苹果MdMYB1基因中与着色相关的两处突变及其检测方法

摘要

苹果MdMYB1基因中与着色相关的两处突变及其检测方法。本发明属生物技术领域，为苹果着色性状改良提供一种低成本分子育种手段。利用苹果着色相关基因MdMYB1设计一对引物，以苹果基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增片段。对8个苹果品种的PCR扩增片段进行测序和分析，找出两处与苹果着色性状有关的基因突变，其中一处为Pml I酶切位点。利用该酶切位点开发出一个检测突变的CAPS标记Mb2P，其显著进步是它能用普通琼脂糖电泳检测，实验成本显著降低，不象前人的dCAPS标记需用昂贵的NuSieve GTG琼脂糖电泳检测。通过CAPS标记或测序方法检测突变，可鉴定苹果品种及杂交后代果实着色性状，对苹果杂交后代果实着色性状进行早期选择，舍弃部分植株，节省后代植株的管理与筛选成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果MdMYB1基因中的两处突变与苹果果实着色性状 的关系及突变检测方法。

背景技术

苹果(Malus domestica Borkh.)是我国果树产业中重要的大宗水果，其着色问题是影响 我国许多产区苹果质量的一个重要因素，培育着色好的品种是生产中急需的。通过研究利用 苹果着色相关基因的序列变异，开发果实着色性状的分子标记，提早鉴定杂交后代植株果实 着色性状，对杂交后代植株提早进行筛选，将有助于降低早期试验费用和工作量，以低成本 尽快培育出着色好的苹果新品种，增强我国苹果的质量和市场竞争力。

苹果的着色与果皮中的花色苷有关，花色苷的合成涉及查尔酮合成酶(CHS)、类黄酮3- 羟基化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖转移酶(UFGT) 等酶的基因。研究表明，花色苷的积累与这些基因、特别是UFGT基因的表达水平有关，这些 基因的表达受到MYB家族转录因子的调控，MdMYB1基因是一个与果实着色有关的功能基因 (Takos等，2006)。Takos等(2006)通过分析MdMYB1-1(GenBank登录号DQ886414)等基 因序列，找到了一个与果实着色性状有关的碱基突变位点，开发出一个dCAPS标记。dCAPS 标记是一种改进的CAPS标记(derived CAPS)，而CAPS标记是指切割扩增的多态性序列标记 (Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos等(2006)开发的dCAPS标记虽然不 能将澳洲青苹等品种与一些着色品种区分开，但可以区分其它一些着色与非着色品种，可以 完全区分杂交亲本植株(粉红女士姊妹株、金帅)及其后代植株，在杂交后代植株的早期选 择中利用价值高。该dCAPS标记的缺点是酶切后的片段长度仅有29bp的差异，利用普通的琼  脂糖电泳无法检测，需要用价格约为7000元/125g的昂贵NuSieve GTG琼脂糖进行电泳检测。 本发明的目的是通过进一步分析MdMYB1基因序列，寻找其它与苹果果实着色性状相关的突变 位点，开发可用普通琼脂糖电泳检测的分子标记(例如CAPS标记)用来鉴定苹果植株果实着 色性状。

参考文献

[1]苑克俊，张毅，孙瑞红，张振成.苹果、葡萄花色苷生物合成研究进展.山东农业科学， 1998，6：46-49.

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发明内容

本发明找出苹果MdMYB1基因中两处突变与苹果果实着色性状相关，提供检测这些突变、 进而鉴定苹果果实着色性状的分子标记方法和测序方法。

本发明解决问题所采用的技术方案是：根据苹果MdMYB1基因(GenBank登录号DQ886414) 序列设计引物，利用设计的引物对8个不同苹果品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过对这 些苹果品种的PCR扩增产物测序与序列比对寻找突变，然后分析这些苹果品种的基因突变与 果实着色性状的关系，找出与苹果果实着色性状相关的两处突变，开发用普通琼脂糖电泳检 测突变的分子标记方法(例如CAPS标记方法)用来鉴定苹果果实着色性状，也可通过测序方 法获得突变位点碱基信息鉴定苹果果实着色性状。

