体系中含有100毫摩尔磷酸钾缓冲盐，1毫摩尔氯化镁，1毫摩尔NADP，6毫摩尔 异柠檬酸和1单位异柠檬酸脱氢酶，微粒体浓度为0.7毫克每毫升，孵育温度为37℃，底物 浓度为1微摩尔，该实验中的底物有睾丸甾酮(testosterone，由Merck公司提供)，普罗帕 酮(Propafenone，购买于Sigma)，双氯芬酸(Diclofenac，购买于Sigma)，这三种化合物分别 是肝P450酶中的3A4、2D6和2C9的底物；孵育时间分别为0、5、10、20、30、60分钟，到 达每一时间点立即加入3倍体积的含有内标甲苯磺丁脲的冷甲醇或乙腈终止该反应，收集不 同时间点的样品后，在4000rpm转速下离心大约20分钟，取50微升上清后用150微升0.1％ 甲酸水或50％甲醇水稀释。

2)血浆蛋白结合生物样品：采用不同种属的血浆(人、大鼠、狗、猴)考察药物与血浆 蛋白的结合情况；

将华法灵(购买于Sigma)加入到超滤管的血浆中配制成2微摩尔，在37℃条件下经过 两小时的超滤，分别取出超滤过后的结合血浆样品和游离缓冲液样品，在两种不同基质样品 中加入等体积不同空白基质匹配后，分别加入2倍体积的含有内标甲苯磺丁脲的冷甲醇或乙 腈沉淀蛋白，在4000rpm转速下离心大约20分钟，取50微升上清后用150微升0.1％甲酸 水或50％甲醇水稀释。

3)细胞渗透性生物样品：采用不同的细胞模型如MDCK-MDR1，Caco-2等考察化合物肠道 的吸收以快速筛选口服药物，其中MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞系为马丁达比犬 肾上皮细胞发展的一种细胞间连接非常紧密的细胞系，低水平表达转运蛋白，低代谢活性。 MDCK细胞是在遗传学方面及细胞的脂质、蛋白质组成方面最为理想的上皮细胞系。MDR1是一 种膜蛋白，最主要的药物转运体，在药物的吸收、排泄及代谢，起着至关重要的作用。它可 以保护细胞免受外来毒性物质侵害。将哺乳动物肿瘤细胞暴露在一种细胞毒类药物中一段时 间后，这些细胞可通过降低胞内药物浓度而对一系列的药物产生抗性。将MDR1基因稳定转染 到MDCK细胞后，建立细胞模型用于研究MDR1与药物的相互作用；Caco-2细胞系来源于人类 结肠和直肠癌细胞，其结构和生化特点类似于人类小肠上皮细胞，细胞在生长至融合后有柱 状突起，类似小肠绒毛，并且含有小肠刷状缘上皮相关的酶。目前，Caco-2已经广泛应用于 新药的筛选与开发、药物肠吸收机制以及体外代谢模型的研究。关于Caco-2细胞模型的实验 主要通过测定电阻值(TEER)对模型进行评价。

3.1)MDCK-MDR1实验步骤：

3.1.1)细胞准备：

将MDR1-MDCK细胞终于BD 96-well Insert板中，密度为2×10⁵cells/cm²。然后于二 氧化碳培养箱中培养4-6天，即可用于渗透性实验。

3.1.2)配药：

步骤1：将化合物非诺特罗(fenoterol，购自Sigma Aldrich)、普萘洛尔(propanolol， 购自Sigma Aldrich)和地高辛(Digoxin，购自Sigma Aldrich)用DMSO稀释成0.5mM的母液。

步骤2：然后将化合物(0.5mM)用温浴到37摄氏度的HBSS溶液稀释到反应终浓度2uM。

步骤3：将反应溶液于37摄氏度的水浴中预热1小时。

3.1.3)渗透性实验：

时间点：2.5小时；孵育条件：温度37摄氏度；5％的二氧化碳；湿度95％ 给药浓度：2uM

3.1.4)样品收集：

收集50μL的溶液包括给药孔，接收孔，细胞裂解液及初始给药溶液与新的96孔分析 板中，再加入100μL的HBSS溶液和250μL的含内标的乙腈溶液，封板并充分混合；4000rpm 离心20分钟，取上清加入1倍体积的水稀释，封板；LC-MS检测。

