一种基于固相介质表面电荷的反转提取DNA的方法

摘要

本发明的一种基于固相介质表面电荷的反转提取DNA的方法属于生物技术的技术领域。提取DNA有如下步骤：将吸附了表面修饰有胺基和羧基的固相介质和含DNA样品的溶液混合，在Na+离子强度在0.001～0.25mmol/mL范围pH值在3～5.5下将混合溶液静置10～15分钟以完成DNA分子在固相介质表面的吸附，离心分离；再将分离出来的吸附了DNA的金固相介质分散在高纯水中，在pH至8.0～11.0间，将混合溶液静置10～15分钟以完成DNA分子与金粒子之间的静电脱附，离心分离出固相介质。本发明的优点在于对DNA具有高的吸附效率和脱附效率，总提取效率高于90％；操作快速便捷。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及一种基于固相介质表面电荷的反 转实现在生物样品中高效提取DNA的方法。

技术背景

DNA提取是DNA分析的基础和前提，随着DNA分析技术在分子生物学研 究、临床疾病诊断、进出口检验检疫、法医学检验、血液质量控制等领域基础与 应用研究的逐渐深入，DNA提取效率不足特别是短片段DNA提取效率较低已经 成为DNA分析技术应用推广的一个制约因素。

目前，基于SiO₂，聚合物球等固体介质的固相提取法是DNA提取技术中的 常用方法，该方法具有操作简便，无毒无害，对生物样品破坏性小等特点。该方 法的原理是利用固体表面和DNA分子间通过盐桥建立的的静电相互作用实现 DNA在介质表面的吸附和脱附。以常用的表面带有羟基的SiO₂为例，表面羟基 部分解离使SiO₂表面带负电，DNA分子链上的磷酸根解离使DNA分子也带负 电。在高盐浓度下，借助盐桥，DNA分子可以在SiO₂表面发生吸附作用，而当 盐浓度降低后，盐桥作用被破坏，被吸附的DNA由于静电斥力从SiO₂表面脱附。 由于通过盐桥诱导产生的SiO₂粒子表面和DNA磷酸根之间发生的是较弱的间接 静电相互作用，因此DNA的吸附效率较低。如果SiO₂粒子表面经过化学修饰后 带有正电荷，这时DNA磷酸根可以通过较强的直接静电相互作用被吸附在粒子 表面，吸附效率显著地提高，然而此时DNA的脱附会变得非常困难，DNA的提 取效率仍得不到明显改善。另一方面，由于SiO₂粒子表面硅羟基通常不能完全 解离，粒子表面所带的负电荷密度较低，对DNA磷酸根的静电斥力较弱，另外， DNA分子和SiO₂表面的氢键作用和脱水作用也是导致DNA脱附效率降低不可 忽略的因素，因此常规方法中在低盐浓度下DNA的脱附效率通常只能达到70％ 左右。综合看，依靠盐桥的SiO₂提取方法通常的提取效率在60％左右。

由于DNA分子链上的磷酸根基团的解离，DNA链在较宽的酸碱范围内都显 现负电性。因此，我们可以通过对固相介质进行表面修饰，使介质的表面具有随 溶液pH改变而发生表面电荷反转的性质。在吸附DNA环境下介质表面带正电， 提高吸附效率，在脱附环境下介质表面电荷发生反转为负电性，提高脱附效率， 从而达到提高DNA的提取效率的目的。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于固相介质表面电荷的反转实现在生物样品 中高效提取DNA的方法，可将DNA的提取效率提高到90％以上，以克服现有 提取技术提取效率偏低的缺陷。

本发明的方法包括以下步骤：

(1)将具有表面电荷反转能力的固相介质和含DNA样品的溶液混合，固 相介质与DNA样品的质量比在0.039～0.041范围，用NaCl溶液调节混合溶液 的Na⁺离子强度在0.001～0.25M范围，调节混合溶液pH在3.0～5.5间，将混 合溶液静置10～15分钟以完成DNA分子与固相介质之间的静电吸附；采用离 心的分离方式，将吸附了DNA的固相介质和溶液分离；所述的具有表面电荷反 转能力的固相介质，是表面修饰了羧基和胺基的金纳米粒子或表面修饰了羧基和 胺基的硅氧化物基的固相介质；

