一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的荧光定量PCR方法

摘要

本发明涉及一种基于SYBR Green染料溶解曲线分析法同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子EF和溶血素基因SLY的荧光定量PCR方法。根据GenBank公开的猪链球菌2型EF、SLY基因保守序列，设计、合成2对特异引物，优化PCR反应体系和反应条件，通过分析扩增曲线和溶解曲线，建立了同时检测猪链球菌2型EF、SLY基因的SYBR GreenI染料法荧光定量PCR方法。在此基础上，优化EF、SLY引物的摩尔比，调整2对引物的扩增效率，使溶解曲线中2个产物峰大小接近。利用建立的SYBR Green染料溶解曲线分析法能够方便的同时检测出猪链球菌2型EF、SLY基因。

说明书

技术领域

本发明涉及一种SYBR Green染料溶解曲线分析法检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重荧光定量PCR方法，属于核酸检测领域。 

技术背景

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是呈世界性分布的重要的人兽共患病病原，是多年来一直困扰养猪业的主要传染病之一。猪急性感染常表现为出血性败血症和脑膜炎，慢性感染表现为关节炎、心内膜炎、淋巴结化脓。人感染链球菌患中毒性休克和脑膜炎。猪链球菌不仅严重阻碍养猪业的健康发展，还威胁人类的生命安全，因此有必要严密监控猪链球菌的流行病学变化。 

猪链球菌血清型众多，抗原结构复杂。根据链球菌群特异性抗原的不同，用兰氏(Lancefield)血清学分类，可将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U等19个血清型。其中C、D、E、L、R、S等群链球菌可引起猪链球菌病，如C群的兽疫链球菌(S.zooepidemicus)和类马链球菌(S.epuisimilis)、D群的猪链球菌(S.suis)、R群的猪2型链球菌(S.suis subtype 2，SS2)。20世纪80年代我国流行的猪链球菌病临床上多表现为关节炎和脑膜炎，90年代由于C群链球菌疫苗免疫使病情有所缓解。1990年在我国广东省首次发现猪群有类似2型链球菌病，但未见人感染发病。1998～1999年，江苏省和浙江省部分县、市先后两次爆发猪2型链球菌病，上万头猪发病，同时还传染从业人员几十人，发生脑膜炎、关节炎及中毒性出血性休克征，病人出现多脏器功能损害，从病人和病猪中分离出猪链球菌2型菌株，人源SS2分离株与猪源SS2分离株为同源株。2005年6月下旬，四川省资阳、内江等地近80例患者SS2感染急性发病，出现中毒性休克、脑膜炎，有12例重症患者死亡。目前我国流行的猪链球菌病以SS2为主。1968年国际上首次报道SS2引起人类严重感染病例。至1989年国外共报告了108例SS2所致人类感染的病例，1994、1997、1999年国外又相继有该菌引致人类严重感染及死亡病例的报道。 

SS2存在复杂的致病机制。SS2菌株的致病性强弱与是否具有毒力因子密切相关。已经发现SS2产生多种毒力因子，如溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、荚膜多糖(CPS)、纤连蛋白结合蛋白(FBPS)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、IgG结合蛋白(IBP)、精氨酸脱亚氨酶(AD)、二肽肽酶IV(DPP IV)等等。其中MRP、EF、SLY为三个最重要的毒力因子。我国两次爆发的SS2均为MRP⁺EF⁺SLY⁺表型。而EF、SLY两种毒力因子为分泌到胞外的毒力因子，可随宿主的血液扩散到宿主全身，可能对SS2自身的扩散、 对宿主全身性损伤、与其它病原微生物间的相互作用方面起到一定作用，有必要针对这两个毒力因子的分子流行病学和遗传变异情况加强监测。 

报道的检测SS2毒力因子的主要方法为常规PCR和多重PCR方法。Smith等利用CPS基因序列建立了针对1、2、9型猪链球菌的型特异性PCR鉴定方法。马清霞等建立了能同时检测SS2的CPS、MRP、EF的多重PCR方法，可直接从临床病料中检测出SS2并能鉴定其毒力因子表型。何孔旺等用PCR方法检测SS2的MRP和EF，敏感度可达100个细菌。 

与常规PCR相比，荧光定量PCR方法具有诸多优点：(1)封闭反应，无需PCR后处理，避免了常规PCR电泳鉴定时EB的危害；(2)特异性更强，灵敏度更高，荧光PCR的灵敏度比常规PCR高100倍以上；(3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；(4)定量可达10个数量级；(5)仪器在线实时检测，结果直观，避免人为判断；(6)可实现一个反应同时检测多个参数；(7)缩短时间(整个反应只需要0.5-2小时)，提高效率。目前荧光定量PCR已得到广泛应用。 

