河流环境样品中微生物DNA的简易提取

摘要

一种河流环境样品中微生物DNA的简易提取。本发明方法将河流环境样品分为水样和底泥样品两部分，分别对其中的微生物DNA进行提取，同时该方法也可以作为其中任何一种环境样品的单独提取方法。利用液氮反复冻融法、SDS法、溶菌酶法等方法组合，能够使环境样品中微生物细胞充分裂解，DNA完全释放，经PCR-DGGE技术进行细菌多样性分析后表明，该提取方法能够有效地反映河流环境样品中微生物的完整性和多样性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种河流环境样品中微生物DNA的简易提取，该方法借助生物技术手段， 对环境样品进行处理，属于环境科学与生物工程技术领域。

背景技术

环境样品是一种十分复杂的体系，一般由多种生物组成且化学成分复杂，如河流底泥 是由细菌等微生物和原生动物、后生动物等微型动物组成的生态系统与胶体物质结合所形 成的絮状体颗粒。因此，环境样品具有菌群结构多样、菌群功能复杂、可能含有腐殖酸、 有机物、重金属等DNA杂交和PCR扩增抑制剂等特点。以往提取的河流底泥DNA中含 有较多腐殖酸等杂质，杂质会严重影响后续的分子生物学实验操作，同时针对河流底泥细 菌群落多样性的研究也鲜有报道。另外，目前商业化的底泥DNA提取试剂盒其效果仍不 理想，难以满足各种分子生物学实验操作的需求。因此，建立简便、有效的底泥DNA提 取方法势在必行。

在河流底泥DNA提取过程中发现，底泥中的悬浮物、胶体物质、硫化物、腐殖质等 对溶菌酶、蛋白酶K和Taq酶的活性有抑制作用，导致提取的DNA量少，纯度不够，不 能准确地反应底泥中微生物的多样性和种群丰度。若抑制物含量高则会影响PCR反应的 效果，导致PCR产量低甚至扩增失败，成为后续变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、单链 构象多态性(SSCP)技术等分子操作的限速步骤。Stach等比较了4种纯化土壤微生物总 DNA粗提液的方法结果表明，DNA纯度是影响PCR成功的关键，同时采用的DNA提 取方法能否使环境微生物细胞完全裂解和DNA充分释放则是影响环境微生物多样性检 测结果的关键因素。

发明内容

本发明的目的是解决现有河流环境样品中微生物DNA提取步骤繁多、操作时间长、 所用试剂价格昂贵，以及提取的DNA量少、纯度不够，不能准确地反应河流环境样品中 微生物的多样性和种群丰度等问题，而提供的一种河流环境样品中微生物DNA的简易提 取方法。该方法可将大量腐殖酸和蛋白质去除，所得环境样品微生物的DNA可直接用于 PCR等分子操作，并利用PCR-DGGE技术进行细菌多样性分析，表明该方法能够有效地反 映河流环境样品中细菌多样性和种群丰度等问题。

本发明提供的河流环境样品中微生物DNA的简易提取方法，是将河流环境样品分为 水样和底泥样品两部分，分别对其进行微生物DNA的提取，同时该方法也可以作为其中 任何一种环境样品的单独提取方法，具体步骤是：

第1、河流环境样品中微生物细胞裂解

第1.1、河流水样中微生物细胞裂解

第1.1.1、河流水样的富集处理

取2L水样经0.22um灭菌膜过滤后，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中， 加入2mL无菌水，漩涡震荡5分钟，8000rpm离心10分钟，得到富集的上清液；

第1.1.2、河流水样中微生物细胞裂解

量取2mL第1.1.1、步处理后的水样于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction  Buffer，DNA Extraction Buffer包括100mmol Tris-HCl、100mmol Na₂EDTA、1.5mol NaCl 和质量浓度为1％的PVP30000。同时向10mL离心管中加入0.5mL 50mg/mL的溶菌酶， 漩涡震荡直至混匀；37℃水浴2h，加入1m质量浓度为20％的SDS，65℃水浴30分钟， 中间轻轻摇晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟，取上清；

