改善口腔内细菌群的发酵乳酸杆菌SG-A95及其保健组合物

摘要

本发明涉及用于改善口腔内细菌群的发酵乳酸杆菌SG-A95(Lactobacillusfermentum SG-A95)及其发酵产物所制成的保健组合物，是用以抑制口腔的牙周细菌生长。

说明书

技术领域

本发明是关于一种抑制口腔内细菌生长的发酵乳酸杆菌及其发酵物。

背景技术

正常人口腔内存在着许多细菌、霉菌、甚至病毒，而其中又以细菌的数量 为最大：每毫升唾液中有1亿个细菌，整个口腔中的细菌种类超过600种，然 而这些细菌并非全都是致病菌，其中也包括部份的益生菌。正常状况下这些 细菌彼此维持菌落的相对平衡而不会致病，但如果身体免疫力或抵抗力变差、 口腔环境改变、服用药物或有全身性疾病等情况下，就会使致病菌过度生长 而造成口腔疾病，轻则导致口臭、滋生牙菌斑、牙龈发炎等，重则引发龋齿、 牙周病，甚至是细菌侵入血管内大量繁殖而造成菌血症。

根据牙医师公会全国联合会全年度健保资料统计，台湾地区成年人罹患 牙周病比例高达9成，由此可见牙齿保健的重要性。

牙周病一般可分为两种，亦即牙龈炎(又作齿龈炎，gingivitis)和牙周炎 (periodontitis)。牙龈炎主要征兆是牙龈出血、肿胀、发红等。牙周炎则是 指支撑牙龈组织和牙齿的齿槽骨(alveolar bone)遭到破坏的状态。

罹患牙周病，牙齿和牙龈间的沟槽会变深，形成牙周囊袋(periodontal pocket)。通常牙齿健康者的牙周囊袋深度约在1mm到2mm之间，轻度牙周 炎患者的牙周囊袋深度约是3～4mm，中度患者是4～6mm，重度患者的牙周 囊袋深度则超过6mm以上。随着牙周囊袋的加深，牙龈本身会变短。当牙齿 外观看起来变长，或者牙齿开始晃动，都可能是重度牙周病的警讯。

牙龈炎及牙周炎都是牙周细菌(periodontal bacteria)感染造成，代表性细 菌有牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)。

唾液中的醣蛋白(glycoprotein)会在牙齿表面形成薄膜，使细菌可在此 附着，细菌吸取了食物中的糖分后，薄膜会变大、增厚，进而形成牙菌斑。 再者，如果牙周囊袋中形成牙菌斑的话，牙周细菌便会在该牙菌斑中大量繁 殖。由于牙周细菌具厌氧性，所以氧气难以到达的牙周囊袋是它最适合滋生 的环境。牙菌斑也是变形链球菌(Streptococcus mutans)的温床，90％以上的 成年人口腔中都携带这种细菌，而此菌亦是造成龋齿的主要细菌。当变形链 球菌分解糖分产生的酸性物质侵蚀牙齿的珐琅质(enamel)和象牙质(dentin) 后，就会造成龋齿。

就牙周病而言，当牙周细菌侵入牙龈时，就会引起免疫反应。牙周细菌 会分泌酵素溶解牙龈细胞进而入侵到牙龈内部。在牙周细菌数量尚少时，还 能阻止它的入侵，一旦大量繁殖，就会无法抑制。

目前有一些方式可以预防龋齿或牙周病的产生，例如施用避免细菌附着 至牙齿表面的抗附着剂，以减少牙菌斑的形成避免细菌侵蚀牙质(中国台湾 专利申请号094144377)；使用抗菌剂以抑制细菌孳生(美国专利第5,368,845 号；WO 92/14475)；或是目前所广泛使用的氟化物，利用其能降低珐琅质对 酸性物质的溶解度以预防龋齿。然而，目前鲜少有研究探讨乳酸菌及其治疗 口腔疾病的效用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵乳酸杆菌SG-A95(Lactobacillus fermentum)(已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”， 其保藏号为CGMCC No.3248，保藏日期为2009年08月21日，分类命名为：发 酵乳杆菌)更进一步揭示该发酵乳酸杆菌SG-A95，其包含编码如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。本发明的另一目的在于揭露以该发酵乳酸杆菌SG-A95于 培养基发酵后制得的发酵产物。