(2)将分离出来的吸附了DNA的固相介质分散在高纯水中，浓度在1～100 mg/ml间，调节溶液pH至8.0～11.0间，将混合溶液静置10～15分钟以完成 DNA分子与固相介质之间的静电脱附；采用离心的分离方式，将固相介质和DNA 溶液分离，获得提取后DNA溶液。

本发明步骤(1)中所述的具有表面电荷反转能力的固相介质，指的是通过 表面修饰后使固相介质其表面电荷能够随溶液pH值变化发生正负电荷间的反 转。具体包括，表面修饰了羧基和胺基的金纳米粒子或表面修饰了羧基和胺基的 硅氧化物基的固相介质。

所述的硅氧化物基的固相介质，有玻璃珠、无定形氧化硅微粒、介孔氧化硅 微粒、无定形氧化硅包覆磁性微粒或介孔氧化硅包覆磁性微粒。

本发明步骤(1)中所述的固相介质的结构和粒度具体的是，金纳米粒子(尺 寸范围在12nm～25nm间)，玻璃珠(尺寸在毫米区间)，无定形氧化硅微粒(形 状为球形或无定形，尺寸范围在50μm～100nm)，介孔氧化硅微粒(尺寸范围 在50μm～100nm)，无定形氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范围在50μm～100 nm，磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe₂O₃，Fe₃O₄或其混合物)，介孔氧化硅包覆磁 性微粒(尺寸范围在50μm～100nm，磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe₂O₃，Fe₃O₄ 或其混合物)

对不同固相介质的表面修饰过程可以按现有技术进行，也可以按如下的方法 进行。

金纳米粒子的表面修饰：

首先，将通过柠檬酸钠还原氯金酸制备的金纳米粒子离心分离，用高纯水清 洗以除去溶液中残留的柠檬酸根配体，然后将其分散在浓度为1×10^-7M～ 1×10^-4M的巯基己酸水溶液中，使每毫升巯基溶液中含有0.05mg的金纳米粒子。 用1M NaOH溶液将溶液的pH值调至11.0，磁力搅拌12小时后离心分离金纳 米粒子，用高纯水清洗除去没有反应的巯基己酸，得到表面修饰了巯基己酸的金 纳米粒子。其次，将制得的表面修饰了巯基己酸的金纳米粒子分散在巯基十一酸 和巯基十一胺混合的水溶液中，巯基十一酸和巯基十一胺的摩尔比为可在 1∶1～10之间。用1M HCl调节溶液pH值到3，磁力搅拌18小时后离心分离 出金纳米粒子，用高纯水清洗两次除去没有反应的巯基试剂，得到表面修饰了不 同比例羧基和胺基的金纳米粒子。

硅氧化物基的固相介质的表面修饰：

首先，将表面为硅氧化物的固相介质分散在水/乙醇混合溶液中(水/乙醇体积 比为30∶1)，使每毫升混合溶液中含有10mg的硅氧化物基的固相介质。其次， 按一定摩尔比加入胺基硅烷和羧基硅烷，羧基硅烷和胺基硅烷的摩尔比可在 1∶1～10之间。磁力搅拌1小时后，将溶液加热至80C，保持24小时，离心 分离出固相介质，用高纯水清洗两次除去没有反应的硅烷试剂，得到表面修饰了 不同比例羧基和胺基的硅氧化物基固相介质。

按照以上描述的表面修饰方法，依据胺基修饰物和羧基修饰物的比例，可获 得表面羧基与胺基摩尔比例在1∶1～10范围的固相提取介质，均具有一定的表 面电荷反转能力。依据DNA提取效率的实验，优选表面的羧基与胺基比为2∶3 的固相介质用于DNA提取，效果更好。

本发明的优点在于

1对DNA同时具有高的吸附效率和脱附效率，总提取效率高于90％。

2操作快速便捷，与现有的固相提取法操作步骤基本相同。

具体实施方式

借助以下实施例对本发明做进一步描述，应理解，以下实施例是示范性的， 而不是限制性的，可根据上述发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方 法。

本发明中所述的DNA吸附量，是每毫克(mg)金纳米粒子所吸附的DNA 分子的质量(单位为微克μg)。本发明中所述的脱附效率为洗脱到溶液中的DNA 的质量同金纳米粒子吸附的DNA的质量的比值。

实施例1

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为3.0，用NaCl溶液调节溶液中Na⁺离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下 静置15分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前 后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为39.20μg/mg。

