内生真菌HL-02及其在制备D-泛解酸内酯中的应用

摘要

本发明公开了一种微生物新菌株内生真菌HL-02(PlectospHaereella cucumerina HL-2)及其在微生物转化制备D-泛解酸内酯中的应用，所述的应用以DL-泛解酸内酯为底物，以内生真菌HL-2发酵所得菌液或菌液制备的初酶液为酶源，20～45℃下，在含有氯化钙的Tris-HCl缓冲溶液的反应体系中进行水解反应得水解液，取水解液用乙酸乙酯进行酯化反应，反应液经后处理制得D-泛解酸内酯；本发明提供了一株新的可产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌种内生真菌HL-2，该菌种应用于拆分DL-泛解酸内酯，立体选择性好，反应条件温和。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株内生真菌HL-02及其在微生物转化制 备D-泛解酸内酯中的应用。

(二)背景技术

泛酸(Pantothenic acid，α，γ二羟基-β，β-二甲基丁酰-β丙氨酸)，又 称本多生酸、维生素B₅或B₃，是一种重要的食品添加剂和饲料添加剂，也 是一种重要的维生素药物。D-泛酸有100％的生理活性，而L-泛酸没有活 性，由于D-泛酸对热、碱、酸均不稳定，多以D-泛酸钙形式存在。

D-泛酸属于B族维生素类物质，进入人体内能转化合成为辅酶A，促 进人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤表面的粘膜和毛发光泽，防 止疾病的发生。缺乏D-泛酸会导致皮肤病变及生理障碍。

D-泛解酸内酯是生产D-泛酸的关键手性中间体，生产D-泛酸的关键是 拆分DL-泛解酸内酯。

DL-泛解酸内酯的拆分通常是采用化学方法拆分，用手性拆分剂(奎 宁化合物、二甲马钱子碱或氯霉胺等)拆分泛解酸内酯，但是化学拆分法 存在价格昂贵、成本高、分离困难并有环境污染和毒性问题。而生物酶法 具有成本低，反应条件温和，环境污染小的优点，随着人们对绿色环保的 追求，生物酶法越来越引起人们的重视。

生物酶法拆分DL-泛解酸内酯，是用微生物产的酶进行拆分转化，得 到D-泛解酸内酯。生物酶法生产D-泛解酸内酯有多种技术路线，其中， D-泛解酸内酯水解酶法的生产技术相对成熟，具有底物总利用率高，产 品纯度较高等优点，在特定的反应条件下，游离酶或固定化细胞可选择性 的水解D-泛解酸内酯为D-泛醇，经分离和内酯化，可得到高纯度的D-泛 解酸内酯，未水解的L-泛解酸内酯可经消旋化再利用。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种微生物新菌株内生真菌HL-02及其在微生物 转化制备D-泛解酸内酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

内生真菌HL-2(PlectospHaereella cucumerina HL-2)，保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2010年12 月13日，保藏编号CCTCC M 2010348。

本发明内生真菌HL-02菌株筛选：

(1)菌种采集：在杭州师范大学实验室周边采集的垃圾堆边土、草 坪土，在杭州地区采集水稻田泥、菜地土，在宁波地区采集水稻田泥、菜 地土，以及储藏于本单位实验室的土样：南京紫金山淤泥、辽宁盘锦市淤 泥、西湖泥、武汉泥、成都古楠村泥土；本发明所述的内生真菌HL-02 从宁波水稻田泥土中筛选获得。

(2)菌种初筛：将0.04％溴甲酚紫乙醇溶液及10％D-泛解酸内酯水 溶液，用滤器过滤除菌后加入已灭菌的未凝固的SOC固体培养基中，制 备成终浓度为0.0025％溴甲酚紫及0.5％D-泛解酸内酯的SOC平板；取少 许土壤样品用无菌水稀释，取100μL土壤稀释液涂布于该平板上，隔水 式恒温培养箱中28℃培养1～7d，每天观察，取有黄色透明圈的菌落作复 筛；

(3)菌种复筛：将0.04％溴甲酚紫乙醇溶液及10％D-泛解酸内酯水 溶液，用滤器过滤除菌后加入已灭菌的未凝固的SOC固体培养基中，制 备成终浓度为0.0025％溴甲酚紫及0.5％D-泛解酸内酯的SOC平板，并以 只含有0.0025％溴甲酚紫的SOC平板作对照；将初筛培养基中出现黄色 透明圈的菌落分别接种于上述两份培养基中，隔水式恒温培养箱中28℃ 培养1～7d，每天观察，取在D-泛解酸内酯与溴甲酚紫培养基上出现黄色 透明圈，而溴甲酚紫培养基上未出现黄色透明圈的菌落作后续试验，初步 得到具有产泛解酸内酯水解酶的菌株；