本发明的又一目的是提供一种改善口腔内细菌群的保健组合物，是将前 述发酵乳酸杆菌SG-A95(Lactobacillus fermentum)或其发酵产物应用于口腔 保健，可有效抑制个体口内的牙周细菌生长。

本发明的SEQ ID NO：1是和已知的发酵乳酸杆菌的遗传物质有明显差异 (详见图1)。此外，API 50 CHL比对显示出本发明的发酵乳酸杆菌SG-A95 与欧洲专利号0154549所揭露的菌株AD0002(寄存号FERM P-7539)有明显差 异，如表一所示。

表一、本发明的发酵乳酸杆菌与欧洲专利号0154549所揭露的菌株AD0002 (寄存号FERM P-7539)的API 50 CHL比对

  API 50   CHL   糖类  LF(本发明的发酵  乳酸杆菌)   EP0154549   (AD0002)   (FERM P-7539)   0   控制组  -   1   甘油(Glycerol)  -   2   赤藓糖醇(Erythritol)  -   3   D-阿拉伯糖   (D-Arabinose)  -   +   4   L-阿拉伯糖   (L-Arabinose)  -   5   D-核糖(D-Ribose)  +   +   6   D-木糖(D-Xylose)  -   +   7   L-木糖(L-Xylose)  -   8   核糖醇(Adonitol)  -   9   β-甲基-木糖苷   (βMethyl-xyloside)  -   10   半乳糖(Galactose)  +   +   11   D-葡萄糖   (D-Glucose)  +   +   12   D-果糖(D-Fructose)  +   13   D-甘露糖   (D-Mannose)  -   -   14   L-山梨糖(L-Sorbose)  -   15   鼠李糖(Rhamnose)   -   16   卫矛醇(Dulcitol)   -   17   肌醇(Inositol)   -   18   甘露糖醇(Mannitol)   -   -   19   山梨糖醇(Sorbitol)   -   -   20   α甲基-D-甘露糖苷   (α   Methyl-D-mannoside)   -   21   α甲基-D-葡萄糖苷   (α   Methyl-D-glucoside)   -   22   N-乙酰葡萄糖胺   (NAcetyl   glucosamine)   -   23   苦杏仁苷   (Amygdaline)   -   -   24   熊果苷(Arbutine)   -   25   七叶苷(Esculine)   -   -   26   水杨苷(Salicine)   -   -   27   纤维二糖(Cellobiose)   -   -   28   麦芽糖(Maltose)   +   +   29   乳糖(Lactose)   -   +   30   木蜜二糖(Melibiose)   +   +   31   蔗糖(Saccharose)   +   +   32   海藻糖(Trehalose)   -   +   33   菊糖(Inuline)   -   34   落叶松糖   (Melezitose)   -   -   35   D-棉子糖   (D-Raffinose)   +   +   36   淀粉(Amidon)   -   37   肝糖(Glycogen)   -   38   木糖醇(Xylitol)   -   39   β-龙胆二糖   (β-Gentiobiose)   -   40   D-松二糖   (D-Turanose)   -   41   D-来苏糖(D-Lyxose) -   42   D-塔格糖   (D-Tagatose) -   43   D-炭藻糖(D-Fucose) -   44   L-炭藻糖(L-Fucose) -   45   D-阿拉伯胶醇   (D-Arabitol) -   46   L-阿拉伯胶醇   (L-Arabitol) -   47   葡萄糖酸(Gluconate) -   48   2keto-gluconate   (2-酮-葡萄糖酸) -   49   5keto-gluconate   (5-酮-葡萄糖酸) -

另本发明所述的个体为哺乳动物，较佳为人。

由体外实验或活体实验得知，常见的牙周细菌诸如变形链球菌 (Streptococcus mutans)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、牙龈卟啉菌 (Porphyromonas gingivalis)及黏放线菌(Actinomyces viscosus)等皆会受到 发酵乳酸杆菌活菌或其发酵产物的影响而停止生长甚至死亡。藉由发酵乳酸 杆菌抑制口内细菌滋生的特性，可将发酵乳酸杆菌应用于预防或治疗如下列 所示的口腔细菌性疾病：

1与牙龈卟啉菌相关的疾病：牙周疾病(Periodontal disease)、骨质疏松 症、海绵静脉窦血栓性静脉炎(Cavernous sinus thrombophlebitis)、牙周病 (Periodontitis)、心血管疾病、感染性心内膜炎(infective endocarditis)、糖尿 病、呼吸系统疾病、动脉硬化、冠状心脏病、中风、类风湿性关节炎。

