预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液及其制备方法

摘要

本发明涉及一种动物预防医药领域，具体为一种预防动物疫病发生的注射液的制备方法，所述预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎由蜂胶水溶液、接种鸭肝炎病毒并感染死亡的鸭胚匀浆组织和灭活液组成，其制备方法为在鸭胚匀浆组织蜂胶混合液加入灭活液，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液；用本发明所述制备方法制成的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液对于预防鸭病毒性肝炎具有显著效果，保护率提高到90-100％，保护期延长到6-12个月，产生作用时间缩短到5天，仅需一次注射即可达到预期效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物预防医药领域，具体为一种预防动物疫病发生的注射液的制备方法。

背景技术

Ⅰ型鸭病毒性肝炎（以下简称：鸭病毒性肝炎）是由病毒引起的急烈性传染病，涉及面广、发病率高，死亡率有时在 90 ％以上，给饲养单位或个人带来极大的经济损失，同时，由于对病亡的鸭处理不当，往往造成病毒的漫延，产生更大的恶果。目前预防鸭病毒性肝炎主要疫苗存在的问题是免疫期短(一般为 3 个月左右)、使用次数多、产生作用的时间长(14天)，保护率低(50-80%)等问题，因此，给家禽饲养业带来的危害深重，且造成经济损失。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种预防鸭病毒性肝炎的注射液，该注射液对鸭病毒性肝炎具有较好的预防效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液，所述预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎由蜂胶水溶液、接种鸭肝炎病毒并感染死亡的鸭胚匀浆组织和灭活液组成鸭胚匀浆组织和灭活液组成，所述蜂胶水溶液、鸭胚匀浆组织的重量比为8-9：1-2，所述蜂胶水溶液为体积分数为0.1-2%；所述灭活剂为青霉素、链霉素和福尔马林液，预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液中每毫升含有2000单位的青霉素和2000单位的链霉素，所述福尔马林在预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液中体积分数为0.4％。

本发明的目的之二在于提供一种预防鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液的制备方法，该方法操作简单，适用于大规模生产。

所述的预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液的制备方法，具体包括以下步骤：a将接种鸭肝炎种毒并感染死亡后鸭胚制成鸭胚匀浆组织，与蜂胶及水介质混合均匀，得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，所述鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中蜂胶与水介质组成体积浓度为0.1-2%的蜂胶水溶液，所述蜂胶水溶液与鸭胚匀浆组织的体积比为8-9:1-2。

b在步骤a所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

所述的预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液的制备方法，所述鸭肝炎种毒具体为：

a 在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏，放入组织捣碎机中捣碎； 

b取占总量为10-20％的被捣碎的鸭组织与占总重量为80-90％的浓度为0.8 % 的生理盐水混合，形成混合组织悬液； 

c 将混合组织悬液放入离心机中，在离心20-40 分钟后取其上清液； 

d在其上清液中，按每毫升上清液各加入2000 单位青霉素和2000单位链霉素的配比加入青霉素和链霉素，得鸭肝炎种毒。

所述的预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液的制备方法，步骤a中所述死亡的鸭内脏为心、肝、脾、肺和脑中任一种或多种。

所述的预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液的制备方法，所述鸭肝炎种毒接种于9-12日龄的鸭胚尿囊中的剂量为0.1mL。

用本发明所述制备方法制成的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液对于预防鸭病毒性肝炎具有显著效果，保护率提高到90-100％，保护期延长到6-12个月，产生作用时间缩短到5天，仅需一次注射即可达到预期效果。

 

具体实施方式

实施例 1

在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的10％的被捣碎的鸭组织，占总重量的90％浓度为0.8 ％的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在 4000 转／分条件下离心 20 分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000 单位青霉素和 2000 单位链霉素后即形成鸭病毒性肝炎种毒。将鸭病毒性肝炎种毒放入浓度为0.8％的生理盐水中体积稀释 l00倍，形成鸭病毒性肝炎种毒稀释液，用0.1 毫升剂量的鸭病毒性肝炎稀释液接种于9日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在48小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚，放入组织捣碎机中捣碎，得鸭匀浆组织，以重量份计取10份的鸭匀浆组织与90份的蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到0.1％，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在4000 转／分条件下离心20分钟后，取其上清液，即鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

实施例 2 

在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15％的被捣碎的鸭组织，占总重量的85％浓度为0.8％的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在 4000 转／分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000 单位青霉素和 2000 单位链霉素后即形成鸭病毒性肝炎种毒。将鸭病毒性肝炎种毒放入浓度为0.8 ％的生理盐水中体积稀释100倍，形成鸭病毒性肝炎种毒稀释液，用0.1 毫升剂量的鸭病毒性肝炎稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭匀浆组织，以重量份计取15份的鸭匀浆组织与85份得蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到2%，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在 4000 转／分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