本发明的有益效果是：(1)本发明通过实验新找出苹果MdMYB1基因中两处突变与苹果果 实着色性状相关，可用来开发新的方法鉴定苹果果实着色性状。(2)与现有的利用另外一处 突变鉴定苹果果实着色性状的dCAPS标记相比，本发明新开发的CAPS标记鉴定方法简单实用。 现有dCAPS标记的PCR扩增产物酶切后，片段长度仅有29bp的差异，利用普通的琼脂糖电泳 无法检测；本发明CAPS标记PCR扩增产物的酶切产物，通过设计引物可将酶切产物的片段长 度差异控制在70～200bp，可利用普通的琼脂糖电泳检测，而且由于片段差异大，电泳时间可 缩短。(3)与现有技术相比，本发明CAPS标记方法节省实验成本效果突出。现有dCAPS标记 实验在3％的NuSieve GTG琼脂糖上进行电泳检测，NuSieve GTG琼脂糖价格昂贵为6900元 /125g；本发明CAPS标记实验在1.2％的普通琼脂糖上电泳检测，价格仅220元/100g。一次 实验按100ml凝胶溶液计算，则现有dCAPS标记实验琼脂糖费用165.6元，本发明CAPS标 记实验琼脂糖费用仅2.64元，实验成本显著降低。(4)利用本发明可鉴定苹果品种和杂交后 代植株果实着色性状后，进而对苹果杂交后代植株进行早期选择，舍弃一部分植株，节省杂 交后代植株的管理与筛选成本。总之，本发明为苹果的果实着色性状改良提供了一种简单易 用的低成本分子标记育种手段。

这里需要说明的是：本发明所用8个苹果品种富士、国光、嘎拉、红星、红玉、印度、 金帅、青香蕉全部为生产上栽培的品种，公众能得到；本发明涉及基因序列为已知MdMYB1基 因序列，不涉及核苷酸或氨基酸序列表；本发明设计人曾在2009年11月21-22日于广州召 开的“庆祝中国园艺学会创立80周年暨第十一次会员代表大会”发表“苹果着色相关基因的 分子标记及其利用研究”论文摘要，但该论文是研究另一突变，本发明权利要求中与苹果果 实着色性状有关的两处MdMYB1基因突变及其检测方法未发表。为慎重起见，我们还是填写了 发明专利请求书(19)不丧失新颖性宽限声明。

附图说明

图1是8个苹果品种PCR扩增产物的电泳图。图中M.DNA分子量标记，数字和bp为标 记大小与单位，1.富士，2.国光，3.嘎拉，4.红星，5.红玉，6.印度，7.金帅，8.青香蕉；

图2是已知位点227的碱基信息、本发明新找出的206与280两处突变位点的碱基信息 与果实着色性状；

图3是本发明第一个实施例8个苹果品种PCR扩增产物酶切后的电泳图，图中M.DNA分 子量标记，数字和bp为标记大小与单位，1.富士，2.国光，3.嘎拉，4.红星，5.红玉，6. 印度，7.金帅，8.青香蕉；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

本发明测序方法检测突变实施步骤：

步骤1，试材：富士和嘎拉苹果及其杂交后代植株的叶或花，以及金帅、国光、红星、 红玉、印度、青香蕉六个苹果品种的叶或花。

步骤2，基因组DNA提取：试材研磨后立即加入预热至65℃的0.6mL 2％CTAB提取缓冲液 [2％CTAB，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％PVP-40，2％β- 巯基乙醇]，在65℃水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样品试管3次。取出加入0.6mL氯仿∶ 异戊醇(24∶1)，轻轻翻转，充分混匀，12000rpm离心10min。将上清液转入另一个新试管， 加入等体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，在12000rpm离心10min后将上清液移去。试 管中的DNA球用500μL冷的70％乙醇(-20℃)漂洗2次，将试管置于室温下晾干，加入30～ 50μL灭菌无离子水或0.2X的TE，再加入1μLRNase A(2.5mg/ml)处理除去RNA，在4℃冰箱 中保存备用，暂时不用的DNA则冷冻保存。