2.与血链球菌相关的疾病：蛀牙、感染性心内膜炎、急感染性关节炎(Acute septic arthritis)、心血管疾病。

3.与变种链球菌相关的疾病：蛀牙、感染性心内膜炎。

4.与黏放线菌相关的疾病：牙周病。

本发明所揭露的发酵乳酸杆菌SG-A95活菌本身即具有抑制细菌滋生的 能力，因此在实际使用上，可将发酵乳酸杆菌SG-A95菌株以直接涂抹于口腔 的方式使用，或是在不破坏菌株活性而让其能于口腔内复原的前提下，将本 发明的菌株加以冷冻或干燥化，进而制成锭剂或喷剂、溶于液体、以食品或 医药品或口腔清洁剂添加剂方式加以制造并使用。任何方式只要不破坏发酵 乳酸杆菌SG-A95活菌抑制细菌的能力即为本发明的可能适用方式。

本发明所揭露的发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物是指发酵乳酸杆菌 SG-A95经能培养出发酵乳酸杆菌SG-A95成分的培养基发酵后的产物。该培 养基的主要成分为葡萄糖、蛋白酶、肉类萃取物、酵母菌萃取物、盐类等物 质。发酵乳酸杆菌SG-A95发酵后的产物即使经过透析膜纯化后，例如使用 透析膜(MWCO：3500)进行透析，亦不影响其抑菌效力，显示其 抑菌能力并非完全仰赖发酵乳酸杆菌活菌菌体，而是在于其发酵过程所产生 的代谢物。因此，本发明所揭露的以发酵乳酸杆菌SG-A95为有效成分的口腔 保健物，可仅包含除去发酵乳酸杆菌活菌体的发酵乳酸杆菌发酵产物。

在实际应用上，本发明是可将发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物以直接涂抹 于口腔、制成锭剂或喷剂、溶于液体、以食品或医药品或口腔清洁剂加以制 造并使用。惟任何方式只要不破坏发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物抑制细菌的 能力即为本发明的可能适用方式。

附图说明

图1显示本发明的SEQ ID NO：1与已知的发酵乳酸杆菌(美国专利公开 号US 2002/0094328中的菌株ATCC14931)的核苷酸序列比对图(使用NCBI blast程序)。Query为ATCC14931的序列，Sbjct为本发明SEQ ID NO：1的 序列；

图2显示发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLFP4)肝脏组织切片(200X)；

图3显示发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLFP4)肾脏组织切片(200X)；

图4显示发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLFBH)肝脏组织切片(200X)；

图5显示发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLFBH)肾脏组织切片(200X)；

图6显示对照组的四环霉素治疗组(tTC)肝脏组织切片(200X)；

图7显示对照组的四环霉素治疗组(tTC)肾脏组织切片(200X)；

图8显示对照组的无治疗(蒸馏水)组(tMT)肝脏组织切片(200X)；

图9显示对照组的无治疗(蒸馏水)组(tMT)肾脏组织切片(200X)；

图10显示发酵乳酸杆菌SG-A95预防组(pLFP4)肝脏组织切片(200X)；

图11显示发酵乳酸杆菌SG-A95预防组(pLFP4)肾脏组织切片(200X)；

图12显示发酵乳酸杆菌SG-A95预防组(pLFBH)肝脏组织切片(200X)；

图13显示发酵乳酸杆菌SG-A95预防组(pLFBH)肝脏组织切片(200X)；

图14显示对照组的四环霉素预防组(pTC)肝脏组织切片(200X)；

图15显示对照组的四环霉素预防组(pTC)肾脏组织切片(200X)；

图16显示对照组的无预防(蒸馏水)组(pMT)肝脏组织切片(200X)；

图17显示对照组的无预防(蒸馏水)组(pMT)肾脏组织切片(200X)。

具体实施方式

本发明是揭露一种用于预防或治疗口腔细菌性疾病的保健组合物，其中 有效成分为发酵乳酸杆菌SG-A95(Lactobacillus fermentum)或其发酵产物， 在此以体外(in vitro)或活体(in vivo)实验加以验证该菌体或其发酵物对于 牙周病的疗效。

1.体外实验(in vitro study)