第1.2、底泥样品中微生物细胞裂解

第1.2.1、称取1g底泥于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，涡 震荡10分钟，加入1mL质量浓度为20％的SDS，漩涡充分；将离心管置于液氮中30s， 再置于65℃水浴20分钟；重复此操作1-2次，取出样品，8000rpm离心15分钟；将上清 液转移置另一10mL无菌离心管中，待用；

第1.2.2、向第1.2.1步的沉淀物中加入2mL DNA Extraction Buffer和0.5ml 50mg/mL 的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀；37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20％的SDS，65℃水 浴30分钟，中间轻轻摇晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟，将上清液与第1.2.1、步的 上清液混合；

第2、粗DNA溶液的获得

向第1、步得到的河流水样和底泥样品的微生物细胞裂解上清液中，分别加入等体积 的苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1的混合液，上下颠倒抽提；12000rpm离心10分钟，取上 清；用氯仿∶异戊醇＝24∶1的混合液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，取上清液；

第3、微生物DNA的获得

向第2、步抽提后的上清液中分别加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇， -20℃放置1h；12000rpm离心20分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干， 用50μL TE溶解即环境样品微生物DNA，TE溶液包括pH 8.0的10mmol/L Tris-HCl和 pH 8.0的1mmol/L EDTA。

本发明的优点和积极效果：

本发明所述的方法是利用液氮反复冻融法、SDS法、溶菌酶法等方法组合，能够使 河流环境样品中细菌细胞充分裂解并使DNA完全释放，经PCR-DGGE技术进行细菌多 样性分析后表明，该方法能够有效的反映河流环境样品中微生物的完整性和多样性。通过 异丙醇等有机溶剂沉淀后，用紫外分光光度计测定OD260/OD230为1.35、OD260/OD280 值为1.65(注：OD260/OD230＞2.0时，腐殖酸和有机酸含量极低；OD260/OD280＞1.7 时蛋白质含量极低)，可直接应用于分子操作，具有很强的实用性。

附图说明

图1、提取环境样品中微生物DNA的电泳图谱；

第1泳道：天津海河水样中微生物DNA

第2泳道：天津海河底泥样品中微生物DNA

第3泳道：辽宁浑河水样中微生物DNA

第4泳道：辽宁浑河底泥样品中微生物DNA

第5泳道：天津地区土壤中微生物DNA

第6泳道：Marker：λ-Hind III DNA

图2、提取河流环境中微生物DNA扩增16S rDNA电泳图谱；

第1泳道：Marker：DL 2000

第2泳道：天津海河水样中微生物DNA

第3泳道：天津海河底泥样品中微生物DNA

第4泳道：辽宁浑河水样中微生物DNA

第5泳道：辽宁浑河底泥样品中微生物DNA

第6泳道：天津地区土壤中微生物DNA

第7泳道：阴性对照

图3、提取环境样品中微生物DNA PCR-DGGE电泳图谱；

第1、2泳道：天津海河水样中微生物DNA

第3、4泳道：天津地区土壤中微生物DNA

第5、6泳道：天津海河底泥样品中微生物DNA

第7、8泳道：辽宁浑河底泥样品中微生物DNA

第9、10泳道：辽宁浑河水样中微生物DNA

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的应用范围并不仅限于此， 对于普通土壤、活性污泥、湖泊沉积物、池塘底泥及各种水样等微生物的DNA都有较好 的提取效率。

实施例1：天津海河环境样品中微生物DNA的提取

1、底泥样品中微生物DNA的提取

(1)底泥样品中微生物细胞裂解：

称取1g底泥于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，漩涡震荡10 分钟，加入1mL质量浓度为20％的SDS，漩涡充分。将离心管置于液氮中30s后，再置 于65℃水浴20分钟；重复此操作1-2次。取出样品，8000rpm离心15分钟。将上清液转 移置另一10mL无菌离心管中，待用。