本发明内生真菌HL-02活性菌株的培养：

取含SOC液体培养基100mL的摇瓶，挑一接种环的复筛有活性的产 泛解酸内酯水解酶的菌株接种于该摇瓶，28℃、160rpm摇床培养24h， 获得内生真菌HL-02活性菌株。

内生真菌HL-02活性菌株显微观察：将内生真菌HL-02活性菌体制 备玻片，滴上革兰氏染液I，革兰氏染色后置于显微镜观察。

SOC液体培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、 NaCl 0.5g/L、KCl 0.186g/L、MgCl₂ 0.95g/L、葡萄糖3.6g/L，溶剂为水， 用5mol/L NaOH溶液调pH至7.0。

SOC固体培养基是在SOC液体培养基的基础上加入1.5％琼脂粉/L。

内生真菌HL-2菌落特征和生理生化特性为：杆状，无鞭毛，革兰氏 阳性，在SOC固体培养基28℃培养2～3d后，菌落呈白色，有气生菌丝， 表面干燥。

内生真菌HL-02菌种ITS测序鉴定：提取该菌种的DNA，送上海生 工生物工程技术服务有限公司测定ITS序列，在NCBI基因库比对后确定 为内生真菌PlectospHaereella cucumerina，命名为内生真菌HL-02。

本发明所述的内生真菌HL-2保藏编号CCTCC M 2010348，其ITS 序列为：

cgtggggata gtacctgatc cgaggtcaac cttggtgccg ccgaagcgga cttgtggggg    60

gtttagaggc aggacgccga ggactcccaa tgcgaggcga atgctactgc gcaaaggaga    120

gggcccttcg ggtccgccac tggttttagg ggcctgccgt ggcagatccc caacgccggg    180

ccacaggggc tcgagggttg aaacgacgct cggacaggca tgcctcccag gatactggaa    240

ggcgccatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacatat    300

cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatgctg gagccaagag atccgttgtt aaaagttttg    360

acagttcgct aagaacactc agaagtatcg tcgggttcga aaacagagat tctgatgaga    420

ccggcgggca cccttgcggg cgccgccgaa gcaacaggta taatagttca caaagggtag    480

agagtgtagt actcagtaat gatccctccg ctgtcacccc accggagacc ttgttacg      538

可利用本发明所述的内生真菌HL-2生物法制备D-泛解酸内酯。

本发明具体的应用为：以DL-泛解酸内酯为底物，以内生真菌HL-2 发酵所得菌液或菌液制备的初酶液为酶源，20～45℃下，在含有氯化钙的 Tris-HCl缓冲溶液的反应体系中进行水解反应得水解液，取水解液用乙酸 乙酯进行酯化反应，反应液经后处理制得D-泛解酸内酯。

本发明所述的反应体系中DL-泛解酸内酯初始浓度优选为1～5g/L； 所述氯化钙的质量浓度优选为0.1～1g/L。

进一步，所述的酶源为内生真菌HL-2发酵得到的发酵液，加入的发 酵液中内生真菌HL-2的终浓度以细胞干重计为0.5～5g/L。

进一步，本发明所述的应用是将DL-泛解酸内酯、酶源，加入到含有 氯化钙的Tris-HCl缓冲溶液的反应体系中，并使反应体系中DL-泛解酸内 酯初始浓度为1～5g/L；所述氯化钙的质量浓度为0.1～1g/L，所述的酶源 为内生真菌HL-2发酵得到的发酵液，加入的发酵液中内生真菌HL-2的 终浓度以细胞干重计为以0.5～5g/L，在20～45℃下，进行水解反应得水解 液，取水解液用乙酸乙酯进行酯化反应，反应液经后处理制得D-泛解酸 内酯；所述内生真菌HL-2发酵得到的发酵液于已灭菌的离心管中，3000 g×5min离心后弃上清，加入50mmol/L CaCl₂，0.2mol/L Tris-HCl，pH 7.5 的混合液洗涤，洗去其中的培养基，3000g×5min离心后弃上清；再次 用50mmol/L CaCl₂，0.2mol/L Tris-HCl，pH 7.5的混合液洗涤，3000g× 5min离心后弃上清，获得酶源。