以发酵乳酸杆菌SG-A95在液态培养基，本实施例采用MRS培养基，于 30～37℃培养15～24小时后，将发酵菌液浓缩成30倍浓度，并使用透析膜 (Dialysis Membrane；MWCO：3500，Spectrum Laboratories Inc，CA) 将其透析48小时，再依实验需求将发酵乳酸杆菌SG-A95与浓缩发酵产物稀 释成不同浓度。分别与变形链球菌(Streptococcus mutans)(ATCC 25175)、 血链球菌(Streptococcus sanguis)(ATCC 49295)、牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)(ATCC 33277)及黏放线菌(Actinomyces viscosus)(ATCC 15987) 进行纸锭琼脂扩散试验(Disc agar diffusion test)、肉汤稀释法(broth dilution method)、发酵乳酸杆菌活菌与病原菌共同培养试验，了解抑制病原菌生长状 况。以上四株病原菌菌株购自财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及 研究中心或ATCC。

MRS培养基常用于乳酸菌培养，其主要成分为葡萄糖、蛋白酶、肉类萃 取物、酵母菌萃取物、盐类等物质。

(1)纸锭琼脂扩散试验

将培养至浊度相当于0.5比浊度的变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉菌及 黏放线菌菌液，以无菌棉棒沾菌液3秒钟，在三个方向平均涂抹于琼脂表面， 使接种原平均分布。将发酵乳酸杆菌SG-A95的30倍发酵产物透析后，调整 成浓缩4倍(LFP4)、浓缩2倍(LFP2)及1倍(LFP1)(未浓缩的发酵菌液)，及 将发酵乳酸杆菌SG-A95活菌稀释成不同菌数，分别为1×10⁹(LFBL)、 2×10⁹(LFBM)及5×10⁹(LFBH)。将直径6mm消毒灭菌的纸锭浸入不同浓度的 发酵乳酸杆菌SG-A95的发酵产物或不同活菌数的菌液中三秒钟后，取出纸锭 平贴于琼脂表面，置于37℃厌氧培养箱中培养24小时后，测量其抑制圈大小。

(2)肉汤稀释法(Broth dilution method)

将发酵乳酸杆菌SG-A95的30倍发酵产物透析后，调整成浓缩4倍 (LFP4)、浓缩2倍(LFP2)及1倍(LFP1)(未浓缩的发酵菌液)，另将变形链球 菌、血链球菌、牙龈卟啉菌及黏放线菌在无菌标准液态培养基(BHI broth) 培养至浊度相当于0.5比浊度的菌液，各加入50μL菌液于管中，置于37℃厌 氧培养箱中培养48小时后，以平板计数法，计算菌落数，推算样品抑菌浓度。

(3)发酵乳酸杆菌SG-A95与病原菌共同培养试验

将发酵乳酸杆菌SG-A95活菌与变形链球菌、血链球菌及牙龈卟啉菌共同 放置于试管中，37℃共同培养。分别于不同时间点取样，以平板计数法，计 算菌落数，了解样品抑制病原菌生长状况。

2.动物活体实验(in vivo study)

分设实验组及对照组。发酵乳酸杆菌SG-A95实验组分成6组：透析后的 发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物浓缩液3组，分别为浓缩4倍、浓缩2倍及1 倍(未浓缩发酵菌液)，不同菌数的发酵乳酸杆菌SG-A953组，分别为1×10⁹、 2×10⁹及5×10⁹，与对照组2组(四环霉素(tetracycline)0.267mg/mL及蒸馏 水(distilled water)。

(1)动物牙周病预防效果的评估

选用八周龄的雌性Balb/c小鼠每组12只(表二)，每日投予不同浓度的 发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物或发酵乳酸杆菌SG-A95活菌、四环霉素0.267 mg/mL或蒸馏水各1毫升，并于其下颚前牙扎上齿列矫正用钢线(ligature wire)，并于牙周组织接种牙周病致病菌变形链球菌，即为以人工方式引发牙 周组织病变的病态动物模式。此操作至全部动物牺牲为止，并观察记录其病 理表征。由牙科主治医师诊断直至对照组(喂食蒸馏水，模拟治疗组 (mock-treated group))开始牙龈出现红肿及牙菌斑出现后，解除钢线束缚， 并停止接种牙周病致病菌。于解除钢线束缚后第4、8、12、及16日，检测老 鼠牙周囊袋深度(pocket depth)，各组牺牲3只采血，并取检体进行组织学观 察。