实施例 3 

在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的20％的被捣碎的鸭组织，占总重量的80％浓度为 0.8 ％的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4000 转／分条件下离心20分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000 单位青霉素和2000 单位链霉素后即形成鸭病毒性肝炎种毒。将鸭病毒性肝炎种毒放入浓度为0. 8％的生理盐水中体积稀释100 倍，形成鸭病毒性肝炎种毒稀释液，用0.1 毫升剂量的鸭病毒性肝炎稀释液接种于12日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在48小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭匀浆组织，以重量份计取20份的鸭匀浆组织与80份蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到1%，形成混合组织悬液，并其放入离心机中，在4000 转／分条件下离心40分钟后，取其上清液，即鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

实施例4

在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15％的被捣碎的鸭组织，占总重量的85％浓度为0.8％的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在 4000转／分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000 单位青霉素和 2000 单位链霉素后即形成鸭病毒性肝炎种毒。将鸭病毒性肝炎种毒放入浓度为0.8 ％的生理盐水中稀释100倍，形成鸭病毒性肝炎种毒稀释液，用0.1 毫升剂量的鸭病毒性肝炎稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭匀浆组织，以重量份计取15份的鸭匀浆组织与85份水介质混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在 4000 转／分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

实施例5

在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15％的被捣碎的鸭组织，占总重量的85％浓度为0.8％的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在 4000 转／分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000 单位青霉素和2000 单位链霉素后即形成鸭病毒性肝炎种毒。将鸭病毒性肝炎种毒放入浓度为0.8 ％的生理盐水中体积稀释100倍，形成鸭病毒性肝炎种毒稀释液，用0.1 毫升剂量的鸭病毒性肝炎稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭匀浆组织，以重量份计取15份的鸭匀浆组织与85份蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到3%，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在 4 000 转／分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

实施例6 

在无菌条件下取因患鸭病毒性肝炎病死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15％的被捣碎的鸭组织，占总重量的85％浓度为0.8％的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在 4000 转／分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000 单位青霉素和 2 000 单位链霉素后即形成鸭病毒性肝炎种毒。将鸭病毒性肝炎种毒放入浓度为0.8 ％的生理盐水中稀释100倍，形成鸭病毒性肝炎种毒稀释液，用0.1 毫升剂量的鸭病毒性肝炎稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭匀浆组织，以重量份计取15份的鸭匀浆组织与85份白油乳化液混合，白油乳化液终浓度达到2%，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在 4000 转／分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚匀浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚匀浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4％的福尔马林液，37-39℃灭活，得预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎的蜂胶注射液。

实施例7  鸭肝炎病毒的检测

取实施例1-6中的匀浆组织用TRIzol Reagent RNA提取试剂盒进行病毒RNA的提取，以如SEQ ID NO:1  ５′-ａｃａａｔｇａｃｃｃａｇｃｃｔｔａｇ-３′（补充）所示的，SEQ ID NO:2   ５′-ｃｃａｃｔｇｔａｔｃｔｔｃｃｃｔｔｃ-３′所示的引物[程安春，汪铭书，信洪一等,Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立, 《中国兽医科学》，２００７，１：３８-４２]，应用RT-PCR的方法进行鸭肝炎病毒的检测，检测结果均为阳性。

实施例8  无菌检测

取实施例1-6制备的注射液分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂平板，经37℃培养24小时，按常规方法观察，杂菌检测为阴性。

实施例9 安全试验

选用未免疫的11日龄的肉鸭中，每组10只，按实施例1-6制备的注射液划分，6组和生理盐水空白组，共计7组；每只1mL,隔离饲养15天，每日作体温、呼吸、精神、食欲、粪便、等临床观测，注射上述疫苗后，均未引起疫苗发病与死亡，注射部位未见明显的病理变化，无不良反应，精神、食欲佳。

实施例10 抗体检测

选用未免疫的11日龄的肉鸭中，每组10只，按实施例1-6制备的注射液划分，6组和生理盐水空白组，共计7组；

检测方法：间接ELISA【杲同玲，鸭病毒性肝炎VFY弱毒疫苗株的筛选和免疫效果的研究。硕士学位论文，福建农林大学，2009】。

结果详见表1。

上述结果表明用本发明所述制备方法制成的预防鸭病毒性肝炎蜂胶注射液对于预防鸭病毒性肝炎具有显著效果，保护率提高到90-100％，保护期延长到6-12个月，产生作用时间缩短到5天，仅需一次注射即可达到预期效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

<110>  重庆市畜牧科学院

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<223>  引物Ⅰ型鸭肝病毒F

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ａｃａａｔｇａｃｃｃ ａｇｃｃｔｔａｇ    18                                       

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<223>  引物Ⅰ型鸭肝病毒 R

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ｃｃａｃｔｇｔａｔｃ ｔｔｃｃｃｔｔｃ   18