再进一步，本发明所述的水解反应时间优选为10～50h。

本发明所述的后处理为：将反应液离心，取上清液加入等体积乙酸乙 酯萃取，弃去上层有机相，下层水相中加入浓盐酸使HCl的终浓度为 100～300mmol/L，于60～95℃反应0.5～5h，反应结束后用等体积乙酸乙酯 再次萃取，取上层有机相旋蒸，制得D-泛解酸内酯。

本发明酶源来源于内生真菌HL-2发酵得到，具体按如下方法获得酶 源：

(1)斜面培养：将内生真菌HL-2接种至斜面培养基20～37℃培养1～7d 得到斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨10～20g/L、酵母 提取物5～10g/L、NaCl 0.5～2g/L、KCl 0.1～1g/L、MgCl₂ 0.5～5g/L、葡萄 糖2～10g/L，琼脂粉10～25g/L，溶剂为水，用5mol/L NaOH溶液调pH至 6.0～8.0；

(2)种子培养：将步骤(1)斜面培养的菌种接种至种子培养基，20～37 ℃，100～250r/min培养5～72h，得种子液；种子培养基终浓度组成为：胰 化蛋白胨10～20g/L、酵母提取物5～10g/L、NaCl 0.5～2g/L、KCl 0.1～1g/L、 MgCl₂ 0.5～5g/L、葡萄糖2～10g/L，溶剂为水，用5mol/L NaOH溶液调 pH至6.0～8.0；

(3)发酵培养：将步骤(2)经种子培养的种子液以体积比1∶50～100 的接种量接种至发酵培养基中，20～37℃、100～250r/min培养5～72h，得 发酵液；发酵培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨10～20g/L、酵母提取物 5～10g/L、NaCl 0.5～2g/L、KCl 0.1～1g/L、MgCl₂ 0.5～5g/L、葡萄糖2～10g/L， 溶剂为水，用5mol/L NaOH溶液调pH至6.0～8.0。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一株新 的可产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌种内生真菌HL-2，该菌种应用于 拆分DL-泛解酸内酯，立体选择性好，反应条件温和。

(四)附图说明

图1实施例1内生真菌HL-02菌种在含溴甲酚紫及D-泛解酸内酯培养基 中的菌落特征

图2实施例1内生真菌HL-02菌种在含溴甲酚紫培养基中的菌落特征

图3内生真菌HL-02革兰氏染色显微照片

图4D-泛解酸内酯标准品HPLC图

图5DL-泛解酸内酯标准品HPLC图

图6D-泛解酸内酯HPLC图

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

HPLC色谱条件：采用Varian prostar410液相色谱仪测定，柱型ADH θCE-MDθ72 DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD，流动相为：正己 烷∶异丙醇＝92∶8 流速1mL/min，检测波长215nm，温度35℃，每针进 样20min。

SOC液体培养基的配制：将胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl 0.5g 加入去离子水中搅拌至完全溶解，加250mmol/L KCl溶液10mL，用5mol/L NaOH溶液调pH至7.0，用去离子水定溶至1L，在15psi(1.05kg/cm²)高 压下蒸汽灭菌20min，加入5mL已灭菌的2mol/L MgCl₂，待培养基冷却 至60℃或60℃以下，加入1mol/L在15psi(1.05kg/cm²)条件下高压蒸汽灭 菌20min的葡萄糖溶液20mL。

SOC固体培养基的配制：在液体培养基的基础上加入1.5％琼脂粉/L。

斜面培养基终浓度组成：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 0.2g/L、MgCl₂ 1g/L、葡萄糖4g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为 水，用5mol/L NaOH溶液调pH至7.0；

种子培养基的终浓度组成：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 0.2g/L、MgCl₂ 1g/L、葡萄糖4g/L，溶剂为水，用5mol/L NaOH 溶液调pH至7.0；

发酵培养基的终浓度组成：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 0.2g/L、MgCl₂ 1g/L、葡萄糖4g/L，溶剂为水，用5mol/L NaOH 溶液调pH至7.0。

实施例1内生真菌HL-02菌种筛选

(1)菌种采集：在杭州师范大学实验室周边采集的垃圾堆边土、草 坪土，在杭州地区采集水稻田泥、菜地土，在宁波地区采集水稻田泥、菜 地土，以及储藏于本单位实验室的土样：南京紫金山淤泥、辽宁盘锦市淤 泥、西湖泥、武汉泥、成都古楠村泥土；本发明所述的内生真菌HL-02 从宁波水稻田泥中筛选获得。