3.2)Caco-2实验步骤

3.2.1)细胞准备：

将Caco-2细胞终于BD 96-well Insert板中，密度为1×10⁵cells/cm²。然后于二氧化 碳培养箱中培养21-28天，每两天更换培养液即可用于渗透性实验。

3.2.2)配药：

步骤1：将化合物阿替洛尔(Atenolol，购自Sigma Aldrich)、普萘洛尔(propanolol， 购自Sigma Aldrich)和地高辛(Digoxin，购自Sigma Aldrich)用DMSO稀释成0.2mM的母液。

步骤2：然后将化合物(0.2mM)用温浴到37摄氏度的HBSS溶液稀释到反应终浓度2uM。

步骤3：将反应溶液于37摄氏度的水浴中预热1小时。

3.2.3)渗透性实验

时间点：2小时；孵育条件：温度37摄氏度、5％的二氧化碳、湿度95％；给药浓度：2uM

3.2.4)样品收集：

收集50μL的溶液包括给药孔，接收孔，细胞裂解液及初始给药溶液与新的96孔分析板 中，再加入100μL的HBSS溶液和250μL的含内标的乙腈溶液，封板并充分混合。然后4000rpm 离心20分钟，取上清加入1倍体积的水稀释，封板；LC-MS检测。

4)肝细胞代谢稳定性生物样品：采用离体方法考察化合物在不同种属的肝细胞(人、大 鼠、狗、猴)中的代谢稳定性情况。

配制5×化合物：将化合物七-乙氧基香豆素(7-Ethoxycoumarin，Sigma Aldrich购买)， 七羟基香豆素(7-Hydroxycoumarin，Fluka购买)，戊脉安(Verapamil，Sigma Aldrich购买)， 睾丸激素(Testosterone，Tokyo购买)用DMSO稀释成3mM的母液。

分步稀释：用50％甲醇-水溶液将化合物(3mM母液)稀释到150uM。然后将化合物(150uM) 用温浴到37摄氏度的威廉姆斯培养基稀释到30uM。最后将化合物(30uM)用威廉姆斯培养 基稀释到反应终浓度15uM。

配制1×10⁶cells/mL细胞悬浮液：细胞从液氮罐中拿出，放入37度水浴孵育解冻，不 超过90秒，待细胞化成小冰球后加入孵育到37度的威廉姆斯培养液将细胞混匀，计数，如 细胞活率超过70％，直接进行反应。如细胞活率低于70％，则需要用Percoll梯度离心法富集 活细胞。计数，将细胞用威廉姆斯培养基稀释到反应体系浓度为1.25×10⁶cells/mL的细胞 悬浮液。

时间点反应：将细胞与化合物按4∶1的混合到孵育板中，将加好细胞的孵育板放入孵箱中 开始计时，按时间点0，5，10，20，40，80分钟记录时间，孵育条件37摄氏度、5％的二氧 化碳、湿度95％。

终止反应：到时间点后，将孵育板从孵箱中取出，加入2-3倍体积的含有内标的乙腈或者 甲醇终止反应，摇板10分钟，4000rpm离心20分钟，取上清加入2-3倍体积的0.1％甲酸水 稀释，封板，在摇板机上摇10分钟后LC/MS/MS检测。

5)药物之间相互作用生物样品：细胞色素P450酶家族存在很多种酶，每种酶都存在特 定的底物，特定的酶可以将底物代谢成相应的代谢物。

该实验使用5合1底物(Phenacetin，diclofenac，S-mephenytoin，dextromethorphan， Midazolam)，将待测药物和底物，NADPH，微粒体混合，反应体积200μL，37摄氏度条件下 孵育10分钟，加入200μL含内标的乙腈溶液终止反应；4000rpm离心20分钟，取上清后 用加一倍体积的水稀释，LC/MS/MS检测代谢产物。

二、分析过程

仪器和试剂：

1)质谱仪：API 4000(Applied Biosystems Inc.)