向沉淀物中加入2mL DNA Extraction Buffer和0.5ml 50mg/mL的溶菌酶，漩涡震荡直 至混匀。37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20％的SDS，65℃水浴30分钟，中间轻轻摇 晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟。将以上两步得到的上清液混合。

(2)粗DNA溶液的获得：

向(1)步获得的上清液中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，上下颠 倒抽提。12000rpm离心10分钟，取上清。用氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次，12000rpm 离心10分钟，吸取上清。

(3)底泥样品中微生物DNA的获得：

向(2)步抽提后的上清液中加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，-20℃ 放置1h。12000rpm离心20分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干，用 TE溶解即底泥样品中微生物DNA。

2、水样中DNA的提取

取2L水样经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加 入2mL无菌水，漩涡震荡5分钟，8000rpm离心10分钟，得到富集的上清液。

(1)水样中微生物细胞裂解：

量取2mL处理后的水样于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer和 0.5mL 50mg/mL的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀。37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20％ 的SDS，65℃水浴30分钟，中间轻轻摇晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟，取上清。

(2)粗DNA溶液的获得：

向(1)步获得的上清液中分别加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，上下 颠倒抽提。12000rpm离心10分钟，取上清。用氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次。12000rpm 离心10分钟，取上清。

(3)水样中微生物DNA的获得：

向(2)步抽提后的上清液中加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，-20℃ 放置1h。12000rpm离心20分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干，用 50μL TE溶解即水样中微生物DNA。

利用实施实例1所述方法提取来自天津海河环境样品中微生物的DNA，用紫外分光 光度计测定提取DNA的OD260/OD230、OD260/OD280值，结果见表1。表1结果显示 用发明内容中所述方法提取的天津海河水样、底泥样品中微生物DNA的OD260/OD230 都接近1.35，说明提取的DNA溶液中腐殖酸类含量较低；OD260/OD280值接近于1.65， 表明提取的DNA溶液中蛋白质含量较低。因此，本发明适合提取天津海河环境样品中的 微生物DNA。

表1提取天津海河环境样品中微生物DNA纯度检测

实施例2：不同河流环境样品中微生物DNA的提取

1、辽宁浑河底泥样品中微生物DNA的提取

(1)底泥样品中微生物细胞裂解：

称取1g底泥于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，漩涡震荡10 分钟，加入1mL质量浓度为20％的SDS，漩涡充分。将离心管置于液氮中30s，再置于 65℃水浴20分钟，重复此操作1-2次。取出样品，8000rpm离心15分钟。将上清液转移 置另一10mL无菌离心管中，待用。向沉淀物中加入2mL DNA Extraction Buffer和0.5ml 50mg/mL的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀。37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20％的SDS， 65℃水浴30分钟，中间轻轻摇晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟。将上清液与之前上 清液混合。

(2)粗DNA溶液的获得：

将(1)中的上清液混匀，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，上下颠倒 20次抽提。12000rpm离心10分钟，取上清。用氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次。

(3)底泥样品中微生物DNA的获得：

在(2)中抽提后的上清液中加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，-20℃ 放置1h。12000rpm离心20分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干，用 50μL TE溶解即微生物DNA。

2、辽宁浑河水样中DNA的提取

取2L水样经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加 入2mL无菌水，漩涡震荡5分钟，8000rpm离心10分钟，得到富集的上清液。

(1)水样中微生物细胞裂解：

量取2ml处理后水样于10mL无菌离心管中，加入2ml DNA extraction buffer和0.5ml 50mg/ml的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀。37℃水浴2h，加入1ml质量浓度为20％的SDS， 65℃水浴30分钟，中间轻轻摇晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟。将上清液与之前上 清液混合。

(2)粗DNA溶液的获得：

将(1)中的上清液混匀，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，上下颠倒 20次抽提。12000rpm离心10分钟，取上清。用氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次。