表二、动物实验预防组的分组(注：人类使用的四环霉素剂量为每日1000 mg每75kg体重，由此推估小鼠每日使用的剂量大约为0.267mg 每20g体重)

(2)动物牙周病治疗效果的评估

选用八周龄的雌性Balb/c小鼠每组12只(表三)，于其下颚前牙扎上齿列 矫正用钢线，并于牙周组织接种牙周病致病菌变形链球菌，直至对照组牙龈 出现红肿及牙斑出现为止，即为以人工方式引发牙周组织病变的病态动物模 式。分别由牙科主治医师诊断于组织病变后，每日投予不同浓度的发酵乳酸 杆菌SG-A95发酵产物或发酵乳酸杆菌SG-A95活菌、四环霉素0.267mg/mL 或蒸馏水各1毫升，并观察记录其病理表征。于开始治疗日解除钢线束缚， 并停止接种牙周病致病菌。于解除钢线束缚后第4、8、12、及16日，检测 老鼠牙周囊袋深度，各组牺牲3只采血，并取检体进行组织学观察。

表三、动物实验治疗组的分组

(3)牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比

以对照组为标准，使用曼-怀特尼检定(Mann-Whitney test)与各组中每 个个体做检测，有显著差异的个体称为改善个体。(改善个体个数/全组个体数) ×100％＝牙周囊袋深度改善百分比。

(4)临床病理及生化检验

将未死亡动物牺牲，颈动脉取血在3000r.p.m.，4℃的条件下离心10分 钟后，取上层血清，用自动生化分析仪来检测其ALT、AST、Creatinine、BUN 生化指标。并取其重要标的脏器(肝、肾)以10％福尔马林液固定，石蜡包 埋组织切片后做H.E.染色以进行病理学观察。

3.统计分析

实验数值以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。小鼠牙周囊袋状况的 实验组与对照组间统计差异，在纵向(longitudinal)研究是采单因子变异数分 析(One-Way ANOVA)与Dunnett多重事后比较法(Dunnett multiple post hoc comparison)检测，而横断(cross-sectional)研究是以单因子变异数分析与 LSD多重事后比较法(LSD multiple post hoc comparison)检测。另外采用曼 -怀特尼检定检测牙周囊袋改善的个体数。统计显著水平的p值为0.05。

结果

1.体外实验(in vitro study)

(1)纸锭琼脂扩散试验

表四显示纸锭琼脂扩散试验的抑菌效果。无菌纸锭直径为6mm，若抑 菌圈＞6mm表示有抑菌效果，反之则无抑菌效果。培养温度及时间为37℃， 24小时，对照组为含四环霉素的纸锭，抑制圈的数值以平均值±标准差表示 (n＝3)。

表四、纸锭琼脂扩散试验的抑菌效果

  黏放线菌   牙龈卟啉菌   变形链球菌   血链球菌   LFP1   -   -   -   -   LFP2   7.0±1.0   9.2±1.0   7.6±0.9   7.7±1.0   LFP4   9.8±1.1   9.7±0.6   13.2±1.2   12.4±1.2   LFBL   10±1.0   11±1.0   9±0.5   9±0.5   LFBM   10±1.0   10±1.0   9±0.5   9±0.5   LFBH   10±1.0   10±1.0   9±0.5   9±0.5   四环霉素   48.2±2.4   33.4±2.2   29.7±2.0   25.9±1.2

表四显示发酵乳酸杆菌SG-A95浓缩2倍以上的发酵产物及活菌对于黏放 线菌、牙龈卟啉菌、变形链球菌及血链球菌这四种病原菌皆有抑制圈产生。

(2)肉汤稀释法

表五、最低抑菌浓度及抑菌百分比(100％-(试验组÷对照组)×100％)

表五显示发酵乳酸杆菌SG-A95的发酵产物浓度对于牙周致病菌48小时 处理后有不同的抑制效果，广泛而言，发酵乳酸杆菌SG-A95产物的高浓度有 较好的抑制效果。针对牙周致病菌而言，发酵乳酸杆菌SG-A95的发酵产物对 于牙龈卟啉菌的抑制效果最明显，呈现剂量依赖现象，其次为黏放线菌。发 酵乳酸杆菌的2倍以上浓缩产物对于这4株病原菌皆有抑制作用。

