二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物在制备化学性疼痛和/或免疫性损伤中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，具体为二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物在制备治疗哺乳动物化学性疼痛和/或免疫性损伤的药物中的用途。该二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物还可以在体外抑制脂多糖诱导的细胞产生IL-12、IL-1β和/或环氧化酶-2。

说明书

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及治疗哺乳动物化学性疼痛和/或免疫性损伤的药物中 的用途以及尤其衍生出的方法和药物试剂盒。

背景技术

许多化学物质会引起人类的病变，例如由于一些化学药品的滥用而引起化学性疼痛，另 一些化学物质会引起机体过度的免疫反应，造成机体的免疫性损伤。而对疼痛和免疫性 损伤的治疗通常是采用吗啡和激素等药物，但是容易产生依赖性，而且疗效会逐渐降低。

为此，本发明人经过长期和深入的研究，从数百种二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合 物中发现了几种特定化合物同时具有治疗哺乳动物化学性疼痛和免疫性损伤的作用，而且治 疗有效剂量使用时无毒副作用。

发明内容：

本发明要解决的技术问题在于提供特定的二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物在制备 治疗哺乳动物化学性疼痛和/或免疫性损伤的药物中的用途。本发明要解决的技术问题还在于 提供用特定的二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物在体外抑制脂多糖诱导的细胞产生IL-12、 IL-1β和/或环氧化酶-2(COX-2)的方法以及药物试剂盒等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物在制备治 疗哺乳动物化学性疼痛和/或免疫性损伤的药物中的用途，所述的二(氨烷氧基)苯基戊二烯 酮化合物是具有以下结构的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，x为1到4的整数；y为1-6的整数。

在本文中，药物可以按照药学领域的常规生产方法制备成各种剂型。例如，使活性成分 ——特定的二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物与药学上可接受的载体混合，然后将其制 成所需的剂型。药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂 如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮； 湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂 如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另 外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。药物可以有适当的剂型来满足通过 口服，静脉注射、肌肉注射等给药的方式施用于需要这种治疗的患者的需求。例如，用于口 服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水剂或其 它液体制剂如糖浆、酏剂等。

优选在本发明的第一方面，其中x和y分别是2和3，即所述的二(氨烷氧基)苯基戊二 烯酮化合物是如下结构式的2，5-二[4-[3-(二甲氨基)丙氧基]苯亚甲基]环戊酮(代号A12) 或其药学上可接受的盐：

也优选在本发明的第一方面，其中x和y分别是3和3，即所述的二(氨烷氧基)苯基 戊二烯酮化合物是如下结构式的2，6-二[4-[3-(二甲氨基)丙氧基]苯亚甲基]环己酮(代号C12) 或其药学上可接受的盐：

在本发明的具体实施方式中，化学性疼痛是由醋酸、甲醛和/或角叉菜引起的。

优选在本发明的第一方面，其中免疫性损伤是肺部免疫性损伤。例如，免疫性损伤是由 脂多糖诱导产生的。免疫性损伤甚至可能造成动物死亡。在本发明的一个具体实施方式中， 免疫性损伤是由脂多糖诱导产生的肺部免疫性损伤。

在第二方面，本发明提供了体外抑制脂多糖诱导的细胞产生IL-12、IL-1β和/或环氧化 酶-2(COX-2)的方法，其包括向脂多糖诱导的细胞加入二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化 合物的步骤，所述的二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮化合物是具有以下结构的化合物及其药学 上可接受的盐：

其中，x为1到4的整数；y为1-6的整数。

在本文中，术语“体外”指的是方法的全部过程都在动物体以外进行，而且所产生的产 物(如，离体的细胞、组织等)均不回输入体内。

优选在本发明的第二方面，其中x和y分别是2和3，即所述的二(氨烷氧基)苯基戊二 烯酮化合物是如下结构式的2，5-二[4-[3-(二甲氨基)丙氧基]苯亚甲基]环戊酮(代号A12) 或其药学上可接受的盐：