将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为11.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离 出金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率 为100％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为39.20μg/mg。

实施例2

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为3.0，用NaCl溶液调节溶液中Na⁺离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下 静置10分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前 后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为39.20μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离出 金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率为 93.1％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为36.49μg/mg。

实施例3

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为3.0，用8M NaCl溶液调节溶液离子强度为0.25M，混匀后室温下静置 10分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前后 DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为42.00μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为11.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离 出金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率 为100％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为42.00μg/mg。

实施例4

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为3.0，用8M NaCl溶液调节溶液离子强度为0.25M，混匀后室温下静置 10分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前后 DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为42.00μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离出 金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率为 93.1％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为39.10μg/mg。

实施例5

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为5.5，用8M NaCl溶液调节溶液离子强度为0.25M，混匀后室温下静置 10分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前后 DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为38.81μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为11.0，混匀后室温下静置15分钟。用5000rpm离心分离 出金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率 为100％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为38.81μg/mg。

实施例6

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为5.5，用8M NaCl溶液调节溶液离子强度为0.25M，混匀后室温下静置 15分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前后 DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为38.81μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离出 金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率为 93.1％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为36.13μg/mg。

实施例7

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm 离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸 光度值，可知对DNA吸附量为36.42μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为11.0，混匀后室温下静置15分钟。用5000rpm离心分离 出金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率 为100％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为36.42μg/mg。

实施例8

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的金纳米粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm 离心分离出吸附了DNA的金纳米粒子。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸 光度值，可知对DNA吸附量为36.42μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的金纳米粒子分散在高纯水中，用1M NaOH 调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离出 金纳米粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率为 93.1％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为33.75μg/mg。

实施例9

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的玻璃珠分散溶液中。用1M HCl调节溶液的 pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm 离心分离出吸附了DNA的玻璃珠。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度 值，可知对DNA吸附量为37.42μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的玻璃珠分散在高纯水中，用1M NaOH调 节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心分离出玻 璃珠。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA脱附效率为94.2％。 综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为35.24μg/mg。

实施例10

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的200nm无定形氧化硅粒子溶液中。用1M HCl调节溶液的pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下静置10 分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的无定形氧化硅粒子。对比吸附前 后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为36.42μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的无定形氧化硅粒子分散在高纯水中，用1M NaOH调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心 分离出无定形氧化硅粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA 脱附效率为93.1％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为33.90 μg/mg。

实施例11

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的200nm介孔氧化硅粒子溶液中。用1M HCl 调节溶液的pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下静置10分钟。 用5000rpm离心分离出吸附了DNA的介孔氧化硅粒子。对比吸附前后DNA溶 液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为37.25μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的介孔氧化硅粒子分散在高纯水中，用1M NaOH调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000rpm离心 分离出介孔氧化硅粒子。对比脱附前后溶液在260nm的吸光度值，可知DNA 脱附效率为95.2％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取量为35.46 μg/mg。

实施例12

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的200nm无定形氧化硅包覆磁性微粒溶液中。 用1M HCl调节溶液的pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下 静置10分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的无定形氧化硅包覆磁性微 粒。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为36.42 μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的无定形氧化硅包覆磁性微粒分散在高纯水 中，用1M NaOH调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000 rpm离心分离出无定形氧化硅包覆磁性微粒。对比脱附前后溶液在260nm的吸 光度值，可知DNA脱附效率为94.6％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提 取量为34.45μg/mg。

实施例13

将10μl，200μg/ml的鲑鱼精DNA水溶液加入到1ml，浓度为0.05mg/ml 的表面羧基与胺基摩尔比为2∶3的200nm介孔氧化硅包覆磁性微粒溶液中。 用1M HCl调节溶液的pH值为5.5，溶液离子强度为1×10^-3M，混匀后室温下 静置10分钟。用5000rpm离心分离出吸附了DNA的介孔氧化硅包覆磁性微粒。 对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附量为38.52 μg/mg。

后将离心分离出的吸附了DNA的介孔氧化硅包覆磁性微粒分散在高纯水 中，用1M NaOH调节溶液的pH值为8.0，混匀后室温下静置10分钟。用5000 rpm离心分离出介孔氧化硅包覆磁性微粒。对比脱附前后溶液在260nm的吸光 度值，可知DNA脱附效率为96.4％。综合吸附脱附效率可知在此条件下的提取 量为37.13μg/mg。