荧光定量PCR分为SYBR荧光染料法和Taqman探针法。Taqman探针法特异性强，需要针对不同的模板设计特定的荧光探针，价格昂贵。而SYBR Green I染料是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料，其与双链DNA结合后荧光信号显著增强。SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。对不同模板不需特别设计不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低，国内外在科研、检测中使用比较普遍。由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，在临床上使用可能会有假阳性发生，因此还需要结合溶解曲线分析判定是否为阳性结果。SYBRGreen I染料法荧光定量PCR可用于多重检测，在一个荧光定量PCR反应管中加入多对引物，通过优化引物的比例，经过PCR扩增和溶解曲线分析可同时判定多个检测结果。基于Taqman探针法检测SS2的荧光PCR方法有吴绍强等(2009)建立的检测EF基因、吴绍强等(2009)建立的检测MRP基因及林祥梅等(2009)建立的检测MRP、EF基因的荧光PCR方法，这些方法都具有快速、敏感、特异、安全等优点。 

本发明根据公开的SS2的EF和SLY基因序列设计引物，建立基于SYBR Green I染料溶解曲线分析的多重荧光定量PCR方法，通过一个荧光定量PCR反应可以同时检测SS2的EF和SLY基因。 

发明内容

本发明提供了一种基于SYBR Green I染料溶解曲线同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重荧光定量PCR方法，用于猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的快 速、鉴别检测。 

通过对Genbank中公开的SS2的EF和SLY基因序列比对，选取SS2的EF和SLY基因序列中的保守序列，用Premier Primers 5.0软件和Oligo 6.0软件设计引物，EF上游引物为：5′-GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3′；EF下游引物为：5′-ACATTCTGACCACTCGCATC-3′；扩增的SS2的EF片段大小为158bp，产物的Tm值为84℃；SLY上游引物为：5′-TTCCGATTTCGTATTCAACC-3′；SLY下游引物为：5′-AACTGTTCTCCACCACTCCC-3′；扩增的SLY片段大小为338bp，产物的Tm值为80℃。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 

本发明的荧光定量PCR反应体系为20ul体系，按顺序加入以下试剂： 

其中，Master Mix为SYBR Green I染料、聚合酶、dNTP、Mg²⁺、PCR缓冲液的混合液。以上操作均在冰上进行，所有试剂加完后，盖盖，低速离心(1500g×2min)，置荧光PCR仪上进行荧光定量PCR反应。 

本发明的荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，扩增40-45个循环。溶解曲线分析：95℃变性5s，65℃退火1min，升温速率2.2℃/s，于65℃时开始连续采集荧光信号，直至97℃，40℃冷却PCR仪10s。 

本发明的步骤包括： 

(1)冰上操作，按顺序加入一定量的H₂O、引物、Master Mix、待测样品基因组模板，盖盖，低速离心。 

(2)将上述20ul的反应体系放到荧光PCR仪上，设定荧光PCR反应程序，进行荧光PCR扩增，记录各样品荧光PCR反应的Ct值和Tm值。 

(3)根据Ct值和Tm值，判定猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的检测结果。 

(4)扩增曲线判定标准为：反应曲线呈对数增长时，如果Ct值＜30，同时溶解曲线满足(5)中的标准则判定为阳性；如果30＜Ct值＜40，判定为可疑，需加大模板量重复扩增，若得到相同的实验结果，同时溶解曲线满足(5)中的标准则判定为阳性，否则为阴性；反应曲线为一条直线，则判定为阴性。 

(5)溶解曲线判定标准：如果反应体系出现84℃、80℃两个峰则判定为EF和SLY基因 均为阳性；如果只出现84℃峰，则判定为EF阳性；如果只出现80℃峰，则判定为SLY阳性；如果没有出现峰，则判定为阴性。 

本发明具有灵敏度高、不需电泳检测、避免污染和散毒、检测时间短等优点，而且SYBRGreen染料法检测成本低，试剂通用性强，不需针对不同模板设计特定的荧光探针，结合溶解曲线分析可用于多重荧光定量PCR检测。 

附图说明

附图1猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR溶解曲线分析结果。猪链球菌2型EF、SLY基因的荧光定量PCR检测溶解曲线分析的Tm值分别为84℃、80℃。 

附图2猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的引物比例优化结果。SLY、EF引物摩尔比为2∶1时，荧光定量PCR溶解曲线分析显示2个产物峰的大小接近。 

附图3猪链球菌2型EF、SLY基因的荧光定量PCR标准曲线。上图为EF基因的荧光定量PCR标准曲线，下图为SLY基因的荧光定量PCR标准曲线。 

附图4猪链球菌2型EF、SLY基因的荧光定量PCR灵敏度检测。猪链球菌2型EF、SLY基因的荧光定量PCR检测灵敏度可达0.002ng/ul。 

附图5猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的特异性检测。 

附图6猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的重复性检测 

具体实施方式：

实施例1引物的设计与合成 

根据GenBank中公开的猪链球菌2型的EF、SLY基因序列，通过基因序列比对，选取保守序列，选取的EF、SLY的公开序列的GeneBank登录号分别为DQ417121.1、DQ443530.1。使用Primer PremierS 5.0和Oligo 6软件自行设计EF、SLY引物，引物由上海生工生物技术公司合成。 