(2)菌种初筛：将质量浓度为0.04％溴甲酚紫乙醇溶液及质量浓度 为10％D-泛解酸内酯水溶液，用滤器过滤除菌后加入已灭菌的未凝固的 SOC固体培养基中，制备成含终浓度为0.0025％溴甲酚紫及0.5％D-泛解 酸内酯的SOC平板；将上述步骤(1)采集的各种土壤样品各1g，分别 用10mL无菌水稀释，各取100μL土壤稀释液分别涂布于SOC平板上， 隔水式恒温培养箱(GNP-9080，上海精宏实验设备有限公司)中28℃培 养7d，每天观察，取有黄色透明圈的菌落作复筛；

(3)菌种复筛：将质量浓度为0.04％溴甲酚紫乙醇溶液及质量浓度 为10％D-泛解酸内酯水溶液，用滤器过滤除菌后加入已灭菌的未凝固的 SOC固体培养基中，制备成含终浓度为0.0025％溴甲酚紫及0.5％D-泛解 酸内酯的SOC平板，并以只含有0.0025％溴甲酚紫的SOC平板作对照； 将初筛培养基中出现黄色透明圈的菌落分别接种于上述两份培养基中，隔 水式恒温培养箱中28℃培养7d，每天观察，取在D-泛解酸内酯与溴甲酚 紫培养基上出现黄色透明圈，而在溴甲酚紫培养基上未出现黄色透明圈的 菌落作后续试验，初步得到具有产泛解酸内酯水解酶的活性菌株HL-02； 结果见图1、图2；

(4)内生真菌HL-02活性菌株的培养：

取含SOC液体培养基100mL的摇瓶，挑一接种环的复筛有活性的产 泛解酸内酯水解酶HL-02菌株接种于该摇瓶，28℃、160rpm摇床培养24h， 获得内生真菌HL-02活性菌株。

实施例2内生真菌HL-02菌种的显微观察

内生真菌HL-02活性菌株显微观察：将内生真菌HL-02活性菌体制 备玻片，革兰氏染色后置于显微镜观察。革兰氏染色显微照片显示为革兰 氏阳性菌，见图3。

实施例3内生真菌HL-02发酵液的制备

(1)斜面培养：将内生真菌HL-02接种至斜面培养基，28℃培养3d得 到斜面菌种；

(2)种子培养：将步骤(1)制备的斜面菌种接种至种子培养基，28℃， 160r/min培养24h，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)制备的种子液以体积比1∶100的接种量接 种至发酵培养基中，28℃、160r/min培养24h，得发酵液1L，发酵液中 菌体浓度为0.50g/L；

实施例4内生真菌HL-02发酵液的制备

(1)斜面培养：将内生真菌HL-02接种至斜面培养基，35℃培养2d得 到斜面菌种；

(2)种子培养：将步骤(1)制备的斜面菌种接种至种子培养基，35℃， 160r/min培养24h，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)制备的种子液以体积比1∶100的接种量接 种至发酵培养基中，35℃、160r/min培养24h，得发酵液1L，发酵液中 菌体浓度为0.87g/L；

实施例5内生真菌HL-02制备D-泛解酸内酯

溶液1：CaCl₂水溶液                          50mmol/L

     Tris-HCl缓冲液                   0.2mol/L  pH 7.5

溶液2：CaCl₂                          50mmol/L

     DL-泛解酸内酯乙醇溶液                   2g/L

     Tris-HCl缓冲液                    0.2mol/L pH 7.5

取20mL实施例3制备的发酵液(内生真菌HL-2的终浓度以细胞干 重计为以0.50g/L)于已灭菌的50mL离心管中，3000g×5min离心后弃 上清，加入10mL溶液1(CaCl₂ 50mmol/L，Tris-HCl 0.2mol/L，pH 7.5) 洗涤，洗去其中的培养基，3000g×5min离心后弃上清；再次用溶液1 洗涤，3000g×5min离心后弃上清；加入8mL溶液2(CaCl₂ 50mmol/L， DL-泛解酸内酯2g/L，Tris-HCl 0.2mol/L，pH 7.5)，28℃、160rpm摇床反 应24小时，制得反应液，将反应液4000g×5min离心，取上清液于新的 50mL离心管中，加入等体积无水乙酸乙酯萃取6次，弃去上层有机相， 向下层水相中加入2mL37％浓盐酸使浓盐酸终浓度为300mmol/L，于85 ℃反应60min，反应结束后加入等体积的无水乙酸乙酯萃取1次，取上层 有机相旋蒸，除去其中的乙酸乙酯，得到3.9mgD-泛解酸内酯，收率为 24.4％。