也优选在本发明的第二方面，其中x和y分别是3和3，即所述的二(氨烷氧基)苯基 戊二烯酮化合物是如下结构式的2，6-二[4-[3-(二甲氨基)丙氧基]苯亚甲基]环己酮(代号C12) 或其药学上可接受的盐：

在第三方面，本发明提供了药物试剂盒，其包括二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物 以及记载用于治疗哺乳动物化学性疼痛和/或免疫性损伤的使用说明书，所述的二(氨烷氧基) 苯基戊二烯酮化合物是具有以下结构的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，x为1到4的整数；y为1-6的整数。

优选在本发明的第三方面，其中x和y分别是2和3，即所述的二(氨烷氧基)苯基戊二 烯酮化合物是如下结构式的2，5-二[4-[3-(二甲氨基)丙氧基]苯亚甲基]环戊酮(代号A12) 或其药学上可接受的盐：

也优选在本发明的第三方面，其中x和y分别是3和3，即所述的二(氨烷氧基)苯基 戊二烯酮化合物是如下结构式的2，6-二[4-[3-(二甲氨基)丙氧基]苯亚甲基]环己酮(代号C12) 或其药学上可接受的盐：

优选在本发明的第三方面，化学性疼痛是由醋酸、甲醛和/或角叉菜引起的。

优选在本发明的第三方面，其中免疫性损伤是肺部免疫性损伤。例如，免疫性损伤是由 脂多糖诱导产生的。免疫性损伤甚至可能造成动物死亡。在本发明的一个具体实施方式中， 免疫性损伤是由脂多糖诱导产生的肺部免疫性损伤。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文 内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要 特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明 书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1是二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物的化学合成示意图。

图2显示了化合物A12和C12抑制LPS诱导的原代巨噬细胞中的多种免疫损伤相关性蛋白 mRNA的产生。

图3显示了注射化合物A12和C12抑制LPS诱导的小鼠肝脏组织中多种免疫损伤相关性蛋白 mRNA的表达。

图4显示了注射化合物A12和C12抑制LPS导致的小鼠肺脏损伤。

图5显示了注射化合物A12和C12抑制LPS导致的小鼠死亡。

图6显示了注射化合物A12和C12抑制醋酸导致的小鼠腹部疼痛。

图7显示了注射化合物A12和C12抑制甲醛导致的小鼠足部疼痛。

图8显示了注射化合物A12和C12抑制角叉菜导致的小鼠足水肿。

图9显示了化合物A12和C12的急性毒性测试结果。

具体实施方式

本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限 制本发明的范围。

实施例1合成二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮类化合物

合成通法：将10mmol取代苯甲醛溶于10mL无水乙醇中，室温搅拌5min后加入相应的 酮，继续搅拌10min，溶液无变化。将金属钠溶于甲醇，配置成18％(w/v)的甲醇钠/甲醇溶 液。缓慢滴加该甲醇钠溶液1.5mL(含甲醇钠5mmol)于反应溶液中，搅拌反应2h后，出现 大量不溶的黄色物，用TLC检测反应液，320nm紫外灯下不再出现取代苯甲醛的紫色斑点， 产物斑点明晰显黄色。停止反应，将反应液过滤，产物先用水洗，随后用冰乙醇、冰丙酮洗 两次，30℃真空干燥过夜后得黄色粉末状产物二(氨烷氧基)苯基戊二烯酮。

化合物A12：黄色粉末，收率72％，熔点154℃.¹H-NMR(CDCl3)δ：1.98(4H，m，CH2×2)， 2.26(12H，s，N-CH3×4)，2.46(4H，t，J＝7.4Hz，CH2-N×2)，3.08(4H，s，CH2-CH2)，4.07(4H，t， J＝6.2Hz，O-CH2×2)，6.96(4H，d，J＝8.8Hz，Ar-H2，6×2)，7.73(2H，s，Ar-CH＝C×2)，7.56(4H，d， J＝8.8Hz，Ar-H3，5×2).ESI-MS m/z：463.33(M+1)⁺，calcd for C₂₉H₃₈N₂O₃：462.62.