EF上游引物为：5′-GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3′；EF下游引物为：5′-ACATTCTGACCACTCGCATC-3′。扩增的EF片段大小为158bp，产物的Tm值为84℃。 

SLY上游引物为：5′-TTCCGATTTCGTATTCAACC-3′；SLY下游引物为：5′-AACTGTTCTCCACCACTCCC-3′。扩增的SLY片段大小为338bp，产物的Tm值为80℃。 

实施例2细菌DNA的提取 

以猪链球菌2型HA9801株单菌落接种灭菌Todd-Hewitt肉汤培养基，37℃过夜培养，取 细菌液1mL，12000rpm离心2min，沉淀用567μL的TE缓冲液(pH8.0)重悬，加入30μL的10％SDS和3μL的20mg/mL的蛋白酶K，充分混匀，37℃水浴1h，加入100μL 5mol/L的NaCl，充分混匀再加入80μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀，12000rpm离心10min，吸取上清加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，12000rpm离心10min，吸取上清，加入0.6体积的异丙醇，放入-20℃20min，使DNA充分沉淀，12000rpm离心10min，沉淀用70％的乙醇洗涤2次，然后在室温下干燥，使乙醇挥发，沉淀用20μL pH8.0的TE(不含DNA酶的胰RNA酶20μg/mL)溶解。 

测定提取DNA溶液的浓度和纯度。荧光PCR反应时调整DNA的浓度，吸取适量DNA，使20ul的PCR反应体系中模板含量为50-100ng。 

实施例3猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的建立 

荧光PCR反应体系： 

本发明的荧光定量PCR反应体系为20ul体系，冰上操作，按顺序加入以下试剂： 

其中，Master Mix为SYBR Green I染料、聚合酶、dNTP、Mg²⁺、PCR缓冲液的混合液。荧光PCR反应条件： 

预变性：95℃，5min 

荧光PCR扩增40-45个循环：变性95℃，10s；退火，55℃，20s；延伸，72℃，30s 

溶解曲线反应程序：95℃，5s；65℃，1min；97℃，continuous；升温速率2.2℃/s，于65℃时开始连续采集荧光信号，直至97℃。 

冷却：40℃，10s 

荧光PCR反应判定标准： 

根据Ct值和Tm值，判定猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的检测结果。 

扩增曲线判定标准为：反应曲线呈对数增长时，如果Ct值＜30，同时溶解曲线满足阳性标准则判定为阳性；如果30＜Ct值＜40，判定为可疑，加大模板量重复扩增，得到相同的实验结果，同时溶解曲线满足阳性标准则判定为阳性，否则为阴性；反应曲线为一条直线，则判 定为阴性。 

溶解曲线分析判定标准：Tm值相差2℃以上时判定为二种不同的产物峰，而对Tm值相差2℃内的扩增在溶解曲线上只表现为一个峰值。如果反应体系出现84℃、80℃两个峰则判定为EF和SLY基因均为阳性；如果只出现84℃峰，则判定为EF阳性；如果只出现80℃峰，则判定为SLY阳性；如果没有出现峰，则判定为阴性。引物二聚体的产生会干扰溶解曲线图，但通常有引物二聚体的熔解曲线在70-75℃间会有小波峰出现。结果见附图1。 

实施例4猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的引物比例优化 

多重荧光定量PCR反应中使用相等质量的引物，扩增效率并非相同，表现在溶解曲线中产物峰大小不同，有的悬殊较大。解决这一问题，要求改变反应中各种引物的比例，要增加“弱”基因的引物量，而要减少“强”基因的引物量。即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。 

在荧光定量PCR反应体系中只改变EF、SLY两对引物的添加比例，使SLY与EF引物的摩尔浓度比分别为1∶1、2∶1、5∶1、8∶1、10∶1，两对引物的总摩尔浓度为1uM，保持其它试剂的量不变，考察引物比例对溶解曲线中两个产物峰的影响。 

结果表明，以优化的引物比进行荧光定量PCR同时扩增SS2的EF、SLY基因，在SLY∶EF引物摩尔比为2∶1时，扩增曲线呈典型的S型曲线，溶解曲线分析显示有SLY、EF的峰值大小接近，Tm值分别为84、80℃，没有出现杂峰，表明本发明的特异性好。SYBR Green荧光染料可与任何双链DNA结合，在荧光PCR扩增后添加溶解曲线分析，此时温度大于扩增产物的Tm值，使扩增产物处于解链状态，不能结合荧光染料，荧光信号应消失，以消除非特异性扩增。结果见附图2。 