(3)水样中微生物DNA的获得：

在(2)中抽提后的上清液中加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，-20℃ 放置1h。12000rpm离心20分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干，用 50μL TE溶解即微生物DNA。

利用实施实例1所述方法提取来自辽宁浑河环境样品中微生物的DNA。用紫外分光 光度计对提取的微生物DNA进行测定OD260/OD230、OD260/OD280值，结果见表2。 表2结果显示用发明内容中所述方法提取来自不同河流环境样品的微生物DNA的 OD260/OD230都接近1.35，说明提取的DNA溶液中腐殖酸类含量较低；OD260/OD280 值接近于1.65，表明提取的DNA溶液中蛋白质含量较低。因此，本发明适合提取不同河 流环境样品中的微生物DNA。

表2提取辽宁浑河环境样品中微生物DNA纯度检测

实施例3：其他类型的微生物DNA的提取

(1)天津地区土壤微生物细胞裂解：

称取1g土壤于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，漩涡震荡10 分钟，加入1mL质量浓度为20％的SDS，漩涡充分。将离心管置于液氮中30s，再置于 65℃水浴20分钟，重复此操作1-2次。取出样品，8000rpm离心15分钟。将上清液转移 置另一10mL无菌离心管中，待用。向沉淀物中加入2mL DNA Extraction Buffer和0.5ml 50mg/mL的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀。37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20％的SDS， 65℃水浴30分钟，中间轻轻摇晃离心管2-3次，8000rpm离心15分钟。将上清液与之前上 清液混合。

(2)粗DNA溶液的获得：

将(1)中的上清液混匀，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，上下颠倒 20次抽提。12000rpm离心10分钟，取上清。用氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次。

(3)土壤中微生物DNA的获得：

在(2)中抽提后的上清液中加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，-20℃ 放置1h。12000rpm离心20分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干，用 50μL TE溶解即微生物DNA。

利用实施实例1所述的方法提取底泥的方法来提取天津地区土壤中微生物DNA。用 紫外分光光度计测定提取的DNA OD260/OD230、OD260/OD280值，结果见表3。表3 结果显示用发明内容中所述方法提取的土壤DNA的OD260/OD230都接近1.35，说明提 取的DNA溶液中腐殖酸类含量较低；OD260/OD280值接近于1.70，表明提取的DNA溶 液中蛋白质含量较低。因此，本发明也适合提取土壤微生物DNA。

表3提取天津地区土壤微生物DNA纯度检测

实施例4：PCR扩增检验

将实施实例1、2和3中提取所得的DNA溶液分别进行PCR验证。

(1)PCR反应引物

(2)PCR反应程序

(3)PCR反应体系

结果显示，本发明方法所提取得到的DNA经PCR引物扩增后，分别得到与目的片段 大小完全一致的DNA条带(见图2)。将目的片段连接T载体后测序，进行BLAST比对， 证实所得目的条带正确，说明本方法所提取的DNA可直接应用于分子操作。

实施例5：PCR-DGGE扩增检验

PCR扩增采用的是巢式两步反应，对象为16S rDNA。巢式反应是先将大片段DNA 扩增出来，提高包含目的DNA的大片段基因的浓度，再对大片段基因产物进行二次扩增， 获得一次反应达不到的高含量目的DNA。

(1)巢式PCR反应引物

(注：引物P338F需在其5’末端加上GC链，GC链结构为

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。)

(2)巢式PCR反应程序

第一步：降落PCR的反应程序

第二步：普通PCR的反应程序

(3)巢式PCR反应体系

(注：第二步反应的DNA模板是由第一步PCR产物适当稀释而来。)

结果表明，根据PCR-DGGE能分离长度相同而序列不同DNA的原理，每一个条带大 致与一个细菌种类相对应，条带数越多说明生物多样性越丰富，条带染色后的荧光强度则反 映该种细菌的丰富度，条带信号越亮，密度越高，表示该菌种的数量越多。本方法能够检测出 20多条条带，说明该方法能够客观地反应环境样品中细菌群落结构的差异性和生物多样 性。