(3)发酵乳酸杆菌SG-A95与病原菌共同培养试验

表六、发酵乳酸杆菌SG-A95活菌(简称LF)与变形链球菌共同培养， 抑制病原菌生长情形。

表六显示发酵乳酸杆菌SG-A95活菌与变形链球菌共同培养，不管是低菌 数组(7次方)、中菌数组(8次方)或高菌数组(9次方)，于共同培养48小 时内皆无变形链球菌病原菌存在，可见其皆有抑制变形链球菌生长的效果。

表七、发酵乳酸杆菌SG-A95活菌与血链球菌共同培养，抑制病原菌生长情 形。

表七显示发酵乳酸杆菌SG-A95活菌与血链球菌共同培养，高菌数组(9 次方)于共同培养10小时，已无血链球菌病原菌存在，中菌数组(8次方) 与低菌数组(7次方)于共同培养14小时，已无血链球菌病原菌存在，可见 其皆有抑制血链球菌生长的效果。

表八、发酵乳酸杆菌SG-A95活菌与牙龈卟啉菌共同培养，抑制病原菌 生长情形。

表八显示发酵乳酸杆菌SG-A95活菌与牙龈卟啉菌共同培养，高菌数组(9 次方)于共同培养6小时，已无牙龈卟啉菌病原菌存在，中菌数组(8次方) 于共同培养8小时，已无牙龈卟啉菌病原菌存在，低菌数组(7次方)于共同 培养14小时，已无牙龈卟啉菌病原菌存在，可见其皆有抑制牙龈卟啉菌生长 的效果。

2.动物活体实验(in vivo study)

(1)动物牙周病预防效果的评估

表九、发酵乳酸杆菌SG-A95预防组(pLF)的小鼠其牙周囊袋深度(mm) (单因子变异数分析与Dunnett多重事后比较法)在不同时间点，各 组与对照组(pMT)的比较。(^＊p＜0.05；^＊＊p＜0.01)

  第4天   第8天   第12天   第16天  pLFP1   0.79±0.44^**  0.75±0.27^**  0.42±0.35^**  0.35±0.21^** pLFP2   0.77±0.31^**  1.21±0.64^**  0.80±0.81^**  1.25±0.35^** pLFP4   1.04±0.66^**  0.79±0.26^**  0.48±0.29^**  0.30±0.17^** pLFBL   1.33±0.44^**  1.17±0.55^**  0.83±0.41^**  0.67±0.29^** pLFBM   1.08±0.67^**  0.83±0.43^**  0.57±0.36^**  0.33±0.15^** pLFBH   1.00±0.50^**  0.84±0.41^**  0.38±0.16^**  0.25±0.70^** pTC   0.84±0.50^**  0.70±0.34^**  0.56±0.26^**  0.49±0.25^** pMT   2.22±1.07   2.16±1.25   2.75±1.32   2.21±0.64

评估预防组发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物及活菌数，各组喂食不同浓度 样品对于牙周囊袋深度的影响，在不同时间点各组对于喂食蒸馏水的对照组 (pMT)在所有的时间点皆有显著差异。喂食四环霉素的预防对照组(pTC) 在所有的时间点皆有显著差异。

表十、发酵乳酸杆菌SG-A95预防组(pLF)的小鼠的牙周囊袋深度 (mm)(单因子变异数分析与LSD多重事后比较法)，各浓度组别在 不同时间点与第4天比较。(^＊p＜0.05；^＊＊p＜0.01)。

  pLFP1   pLFP2   pLFP4   pLFBL   pLFBM   pLFBH   pTC   pMT   第4天   0.79±   0.44   0.77±   0.31   1.04±   0.66   1.33±   0.45   1.08±   0.67   1.00±   0.50   0.84±   0.50   2.22±   1.07   第8天   0.75±   0.27   1.21±   0.64   0.79±   0.26   1.17±   0.55   0.83±   0.43   0.84±   0.41   0.70±   0.34   2.16±   1.25   第12天   0.42±   0.35   0.80±   0.81   0.48±   0.29^*  0.83±   0.43   0.57±   0.36   0.38±   0.16^*  0.56±   0.26^*  2.75±   1.32   第16天   0.35±   0.21   1.25±   0.35   0.30±   0.17^*  0.67±   0.29   0.33±   0.15   0.25±   0.70^*  0.49±   0.25^*  2.21±   0.64

发酵乳酸杆菌SG-A95预防组发酵产物与活菌数各浓度组别，在不同时间 点的组内比较，4倍(pLFP4)浓度、高浓度活菌组(pLFBH)及四环霉素组 (pTC)在12天及16天牙周囊袋的改善程度与第4天比较有显著差异。