步骤3，PCR扩增：利用MdMYB1基因序列在突变两侧设计正向引物Mb2f(序列为 TTGGGTGTTTGCTGTTGC)和反向引物Mb2R(序列为TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，也可设计其它正 向和反向引物。PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA和19.5μL反应混合物， 一份混合物由0.4μL dNTPs(10mmol/L)、2μL 10x Taq缓冲液、0.5μL正向引物(10μmol/L)、 0.5μL反向引物(10μmol/L)、0.25μL(5U)的Taq DNA聚合酶和15.85μL水组成。PCR反应 35个循环，每一循环包括94℃变性30s、56℃退火1min和72℃引物延伸2min。

步骤4，电泳检查：将3μL PCR产物、6μL水和1μL上样染料混合，溴化乙锭染色，在 120V电压、1.2％琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物，结果如图1所示。

步骤5，PCR产物测序：由专门的生物技术公司进行。测序后通过对获得的各苹果品种序 列进行比对分析找出突变位点，然后分析这些突变位点与前人开发的dCAPS标记突变位点的 关系，结果如图2所示，新找出位点206和位点280两个突变位点(也就是MdMYB1-1基因转 录起始点上游-1624bp处和-1550bp处)，能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位 点227相同的信息(即在每一突变位点前6个苹果品种都含有一个相同的碱基，后6个苹果 品种都含有一个相同的碱基)，表明PCR产物测序新获得的突变位点碱基信息可直接用来鉴定 苹果果实着色性状，也可用来开发可鉴定苹果果实着色性状的分子标记。

本发明CAPS标记方法检测突变实施步骤：

步骤1，试材：同上述测序方法。

步骤2，基因组DNA提取：同上述测序方法。

步骤3，PCR扩增：同上述测序方法。

步骤4，电泳检查PCR产物：同上述测序方法。

步骤5，酶切实验：取5μLPCR产物加入试管中，再加入2μL反应缓冲液(10x)、1μL(10U) 限制性内切酶Pml I和12μL水，在37℃水浴2～3h进行酶切。

步骤6，电泳检查酶切产物：20μL酶切产物加5μL上样染料混合，溴化乙锭染色，在120 V电压、1.2％琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物，结果如图3所示。有2个苹果品种PCR扩 增产物酶切后仅出现一条与苹果果实着色性状有关的495bp带，有2个苹果品种PCR扩增产 物酶切后仅出现一条与苹果果实非红色性状有关的698bp带，有4个苹果品种PCR扩增产物 酶切后出现一条与苹果果实着色性状有关的495bp带和一条与苹果果实非红色性状有关的 698bp带。

实施例1：CAPS标记法检测突变、鉴定苹果品种植株着色性状

步骤1，试材：富士、嘎拉、金帅、国光、红星、红玉、印度、青香蕉8个常见苹果品 种的叶或花。

步骤2，基因组DNA提取：同前述测序方法。

步骤3，PCR扩增：同前述测序方法。

步骤4，酶切实验：取5μLPCR产物加入试管中，再加入2μL反应缓冲液(10x)、1μL(10U) 限制性内切酶Pml I和12μL水，在37℃水浴2～3h进行酶切。20μL酶切产物加5μL上样 染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1.2％琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物，结果 如图3所示。

步骤5，苹果品种植株着色性状分析：鉴于新找出的两个突变位点能提供与前人苹果着色 性状dCAPS分子标记突变位点相同的信息，表明利用新获得的突变位点碱基信息开发的苹果 果实着色性状分子标记，同前人的苹果着色性状dCAPS分子标记一样可鉴定苹果杂交后代植 株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果，8个苹果品种中，国 光和红玉2个苹果品种PCR扩增产物酶切后仅出现一条495bp带，苹果果实着色性状为红色； 金帅和青香蕉2个苹果品种PCR扩增产物酶切后仅出现一条698bp带，苹果果实着色性状为 非红色性状；富士、嘎拉、红星和印度4个苹果品种PCR扩增产物酶切后出现一条698bp带 和一条495bp带，苹果果实着色性状可能为红色(包括桔红色，如富士、嘎拉和红星)，也可 能为非红色(如印度)。