2)高效液相色谱仪：日本岛津高效液相色谱仪LC 20 AD(Shimadzu Inc.)

3)Gilson自动进样器：Gilson 235自动进样器(Gilson Inc.)；CTC自动进样器(Agilent Technologies公司的CTC PAL)

4)3cm色谱柱：Synergi Hydro-RP，C18，80A，4μm，2.1×30mm(Phenomenex Inc.)

5)96孔板(Axygen Inc.)

6)乙腈：(Merck Inc.)

7)甲醇：(Merck Inc.)

8)甲酸：(Fluka Inc.)

9)醋酸铵：(国药集团化学试剂有限公司)

实验过程：

高效液相色谱仪条件：

流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈；或流动相A：2毫摩尔的醋酸铵水， 流动相B：100％乙腈

进样体积：20微升

液相梯度：

流速：1.00毫升/分钟

质谱检测条件：

离子源类型：ESI(电喷雾离子源)

扫描模式：MRM(+)(正离子下的多反应监测模式)

质谱参数：气帘气20；雾化气50；加热气60；离子源温度550℃；ihe on；CAD 8；喷 雾电压5500；CXP 12

或扫描模式：MRM(-)(负离子下的多反应监测模式)

质谱参数：气帘气20；雾化气55；加热气60；离子源温度600℃；ihe on；CAD 8；喷 雾电压-4500；CXP-6

1)样品产生：上述五种生物样品产生后，经过离心，取上清后用合适比例的稀释液稀释， 稀释液作为最终样品可以经LC-MS/MS监测。

2)样品检测：采用两套方案对相同样品进行检测分析并比较结果以及方法上的差异。第 一套方案采用杰尔森自动进样器与岛津液相色谱仪以及质谱仪串联检测，具体步骤为：

第一步，采用VBA进行样品进样Batch编辑，只需输入每块样品板上相关位置的化合物 信息，程序自动生成所需Batch；

第二步，采用DiscoveryQuant-Optimize自动找出化合物的质谱分析方法(Q1/Q3；Q1 为一级质谱扫描，其主要目的是找出特征母离子；Q3为二级质谱扫描，主要目的是扫描特 征碎片离子)；

第三步，采用DiscoveryQuant-Analyze批量建立液相色谱串联质谱方法(采用MRM扫 描方式进行监测)，杰尔森自动进样器进样，由质谱监测。待样品检测完毕，得到所需数据。

第二套方案采用CTC自动进样器与岛津高校液相色谱仪以及质谱串联检测，具体步骤与 第一套方案相同，但两者所使用的LC-MS/MS方法不一样。

3)数据处理：经高效液相色谱仪和质谱仪分析得到的批量数据用 DiscoveryQuant-Analyze处理结果并导出数据；并将数据拷入数据自动处理模块中的数据分 析模板，经过VBA筛选判断相同时间点的平行性样品之间数据是否平行(偏差不超过20％)， 是否有未积分的样品等进行标注和判断，最终得到报告所需数据。

三、分析结果

对于上述生物样品，采用两套分析方案所得数据结果相近，但每一个样品所需的分析时 间存在一定的差异，具体比较结果如表1所示，在肝微粒体以及肝细胞代谢稳定性试验以及 细胞渗透性实验中，使用杰尔森-高效液相色谱-质谱串联系统比使用CTC自动进样器-高效液 相系统-质谱串联系统每-个样品所需时间从96秒缩短到40秒，效率提高了58％；此外，该 效率的提高还体现在了血浆蛋白结合以及药物之间相互作用的试验中，分别提高了22％和 50％。

表1 生物样品的分析结果

应用本发明的系统对不同类型的体外生物样品进行测试的结果表明该系统的适用范围可 以扩大到体外生物样品分析的试验中。

本实施例中，通过提高杰尔森进样速度减少延迟时间，同时外加电子脉冲反冲阀对进样 阀与进样针进行反复冲洗，采用2～3cm长度的色谱柱以及液相梯度洗脱，在实验室现有条件 的基础上进行改造，实现了低成本高效率的转换。