化合物C12：黄绿色粉末，收率64.7％，熔点89.7-91.5℃.¹H-NMR(CDCl3)δ：1.85(2H，m， ＞CH2)，1.97(4H，m，-CH2-×2)，2.25(12H，s，N-CH3×4)，2.45(4H，t，J＝6.9Hz，N-CH2-×2)，2.91 (4H，t，J＝4.8Hz，CH2-CH2)，4.02(4H，m，O-CH2×2)，6.92(4H，d，J＝8.4Hz，Ar-H3，5×2)，7.26(2H， s，Ar-CH＝C×2)，7.43(4H，d，J＝8.4Hz，Ar-H2，6×2).ESI-MS m/z：477.3(M+1)⁺，calcd for C₃₀H₄₀N₂O₃：476.65.

实施例2化合物A12和C12抑制LPS(脂多糖)诱导的原代巨噬细胞中的IL-12、IL-1β和 COX-2(环氧化酶-2)的mRNA的产生

1.2×10⁶个小鼠原代巨噬细胞用1640培养液培养于37℃，24小时后更新培养液并加入不 同浓度的化合物预处理2小时，再用0.5μg/ml的LPS继续处理6小时，收集细胞提取总RNA， 逆转录后用荧光定量PCR检测IL-12、IL-1β和COX-2mRNA的含量，检测β-actin mRNA作 为内参照定量基因。结果如图2所示，化合物A12和C12显著抑制LPS诱导的IL-12、IL-1β 和COX-2mRNA的增加(均有显著性差异，*p＜0.05，**p＜0.01)。

实施例3注射化合物A12和C12抑制LPS诱导的小鼠肝脏组织中IL-1β、iNOS(诱导型一 氧化氮合成酶)、COX-2和mPGES(膜相关前列腺素合成酶)的mRNA表达

为了进一步证实化合物A12和C12可以在体内抑制LPS诱导的多种细胞因子和酶的表达， 我们又通过RT-qPCR测定了mRNA水平上小鼠肝组织中IL-1β、iNOS、COX-2和mPGES的 mRNA水平。C57BL/6小鼠首先被静脉注射A12或C12(15mg/kg)，对照组注射相同剂量的生 理盐水，15分钟后，再静脉注射LPS(10mg/kg)。不同时间后，杀死小鼠，取肝组织匀浆，提 取总RNA，通过RT-qPCR技术检测相关的这些mRNA的含量，如iNOS、COX-2、IL-1β和mPGES， 其中以Actin为对照基因。结果如图3所示。在肝组织中LPS刺激的因子mRNA的表达分别在不 同时间达到峰值(1-6小时)。结果显示，结予LPS后在指定的时间肝组织中炎症基因mRNAs 明显增加，而同时给予A12或C12的小鼠中，所测因子mRNA水平都明显降低。这些结果说A12 和C12显著抑制LPS诱导的小鼠肝组织中这些蛋白基因的转录(均有显著性差异，*p＜0.05， **p＜0.01)。

实施例4注射化合物A12和C12抑制LPS导致的小鼠肺损伤

将C57BL/6小鼠随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组、LPS组(剂量10mg/kg)、 LPS+A12(15mg/kg)组和LPS+C12(15mg/kg)组，给药后2天杀死小鼠，取肺组织用福尔马林 固定、石蜡包埋、切片后用H&E染色。结果如图4所示，小鼠静脉注射LPS两天后观察到 明显的肺组织学上的损伤；而同时给予A12或C12的组可以明显改善小鼠肺组织损伤。

