南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用

摘要

本发明公开了南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用，系选择南芥菜花叶病毒特异且各株系之间比较保守的CP编码基因片段为靶目标序列，经过精心设计并合成，包含三对特异性引物，目标片段长度为226bp，引物序列为：Ccccgttccattcactaacaactcttttattggtggtatggtcaaggg、Actggaatcaactgtttaaataccccgtttttagggggagcgaatttcaat，Taatacactcttgagttactatctagg、Taagcgcagtggagttcgat，Tgccataagtgcaagggct、Tgttacatcgaggaggatgg；本发明克服了常规RT-PCR费时、设备昂贵以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的ArMV进行快速准确的定性检测，具有成本低廉、简单易操作、结果直观、敏感性高和重复性好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及检测南芥菜花叶病毒的生物制剂，具体涉及南芥菜花叶病毒RT-LAMP 检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线 虫传多面体病毒属(Nepovirus)，病毒粒体为等径多面球体，直径约30nm。ArMV是一 种极易传播蔓延的病毒，它的寄主范围广泛，可侵染约174属215种植物，危害蔬菜、 花卉、树木等多种经济作物；ArMV引起悬钩子黄矮，草莓花叶，黄瓜矮化斑驳，莴苣 褪绿矮化，芹菜矮化坏死，连翘黄果等症状。南芥菜花叶病毒可经种子、汁液、嫁接、 机械、菟丝子以及介体线虫传播。目前，该病毒主要分布于欧洲、美洲、大洋洲和亚洲 的日本，是我国对外公布的检疫性有害生物。

南芥菜花叶病毒的检测方法主要包括血清学检测(DAS-ELISA)和逆转录-聚合酶 链式反应(RT-PCR)技术。血清学方法常用的如公开号为CN101893631的的发明专利 申请，是双抗体夹心酶联检测南芥菜花叶病毒的技术，适用于多样本的初筛，具有操作 简单的优点，但其检测灵敏度较低，且常常由于抗体制备的质量问题而出现非特异性反 应。RT-PCR方法如公开号为CN101307365的发明专利申请，是检测南芥菜花叶病毒的 病毒核酸的技术，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理， 操作复杂，检测成本较高，检测时间周期较长，需6～8小时，还接触有毒试剂溴化乙 锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcript loop-mediated isothermal  amplification，RT-LAMP)的反应试剂包括反应缓冲液(内含引物)、反应酶液和显色剂等， 由该反应试剂组成的试剂盒中还包括RNA提取液、阳性对照液和阴性对照液等，该反 应试剂依赖于能够识别靶序列上6～8个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式 扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异的扩增靶序列。由于LAMP 呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6～8个特异性 位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需 特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1.5h～2.5h，检测周期 非常短。

因此，研究建立特异、灵敏以及操作简单的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测的方法， 在现场快速检疫及病原诊断等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对南芥菜花叶病毒具有特异性高、检测周期 短、成本低廉和操作简单的RT-LAMP检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明系选择南芥菜花叶病毒外壳蛋白(coat protein，CP)编码基因的保守片段为 靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物。将设计的多对引物进行反应时间 和反应温度优化试验，得到最合适的反应条件。

本发明所述的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂，包括反应缓冲液，所述反应缓 冲液包含三对特异性引物，特异性引物序列为：

FIP：5′-ccccgttccattcactaacaactcttttattggtggtatggtcaaggg-3′

BIP：5′-actggaatcaactgtttaaataccccgtttttagggggagcgaatttcaat-3′

F3：5′-taatacactcttgagttactatctagg-3′

B3：5′-taagcgcagtggagttcgat-3′

Loop1：5′-tgccataagtgcaagggct-3′

Loop2：5′-tgttacatcgaggaggatgg-3′

本发明所述的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂的制备方法由下述步骤组成：

一、选择南芥菜花叶病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，目标片段长度为226bp， 该保守片段的核苷酸序列为：

taatacactc ttgagttact atctaggcat tgggggtatt gtcaagggaa     50

aggtgcatgt ttgtagccct tgcacttatg gcatagtcct aagagttgtt    100

agtgaatgga acggggtcac taacaactgg aatcaactgt ttaaataccc    150

cgggtgttac atcgaggagg atgggagctt tgctattgaa attcgctccc    200

cctaccatcg aactccactg cgctta                              226

二、应用primer Express 3.0软件，设计合成引物；

三、引物的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行 OligoDNA的合成；

四、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测 应用评估，得到扩增效率和特异性好的上述三对特异性引物。

本发明的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂是构建出上述扩增效率和特异性好的 三对引物，克服了常规RT-PCR费时，对设备要求高等缺点，可对样品中的ArMV进行快 速准确的定性检测，具有特异性好、简单易操作、结果直观和成本低廉等优点。具体优 点如下：

