酮泛解酸内酯还原酶的克隆表达及其在高效不对称合成D-泛解酸内酯中的应用

摘要

D-泛酸，俗称维生素B5，可以维持头发，血液和皮肤的健康，同时它可以作为辅酶A的前体。目前，主要以D-泛解酸内酯和β-丙氨酸为原料通过化学法合成D-泛酸。前体D-泛解酸内酯主要通过化学法合成和水解酶动力学拆分获得，但化学法步骤繁琐，污染环境，而水解酶拆分过程中需要化学外消旋化和酸化内酯化过程，增大了额外的生产成本。因此，开发全新的D-泛解酸内酯合成工艺具有非常大的意义。
　　本文以酿酒酵母基因组为模板，成功克隆出酮泛解酸内酯还原酶基因SceCPR1，并成功构建了SceCPR1与葡萄糖脱氢酶EsGDH偶联的辅酶循环再生系统，即“一菌双酶”体系，用于高效不对称还原酮泛解酸内酯获得D-泛解酸内酯;SceCPR1和EsGDH蛋白分子大小分别为35kDa和27kDa。通过诱导条件优化，最终单位湿菌体中SceCPR1和EsGDH的酶活分别为1179.2U/g和442.8U/g。
　　SceCPR1酶学性质表征发现，其最适的pH为5.5，温度45℃，并且酶在45℃下容易变性，但当添加5mM的NADPH可以保证其温度稳定性;其次，SceCPR1不属于金属离子依赖型还原酶，但是5mM的Fe3+以及大多数有机溶剂对酶活力有抑制作用;底物谱研究发现该酶对于酮泛解酸内酯具有最高的活力，而对于酮泛解酸以及D-或L-泛解酸内酯都无活力;在低底物浓度条件下，测定了SceCPR1的动力学参数，SceCPR1对酮泛解酸内酯和NADPH的Km值分别为0.164mM和0.029mM，反应的Vmax分别为131.03U/mg和137.81U/mg。
　　以BL21(DE3)/pACYCDuet1-SceCPR1/EsGDH的冻干细胞作为生物催化剂，优化全细胞催化条件，确定最适反应pH为5.5，温度35℃，生物催化剂添加量为0.03g/mL，辅底物葡萄糖与底物配比为1.5∶1.0，搅拌速度400rpm;通过对底物水解的研究，发现底物自发水解是影响产物得率的关键因素。因此，在最适催化条件下，将酮泛解酸内酯和葡萄糖溶解于pH2.5的溶液中，采用持续流加补料的方法，最终产物浓度达到475mM，得率95％，产物光学纯度e.e.p≥99.9％。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1．2 D-泛酸的合成

1．2 D-泛酸前体的合成

1．2．1 β-丙氨酸的酶法合成

1．2．2 酮泛解酸内酯的化学合成

1．2．3 D-泛解酸内酯的合成

1．3 酮泛解酸内酯还原酶

1．3．1 酮泛解酸内酯的简介

1．3．2 酮泛解酸内酯还原酶

1．3．3 酮泛解酸还原酶

1．4 本论文研究背景、内容及意义

1．4．1 研究背景与意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究目标

第二章 酮泛解酸内酯还原酶的克隆、表达与纯化

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种及质粒载体

2．2．2 试剂与材料

2．2．3 培养基与缓冲液

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 菌种的活化与种子液培养

2．3．2 引物设计

2．3．3 BL21(DE3)／pEASY Blunt E1-SceCPR1基因工程菌的构建

2．3．4 密码子优化并转化E．coli BL21(DE3)

2．3．5 BL21(DE3)／pACYCDuet 1-SceCPR1／EsGDH工程菌的构建

2．3．6 BL21(DE3)／pACYCDuet 1-SceCPR1／EsGDH诱导条件优化

2．3．7 SceCPR1目的蛋白的分离、纯化

2．4 结果与讨论

2．4．1 基因组的提取以及目的基因的扩增

2．4．2 阳性克隆子的筛选与测序鉴定

2．4．3 重组质粒pEASY Blunt E1-SceCPR1的表达

2．4．4 密码子优化、转化与阳性克隆子的诱导表达

2．4．5 质粒的双酶切与胶回收

2．4．6 pACYCDuet 1-SceCPR1／EsGDH重组质粒的构建与鉴定

2．4．7 pACYCDuet 1-SceCPR1／EsGDH转化BL21(DE3)及诱导表达

2．4．8 诱导温度的优化

2．4．9 诱导剂添加量的优化

2．4．10 诱导时长的优化

2．4．11 目的蛋白的分离和纯化

2．5 本章小结

第三章 酮泛解酸内酯还原酶的酶学性质研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 SceCPR1纯酶的获取

3．2．2 试剂与材料

3．2．3 缓冲液

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 蛋白质浓度标准曲线制作及目的蛋白浓度检测

3．3．2 标准酶活检测

3．3．3 pH对SceCPR1酶活的影响

3．3．6 金属离子以及EDTA对SceCPR1酶活的影响

3．3．9 SceCPR1酶的动力学常数

3．4 结果与讨论

3．4．1 蛋白质浓度标准曲线及目的蛋白浓度检测

3．4．3 温度对SceCPR1酶活的影响

3．4．4 SceCPR1酶的温度稳定性

3．4．5 金属离子以及EDTA对SceCPR1酶活的影响

3．4．6 有机溶剂对SceCPR1酶活的影响

3．4．7 SceCPR1酶的底物谱

3．4．8 SceCPR1酶的动力学常数

3．5 本章小结

第四章 全细胞高效不对称合成D-泛解酸内酯的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌种

4．2．2 试剂

4．2．3 培养基与缓冲液

4．2．4 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 工程菌的发酵培养

4．3．2 气相色谱方法及各物质标准曲线的制备

4．3．3 全细胞催化体系的条件优化

4．3．4 KPL和D-PL自发水解过程的监测

4．3．5 持续流加工艺的应用探究与优化

4．4 结果与讨论

4．4．1 冻干菌粉的除水率计算

4．4．2 各物质的气相色谱图及标准曲线绘制

4．4．3 全细胞催化体系的最适pH

4．4．4 全细胞催化体系的最适温度

4．4．5 全细胞催化体系的生物催化剂最适添加量

4．4．6 全细胞催化体系的最适辅酶添加量

4．4．7 全细胞催化体系的最适辅底物添加量

4．4．8 全细胞催化体系的最适转速

4．4．9 全细胞催化体系的最适底物浓度

4．4．10 KPL和D-PL自发水解过程的监测

4．4．11 持续流加补料工艺的建立对全细胞催化的影响

4．4．12 降低储液pH对持续流加补料工艺的影响

4．4．13 反应液中的产物的提纯与鉴定

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文