实施例5注射化合物A12和C12抑制LPS导致的小鼠死亡

将C57BL/6小鼠随机分为4组，每组12只，分别为空白对照组、LPS组(剂量20mg/kg)、 LPS+A12(15mg/kg)组和LPS+C12(15mg/kg)组，给药后观察7天，记录小鼠死亡率。结果如 图5所示，单纯静脉注射LPS的小鼠在48小时后全部死亡，而同时给予A12或C12的小鼠 全部存活，表明化合物A12和C12可以明显抵抗LPS导致的急性休克，提高小鼠生存率(均 有显著性差异，***p＜0.001)。

实施例6注射化合物A12和C12抑制醋酸导致的小鼠腹部疼痛

将ICR小鼠随机分为5组，每组7只，分别为生理盐水组、阳性药地塞米松组、A12(10mg/kg) 组、A12(30mg/kg)组、C12(5mg/kg)组和C12(15mg/kg)组，以腹腔注射分别给与相应剂量的生 理盐水或化合物15分钟后，再腹腔注射200μl浓度为0.6％的醋酸，观察1小时，记录小鼠扭 体次数。结果如图6所示，化合物对醋酸刺激引起的疼痛(醋酸扭体反应)与生理盐水组比较 有显著性差异；A12(10mg/kg)、A12(30mg/kg)、C12(5mg/kg)、C12(15mg/kg)的扭体 发生率对比于生理盐水组分别抑制了83.2％、97.0％、57.5％和91.6％(均有显著性差异， ***p＜0.01)。

实施例7注射化合物A12和C12抑制甲醛导致的小鼠足部疼痛

将ICR小鼠随机分为5组，每组7只，分别为生理盐水组、阳性药地塞米松组、A12(10mg/kg) 组、A12(30mg/kg)组、C12(5mg/kg)组和C12(15mg/kg)组，以腹腔注射分别给与相应剂量的生 理盐水或化合物15分钟后，在小鼠右足足底注射10μl浓度为30％的福尔马林溶液，在注射 后的第15-30分钟观察和记录小鼠添足次数。结果如图7所示，化合物对福尔马林刺激引起 的足部疼痛与生理盐水组比较有显著性差异(p＜0.01)；A12(10mg/kg)、A12(30mg/kg)、 C12(5mg/kg)、C12(15mg/kg)的添足次数对比于生理盐水组分别抑制了54.4％、87.0％、 28.5％和78.7％(均有显著性差异，**p＜0.05，***p＜0.01)。

实施例8注射化合物A12和C12抑制角叉菜导致的小鼠足水肿

将ICR小鼠随机分为5组，每组7只，分别为生理盐水组、阳性药地塞米松组、A12(10mg/kg) 组、A12(30mg/kg)组、C12(5mg/kg)组和C12(15mg/kg)组，以腹腔注射分别给与相应剂量的生 理盐水或化合物15分钟后，在小鼠右足足底注射300μg角叉菜溶液，4小时后，测量右足体 积大小，记录肿胀程度。结果如图8所示，化合物对角叉菜刺激引起的足部水肿与生理盐水 组比较有显著性差异(p＜0.05)；A12(10mg/kg)、A12(30mg/kg)、C12(5mg/kg)、C12(15mg/kg) 的水肿程度对比于生理盐水组分别抑制了48.0％、60.0％、39.9％和46.9％(均有显著性差异， **p＜0.05)。

实施例9化合物A12和C12的急性毒性测试

ICR小鼠100只，随机分为10组，每组10只。分别以腹腔注射方式一次性给予A12、C12 由高到低剂量为5、10、20、40、80mg/kg，造成急性毒性模型，给药后观察小鼠的反应及死 亡情况14天，记录小鼠的生存率。结果如图9所示，注射A12的小鼠完全存活，而注射80mg/kg C12的小鼠有部分死亡，说明A12在80mg/kg时还是安全的，而C12在40mg/kg时还是安全的。