分别将产物D-泛解酸内酯、D-泛解酸内酯标准样和DL-泛解酸内酯 标准样(购自南京泽朗医药科技有限公司)进行高效液相色谱检测，检测 条件：用Varian prostar410液相色谱仪测定，柱型ADHθCE-MDθ72 DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD，流动相为：正己烷∶异丙醇＝92∶8 流速1mL/min，检测波长215nm，温度35℃，每针进样20min，结果 见图4：D-泛解酸内酯标准品HPLC图、图5：DL-泛解酸内酯标准品HPLC 图、图6：D-泛解酸内酯HPLC图。

实施例6内生真菌HL-02制备D-泛解酸内酯

溶液1：CaCl₂水溶液                        50mmol/L

     Tris-HCl缓冲液                 0.2mol/L  pH 7.5

溶液2：CaCl₂                        50mmol/L

     DL-泛解酸内酯乙醇溶液                 5g/L

     Tris-HCl缓冲液                  0.2mol/L pH 7.5

取20mL实施例3制备的发酵液(内生真菌HL-2的终浓度以细胞干重 计为以0.50g/L)于已灭菌的50mL离心管中，3000g×5min离心后弃上清， 加入10mL溶液1(CaCl₂ 50mmol/L，Tris-HCl 0.2mol/L，pH 7.5)洗涤，洗 去其中的培养基，3000g×5min离心后弃上清；再次用溶液1洗涤，3000g ×5min离心后弃上清；加入8mL溶液2(CaCl₂ 50mmol/L，DL-泛解酸内酯 5g/L，Tris-HCl 0.2mol/L，pH 7.5)，28℃、160rpm摇床反应24小时，制得 反应液，将反应液4000g×5min离心，取上清液于新的50mL离心管中， 加入等体积无水乙酸乙酯萃取6次，弃去上层有机相，向下层水相中加入 2mL37％浓盐酸使浓盐酸终浓度为300mmol/L，于85℃反应60min，反应 结束后加入等体积的无水乙酸乙酯萃取1次，取上层有机相旋蒸，除去其 中的乙酸乙酯，得到7.67mgD-泛解酸内酯，收率为19.2％。

实施例7内生真菌HL-02制备D-泛解酸内酯

溶液1：CaCl₂水溶液                          50mmol/L

     Tris-HCl缓冲液                   0.2mol/L pH 7.5

溶液2：CaCl₂                          50mmol/L

     DL-泛解酸内酯乙醇溶液                    5g/L

     Tris-HCl缓冲液                    0.2mol/L  pH 7.5

取20mL实施例4制备的发酵液(内生真菌HL-2的终浓度以细胞干重 计为以0.87g/L)于已灭菌的50mL离心管中，3000g×5min离心后弃上清， 加入10mL溶液1(CaCl₂ 50mmol/L，Tris-HCl 0.2mol/L，pH 7.5)洗涤，洗 去其中的培养基，3000g×5min离心后弃上清；再次用溶液1洗涤，3000g ×5min离心后弃上清；加入8mL溶液2(CaCl₂ 50mmol/L，DL-泛解酸内酯 5g/L，Tris-HCl 0.2mol/L，pH 7.5)，28℃、160rpm摇床反应24小时，制得 反应液，将反应液4000g×5min离心，取上清液于新的50mL离心管中， 加入等体积无水乙酸乙酯萃取6次，弃去上层有机相，向下层水相中加入 2mL37％浓盐酸使浓盐酸终浓度为300mmol/L，于85℃反应60min，反应 结束后加入等体积的无水乙酸乙酯萃取1次，取上层有机相旋蒸，除去其 中的乙酸乙酯，得到8.56mgD-泛解酸内酯，收率为21.4％。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州师范大学

 

<120>  内生真菌HL-02及其在制备D-泛解酸内酯中的应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  538

<212>  DNA

<213>  Plectosphaerella cucumerina

 

<400>  1

cgtggggata gtacctgatc cgaggtcaac cttggtgccg ccgaagcgga cttgtggggg     60

gtttagaggc aggacgccga ggactcccaa tgcgaggcga atgctactgc gcaaaggaga    120

gggcccttcg ggtccgccac tggttttagg ggcctgccgt ggcagatccc caacgccggg    180

ccacaggggc tcgagggttg aaacgacgct cggacaggca tgcctcccag gatactggaa    240 

ggcgccatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacatat    300

cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatgctg gagccaagag atccgttgtt aaaagttttg    360

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