实施例2：CAPS标记法检测突变、鉴定苹果杂交后代植株着色性状

步骤1，试材：利用富士和嘎拉苹果作为亲本进行杂交获得种子，种子播种后获得的苹 果杂交后代植株叶作为试材。

步骤2，基因组DNA提取：同前述测序方法。

步骤3，PCR扩增：同前述测序方法。

步骤4，酶切实验：取5μLPCR产物加入试管中，再加入2μL反应缓冲液(10x)、1μL(10U) 限制性内切酶Pml I和12μL水，在37℃水浴2～3h进行酶切。20μL酶切产物加5μL上样 染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1.2％琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物。

步骤5，苹果杂交后代植株着色性状分析：鉴于新找出的两个突变位点能提供与前人苹 果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的信息，表明利用新获得的突变位点碱基信息开发 的苹果果实着色性状分子标记，同前人的苹果着色性状dCAPS分子标记一样可鉴定苹果杂交 后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果，本发明实施例 苹果杂交后代植株中，有些植株PCR扩增产物酶切后仅出现一条495bp带，其果实为红色；有 些植株PCR扩增产物酶切后仅出现一条698bp带，其果实为非红色；有些植株PCR扩增产物酶 切后出现一条698bp带和一条495bp带，其果实为红色(包括桔红色)。如果研究的目的是筛 选非红色品种，可保留仅出现一条698bp带的杂交后代植株，舍弃其它杂交后代植株，因此 可节约后期管理和筛选费用。如果研究的目的是筛选红色品种，可舍弃仅出现698bp带的杂 交后代植株，保留其它杂交后代植株，节约后期管理和筛选费用。

实施例3：利用突变位点206鉴定苹果品种植株着色性状

步骤1，试材：同前述测序方法。

步骤2，基因组DNA提取：同前述测序方法。

步骤3，PCR扩增：同前述测序方法。

步骤4，电泳检查：同前述测序方法。

步骤5，PCR产物测序：同前述测序方法。

步骤6，苹果品种植株着色性状分析：鉴于新找出的突变位点206(也就是MdMYB1-1基 因转录起始点上游-1624bp处)能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的 信息，表明新获得的突变位点206的碱基信息，同前人的苹果着色性状dCAPS分子标记一样 可鉴定苹果杂交后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果， 8个苹果品种中，国光和红玉2个苹果品种PCR产物序列位点206含有G，苹果果实着色性状 为红色；金帅和青香蕉2个苹果品种PCR产物序列位点206含有A，苹果果实着色性状为非红 色性状；富士、嘎拉、红星和印度4个苹果品种PCR产物序列位点206含有G和A，苹果果 实着色性状可能为红色(包括桔红色，如富士、嘎拉和红星)，也可能为非红色(如印度)。

实施例4：利用突变位点280鉴定苹果品种植株着色性状

步骤1，试材：同前述测序方法。

步骤2，基因组DNA提取：同前述测序方法。

步骤3，PCR扩增：同前述测序方法。

步骤4，电泳检查：同前述测序方法。

步骤5，PCR产物测序：同前述测序方法。

步骤6，苹果品种植株着色性状分析：鉴于新找出的突变位点280(也就是MdMYB1-1基 因转录起始点上游-1550bp处)能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的 信息，表明新获得的突变位点280的碱基信息，同前人的苹果着色性状dCAPS分子标记一样 可鉴定苹果杂交后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果， 8个苹果品种中，国光和红玉2个苹果品种PCR产物序列位点280含有T，苹果果实着色性状 为红色；金帅和青香蕉2个苹果品种PCR产物序列位点280含有C，苹果果实着色性状为非红 色性状；富士、嘎拉、红星和印度4个苹果品种PCR产物序列位点280含有T和C，苹果果 实着色性状可能为红色(包括桔红色，如富士、嘎拉和红星)，也可能为非红色(如印度)。