1、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有特异、敏感的优点；RT-LAMP技术 的关键是针对靶基因的6～8个区域设计三对特异引物，当引物完全识别靶序列结合区并 匹配的情况下才能顺利进行，这一点实现了该技术的高度特异性。

2、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，操作简单，无需昂贵设备。RT-LAMP 反应只需要一个简单的恒温水浴锅，不需要昂贵的PCR仪，操作简单，成本低廉，易于 在现场操作或基层推广应用。

3、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有检测周期短的优点。该方法采用一 种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，呈恒温扩增，不需要PCR仪升降温 的时间，也无需DNA凝胶电泳观察，所以检测时间非常短，扩增效率非常高。常规RT-PCR 的样品检测时间一般4小时以上，而本发明的检测时间只在1.5h～2.5h左右。

4、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，结果无需PCR电泳等复杂的后处理程 序，只要加入染色剂，根据反应体系是否出现变色现象，用肉眼就可以快速定性判断 RT-LAMP结果，具有结果直观、判定难度小的优点。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1、设计引物

本发明选择ArMV外壳蛋白编码基因的保守片段为靶目标，通过GenBank中报道 的ArMV各株系的CP编码基因序列进行同源性分析比较，选定ArMV特征基因的保守 片段(226bp)，应用primer Express3.0软件，设计引物(包括所述FIP、BIP，F3、B3， Loop1、Loop2三对引物)。引物的合成采用常规的β-乙腈亚磷酸胺化学合成法。将设 计合成的多对引物进行反应时间和温度优化实验后，确定扩增效率和特异性最好的反应 条件。

2、RNA提取

取100μL体积的研磨匀浆样品上清液，加入700μL Trizol试剂，200μL氯仿，室温 振荡充分混匀10min，12000r/min(4℃)离心10min，小心吸取上清，加入等体积的 异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min(4℃)离心10min，弃上清，沉淀 用70％乙醇洗涤一次，干燥后溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中， 得到RNA模板。

3、南芥菜花叶病毒RT-LAMP扩增温度的优化试验

南芥菜花叶病毒RT-LAMP采用20μL体积反应体系，反应体系如下：含有引物的2 ×LAMP Mix 10μL，其中引物F3和B3的终浓度各为0.26μM，Loop1和Loop2的终浓 度各为1.04μM，FIP和BIP的终浓度各为2.08μM；BstDNA聚合酶(8U/μL)1.5μL， AMVRNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板RNA 1μL，用ddH₂O补充至总体积20μL。在 水浴锅中，以南芥菜花叶病毒RNA为模板，按照RT-LAMP检测方法，分别在60℃、 63℃和65℃三个温度条件下进行扩增，反应时间为1h，结果：在60℃温度条件下扩增 效果最好。每次检测时，设立空白对照和阴性对照，每个样品检测做3管平行试验，在 空白对照、阴性对照为阴性，南芥菜花叶病毒样品出现阳性结果时，整个试验有效，可 进一步判断结果。

4、南芥菜花叶病毒RT-LAMP扩增时间的优化试验

以南芥菜花叶病毒RNA为模板，按照上述RT-LAMP反应体系检测方法，分别在 30min、60min和90min三个时间条件下进行扩增，反应温度为60℃，反应体积为20μL， 结果：在60min条件下扩增效果最好。每次检测时，设立空白对照和阴性对照，每个 样品检测做3管平行试验，在空白对照、阴性对照为阴性，南芥菜花叶病毒样品出现阳 性结果时，整个试验有效，可进一步判断结果。

5、南芥菜花叶病毒RT-LAMP的特异性和敏感性试验

南芥菜花叶病毒RT-LAMP的特异性试验：采用南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒、 番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒以及草莓潜隐环斑病毒等样本RNA 进行特异性比较检测。对感染ArMV的百合样品，采用Trizol试剂方法提取得到含有 ArMV核酸的总RNA，进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和RT-LAMP检测，比较 它们的敏感性，常规RT-PCR采用的引物与RT-LAMP的B₃、F₃引物一致，常规RT-PCR 的检测条件和方法参照文献所述(闻伟刚等，植物检疫，2003，17(6)：330～332)。 结果：对南芥菜花叶病毒样本和感染ArMV的百合样品检测，本发明的RT-LAMP和常 规RT-PCR检测都呈阳性，而对烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜 绿斑驳病毒以及草莓潜隐环斑病毒都呈阴性，说明上述三对引物具有很好的特异性。对 10倍系列稀释的ArMV核酸进行扩增，结果显示RT-LAMP检测灵敏度要比常规RT-PCR 方法的检测灵敏度高出10倍。