(2)动物牙周病治疗效果的评估

表十一、发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLF)的小鼠其牙周囊袋深度 (mm)(单因子变异数分析与Dunnett多重事后比较法)在不同 时间点，各组与对照组(tMT)的比较。(^＊p＜0.05；^＊＊p＜0.01)

  第4天   第8天   第12天   第16天   tLFP1   0.71±0.38^**  1.19±0.62   1.00±0.61^**  0.75±0.35^*  tLFP2   1.23±0.66^**  1.78±0.71   0.92±0.20^**  0.73±0.46^*  tLFP4   1.04±0.58^**  0.83±0.50^*  0.67±0.41^**  0.30±0.17^**  tLFBL   1.33±0.62^**  1.28±1.15   0.68±0.72^**  0.57±0.40^**  tLFBM   1.96±0.96   1.75±0.80   1.00±0.50^**  1.50±0.71   tLFBH   1.42±0.79^*  0.83±0.43^*  0.33±0.31^**  0.30±0.17^**  tTC   1.05±0.64^**  0.89±0.44^**  0.63±0.37^**  0.48±0.33^**  tMT   2.10±0.63   1.91±0.89   2.10±0.97   2.00±0.92

评估治疗组发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物及活菌数，各组喂食不同浓度 对于牙周囊袋深度的影响，不同时间点各组间都有显著差异。在每个时间点 与对照组(tMT)比较，4倍浓度组(tLFP4)、高浓度活菌组(tLFBH)及四 环霉素组(tTC)在每个时间点皆有显著差异。喂食1倍及2倍发酵产物的组 (tLFP1与tLFP2)及低浓度活菌组(tLFBL)，除了第8天，其余时间点皆有 显著差异。中浓度活菌组(tLFBM)只有在第12天有显著差异。

表十二、发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLF)的小鼠其牙周囊袋深度(mm) (单因子变异数分析与LSD多重事后比较法)各浓度组别在不同时 间点与第4天比较(^＊p＜0.05；^＊＊p＜0.01)。

  pLFP1   pLFP2   pLFP4   pLFBL   pLFBM   pLFBH   pTC   pMT   第4天   0.71±   0.38   1.23±   0.66   1.04±   0.58   1.33±   0.63   1.96±   0.96   1.42±   0.79   1.05±   0.64   2.10±   0.63   第8天   1.19±   0.62   1.78±   0.71^*  0.83±   0.50   1.28±   1.15   1.75±   0.80   0.83±   0.43^*  0.89±   0.44   1.91±   0.89   第12天   1.00±   0.61   0.92±   0.20   0.67±   0.41   0.68±   0.72   1.00±   0.50   0.33±   0.31^**  0.63±   0.37^**  2.10±   0.97   第16天   0.75±   0.35   0.73±   0.46   0.30±   0.17   0.57±   0.40   1.50±   0.71   0.30±   0.17^**  0.61±   0.34^**  2.00±   0.92

治疗组喂食发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物及活菌数的各组，在不同时间 点的组内比较，高浓度活菌组(tLFBH)第8、第12及第16天(与第4天比 较)有显著差异，而四环霉素组(tTC)第12及第16天有显著差异。

(3)牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比

表十三、发酵乳酸杆菌预防组SG-A95(pLF)牙周囊袋改善百分比(与 预防组中无处理对照组(pMT)比较有显著差异(曼-怀特尼检定， p＜0.05)改善的个体百分比)。

  第4天   第8天   第12天   第16天   pLFP1   64％   50％   80％   100％   pLFP2   40％   29％   75％   50％   pLFP4   42％   33％   67％   67％   pLFBL   8％   11％   33％   67％   pLFBM   42％   22％   67％   100％   pLFBH   36％   25％   80％   100％   pTC   62％   50％   71％   100％   pMT   -   -   -   -

发酵乳酸杆菌SG-A95预防组牙周囊袋深度改善百分比在第16天，除了 2倍与4倍浓度组及低浓度活菌组(pLFP2、pLFP4与pLFBL)外，各组皆 达到100％。

表十四、发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组(tLF)牙周囊袋改善百分比(与 无治疗对照组(tMT)比较有显著差异(曼-怀特尼检定，p＜0.05)改 善的个体百分比)。