实施例3猪链球菌2型EF、SLY基因的荧光定量PCR标准曲线建立 

取猪链球菌2型HA9801菌株的37℃24小时培养的菌液1ml，提取DNA，用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度，以10倍倍比稀释成标准品，取每个稀释度的DNA作模板进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应体系中只加入一对引物，分别进行猪链球菌2型EF和SLY基因的荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR扩增结束后以起始模板浓度的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制回归曲线，分别建立EF、SLY检测的标准曲线。 

结果表明，以稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的DNA模板进行荧光PCR检测，扩增曲线呈典型S型，以起始模板浓度的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制回归曲线。猪链球菌2型的EF基因荧光定量PCR检测的标准曲线为：y＝-3.47x+9.637，斜率为-3.47， R²＝0.9981，扩增效率为1.942。猪链球菌2型的SLY基因荧光定量PCR检测的标准曲线为：y＝-3.874x+9.14，斜率为-3.874，R²＝0.9957，扩增效率为1.812。结果见附图3。实施例4猪链球菌2型EF、SLY基因的荧光定量PCR灵敏度检测 

取猪链球菌2型HA9801菌株的菌液1mL，离心，取沉淀，提取细菌DNA，用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度，以10倍倍比稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10，取每个稀释度的DNA作模板进行荧光定量PCR扩增和溶解曲线分析。以灭菌蒸馏水为阴性对照。荧光定量PCR反应体系中只加入一对引物，分别进行猪链球菌2型EF和SLY基因的荧光定量PCR扩增。扩增后，分析扩增曲线和溶解曲线，以Ct值＝35为检测底限，确定本方法能检测出的最低模板浓度作为EF基因或SLY基因荧光定量PCR检测的灵敏度。 

结果表明，提取的DNA的浓度为2000ng/ul，纯度适合进行荧光定量PCR检测。在单独进行的猪链球菌2型EF或SLY基因的荧光定量PCR检测时，模板浓度大于0.002ng/ul时都能顺利检测出EF或SLY基因，扩增曲线呈典型S型，溶解曲线为单峰，EF基因的荧光定量PCR溶解曲线分析时Tm值为84℃，SLY基因的荧光定量PCR溶解曲线分析时80℃，没有出现杂峰。模板浓度小于0.002ng/ul时扩增曲线的循环数大于38个循环，EF或SLY基因的荧光定量PCR扩增中未检测到荧光信号。阴性对照未检测到荧光信号。结果见附图4。实施例5猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的特异性检测 

分别挑取大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、马链球菌兽疫亚种、鸭疫里默氏杆菌等菌株单菌落，在LB液体培养基中振荡培养24h，分别取1ml菌液，离心取菌体，提取DNA。用本发明建立的荧光定量PCR方法扩增上述菌株的DNA，以验证本发明检测的特异性。以HA9801株的DNA为阳性对照，以灭菌蒸馏水为阴性对照。 

结果表明本发明的特异性强。本发明分别荧光定量PCR扩增大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、马链球菌兽疫亚种、鸭疫里默氏杆菌DNA及灭菌蒸馏水，均未检测到荧光信号，无S型扩增曲线出现；而阳性对照在扩增时出现S型曲线，溶解曲线显示2个峰，分别对应84、80℃。结果见附图5。 

实施例6猪链球菌2型EF、SLY基因的多重荧光定量PCR的重复性试验 

取三个不同培养批次的猪链球菌2型HA9801株37℃20小时培养的菌液1ml，提取DNA，每个批次的样品重复检测三次，验证本方法的重复性。以HA9801株的DNA为阳性对照，以 灭菌蒸馏水为阴性对照。 

检测结果表明，三个批次的样品、每个样品重复检测3次的结果一致，都检测出EF、SLY基因，批间检测的变异系数(CV％)为1.4％，每个样品重复检测3次的变异系数(CV％)为1.02％，表明本发明具有良好的重复性，从而保证了检测数据的可比性。结果见附图6。 

实施例7SS2分离株的EF、SLY基因检测 

挑取2008-2020年间本单位自行分离的19株SS2分离菌单菌落，T-H肉汤37℃静置培养24小时，提取DNA，用本发明建立的荧光定量PCR方法检测分离株的EF、SLY基因。以HA9801株的DNA为阳性对照，以灭菌蒸馏水为阴性对照。 

荧光定量PCR检测结果表明，19株分离株及阳性对照的DNA模板的荧光PCR扩增曲线均呈典型的S形曲线，Ct值在15-40之间，溶解曲线显示均出现84、80℃两个峰，而阴性对照未检测到荧光信号，表明检测方法成立，分离菌的EF、SLY阳性率均为100％。