6、南芥菜花叶病毒RT-LAMP的稳定性和重复性试验

在评估RT-LAMP检测ArMV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳 性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行RT-LAMP检测，每次试验的每个样 品做6个平行的反应管，重复12次，结果：上述三对引物的扩增样品平行试验阳性结 果稳定，重复性好。我们获得了特异、敏感、稳定的上述F3、B3，FIP、BIP，Loop1、 Loop2三对引物。

7、对样品的检测、对比试验和验证试验

对表现矮化、花叶等症状的植物叶片样品以及南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒、番 茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、草莓潜隐环斑病毒等感染的植物组织 和健康百合叶片提取液等样本进行RT-LAMP检测，结果表明，ArMV阳性样品均发生 明显的颜色变化，呈现黄绿色，阴性对照及阴性样品均呈橘红色。三个平行试验的结果 稳定一致。证明RT-LAMP检测ArMV的特异性强、敏感度高和重复性好。

8、南芥菜花叶病毒RT-LAMP标准化试剂和检测程序

8.1标准化检测试剂盒组份(20μL反应×100次)：

  溶液I   35mL×2瓶   溶液II   1.25mL×2支   溶液III   150μL   溶液IV   100μL   溶液V   1.25mL×2支   溶液VI   100μL   溶液VII   100μL   溶液VIII   100μL

按照优化的反应条件配制：溶液I为RNA提取液(Trizol)，溶液II为反应缓冲液： 含有F3、B3(浓度各为0.26μM)，Loop1、Loop2(浓度各为1.04μM)，FIP、BIP(浓 度各为2.08μM)共三对引物的2×LAMP反应缓冲液，溶液III为含有8U/μL的Bst DNA 酶溶液，溶液IV为含5U/μL的AMV酶溶液，溶液V为DEPC处理水，溶液VI为阳 性对照液(含有ArMV阳性RNA)，溶液VII为阴性对照液，不含有ArMV阳性RNA， 溶液VIII为显色剂，由SYBR green I原液按照1∶10体积比例溶于双蒸水配制。上述RNA 提取液、SYBR green I和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水购自上海生物工程公司，Bst DNA 酶、AMV酶和LAMP反应缓冲液购自大连Takara公司。

8.2操作方法

8.2.1总RNA提取

(1)取0.1～10克组织样品，按1∶10(克∶mL)加入蒸馏水，充分研磨匀浆，2000 r/min，4℃，离心10min；

(2)取100μL上清液加入700μL溶液I和200μL氯仿，小心盖上帽盖，充分振荡 混匀，室温静置5min，彻底裂解。12000r/min，4℃，离心10min；

(3)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5mL管中，加入等体积的异丙醇，颠倒 混匀后室温静置10min。12000r/min，4℃，离心10min，弃上清液；

(4)沉淀用70％乙醇洗涤一次，晾干后，溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处 理的双蒸水中。可直接用于检测或-70℃保存备用；

8.2.2反应组份配制

(1)取一支200μL PCR反应管，反应总体积为20μL，向反应管中加入下列反应物：

(2)设立对照

阳性对照和阴性对照各设2管；

8.2.3扩增

在水浴锅中，按下列反应参数进行：60℃恒温反应60min；

8.2.4结果分析和判定

(1)结果分析条件设定

在扩增结束后的PCR管中加入1μL的溶液VIII，混匀之后观察颜色变化；

(2)质控标准

——阴性对照PCR管内溶液呈橘红色；

——阳性对照PCR管内溶液呈黄绿色；

(3)结果描述及判定

——阴性

PCR管内溶液呈橘红色，表明样品中无南芥菜花叶病毒；

——阳性

PCR管内溶液呈黄绿色，表明样品中存在南芥菜花叶病毒。

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

 

<120>南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.1

 

<210> 1

<211> 48

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据ArMV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400> 1

Ccccgttcca ttcactaaca actcttttat tggtggtatg gtcaaggg  48

 

<210>2

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据ArMV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>2

Actggaatca actgtttaaa taccccgttt ttagggggag cgaatttcaa t  51

 

<210>3

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据ArMV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>3

Taatacactc ttgagttact atctagg   27

 

<210>4

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据ArMV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>4

Taagcgcagt ggagttcgat   20

 

<210>5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据ArMV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>5

Tgccataagt gcaagggct   19

 

<210>6

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据ArMV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>6

Tgttacatcg aggaggatgg   20

 

<210>7

<211> 226

<212> RNA

<213> 南芥菜花叶病毒

 

<400>7

taatacactc ttgagttact atctaggcat tgggggtatt gtcaagggaa   50

aggtgcatgt ttgtagccct tgcacttatg gcatagtcct aagagttgtt    100

agtgaatgga acggggtcac taacaactgg aatcaactgt ttaaataccc  150

cgggtgttac atcgaggagg atgggagctt tgctattgaa attcgctccc   200

cctaccatcg aactccactg cgctta                        226