  第4天   第8天   第12天   第16天   tLFP1   58％   22％   40％   50％   tLFP2   17％   0   17％   33％   tLFP4   42％   22％   83％   100％   tLFBL   8％   44％   67％   67％   tLFBM   9％   13％   40％   0   tLFBH   17％   33％   83％   100％   tTC   30％   20％   47％   33％   tMT   -   -   -   -

发酵乳酸杆菌SG-A95治疗组，除中浓度活菌组外，在第16天皆有 33％～100％的改善率。

(4)临床病理检验

喂食SG-A95发酵产物或活菌数最高浓度的各组在第16天的肝、肾组织 切片(图2～图5与图10～图13)，显示各组肝及肾组织细胞无显著毒性伤害的 表征，无发炎细胞浸润，与无治疗对照组(tMT或pMT)(图6～图9与图14～ 图17)相较之下无明显差异。

结论

在体外实验的纸锭琼脂扩散试验可以知道，发酵乳酸杆菌SG-A95浓缩2 倍以上的发酵产物对于这四种病原菌皆有抑制圈产生，活菌不管是1×10⁹(LFBL)、2×10⁹(LFBM)或5×10⁹(LFBH)对于黏放线菌、牙龈卟啉菌、变形链 球菌、血链球菌四种牙周致病菌皆有9-10mm的抑制圈产生。在肉汤稀释法 试验中，显示发酵乳酸杆菌SG-A95的发酵产物浓度对于牙周致病菌有不同程 度的抑制效果。共同培养的数据显示，发酵乳酸杆菌SG-A95活菌对于牙龈卟 啉菌抑制效果最好，而对于变形链球菌、血链球菌亦有抑制的作用，且活菌 数愈高抑制效果愈好。

牙周病动物模型活体实验显示发酵乳酸杆菌SG-A95的发酵产物及活菌 对于牙周状况的改善，预防的效果优于治疗的效果。就预防效果而言，各组 喂食不同浓度对于牙周囊袋深度的影响，在不同时间点各组对于对照组 (pMT)皆有显著差异的改善。而治疗效果部分，以发酵产物4倍浓度组 (tLFP4)、高浓度活菌组(tLFBH)表现最好。

喂食发酵乳酸杆菌SG-A95发酵产物或活菌数最高浓度的各组，在第16 天动物牺牲时取出肝肾组织进行病理切片，显示各组肝及肾脏组织细胞，无 显著毒性伤害的表征，表示安全性极高。

结合体外及动物活体实验，显示发酵乳酸杆菌SG-A95的发酵产物及活菌 能预防牙周炎的产生并改善牙周发炎的状况。

序列表

<110>生展生物科技股份有限公司

 

<120>改善口腔内细菌群的发酵乳酸杆菌SG-A95及其保健组合物

 

<160>1

 

<210>1

 

<211>1113

 

<212>DNA

 

<213>发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)

 

<220>

 

<221>misc_feature

 

<222>(1)...(1573)

 

<400>1

ggacgtgcga gtgctataca tgcaagtcga acgcgttggc ccaattgatt gatggtgctt     60

gcacctgatt gattttggtc gccaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc    120

tgcccagaag cgggggacaa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa cagcgttgtt    180

cgcatgaaca acgcttaaaa gatggcttct cgctatcact tctggatgga cctgcggtgc    240

attagcttgt tggtggggta acggcctacc aaggcgatga tgcatagccg agttgagaga    300

ctgatcggcc acaatgggac tgagacacgg cccatactcc tacgggaggc agcagtaggg    360

aatcttccac aatgggcgca agcctgatgg agcaacaccg cgtgagtgaa gaagggtttc   420

ggctcgtaaa gctctgttgt taaagaagaa cacgtatgag agtaactgtt catacgttga   480

cggtatttaa ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt   540

ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagagagtgc aggcggtttt ctaagtctga   600

tgtgaaagcc ttcggcttaa ccggagaagt gcatcggaaa ctggataact tgagtgcaga   660

agagggtagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag   720

tggcgaaggc ggctacctgg tctgcaactg acgctgagac tcgaaagcat gggtagcgaa   780

caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaggtg ttggagggtt   840

tccgcccttc agtgcccgga gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca   900

aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt   960

cgaagctacg cgagacctta ccagtctgac atcttgcgca accctagaga tagggcgttc  1020

cttcgggacg catgacagtg tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt  1080

agtcccgcaa cgagcgcacc cctcgtttac tag                               1113