用于生产抗淀粉状蛋白β肽抗体的含有D-肽的组合物

摘要

本发明涉及包含D-肽或抗体的组合物，其用作治疗剂和/或用于疾病预防，其中a)所述D-肽与淀粉状蛋白肽相互作用和b)所述抗体结合a)中的D-肽并且还结合a)中的淀粉状蛋白肽。

说明书

本发明涉及包含D-肽或抗体的组合物，其在疾病的治疗中用作治疗剂，在所述疾病中异常的蛋白质聚集或蛋白质多聚化起作用。本发明还涉及制备此组合物的方法及其用途。

蛋白质聚集疾病或淀粉样变性是临床状态的异类组，其具有的共同标准是(在许多情况下，但不唯独的)：特异于各情形的蛋白质以β折叠片结构的有序构象在细胞外(全身性地或局部地)沉积。该蛋白质聚集疾病或蛋白质错折叠疾病的组也包括阿尔茨海默病。阿尔茨海默病(拉丁语：Morbus Alzheimer)作为神经退行性病症，以其最常见的形式出现在年龄为65岁以上的人中。它的发病机制被表征为认知能力的损伤，其通常伴随着日常活动的减少，带有行为上的显著问题和神经心理学症状。晚期的患者忘记长期已知的技能并不再识别与他们亲近的人。从统计学角度来看，诊断为阿尔茨海默病后的预期寿命平均为约7到10年。

Ferri等人显示，在2005年，约2千4百万人患有痴呆，其中约60％归因于阿尔茨海默病(Ferri等人，Lancet.366，no.9503，2005，2112-7页)。阿尔茨海默病是目前最常见的痴呆疾病，对于该病，目前为止(2008年10月)不存在有效的疗法。

阿尔茨海默病的病理学特征(其甚至在首个临床症状之前就可以被确定)是斑块(称为阿尔茨海默原纤维)。这些蛋白质聚集物主要由错误折叠的淀粉状蛋白β肽(也已知为Aβ肽或淀粉状蛋白β肽)组成，并且沉积在阿尔茨海默病患者的脑中(Walsh和Selkoe；2007，Journal ofNeurochemistry 101：1172-1184)，并且是脑中淀粉状蛋白β肽的成簇增加的结果。然而，淀粉状蛋白质β肽原纤维只是下述过程的最终阶段，所述过程以单体淀粉状蛋白β肽从APP(淀粉状蛋白前体蛋白质)分裂开始，然后形成神经毒性的淀粉状蛋白β肽寡聚体，然后才以淀粉状蛋白β肽原纤维结束。

为了防止淀粉状蛋白β肽成簇，有以淀粉状蛋白β肽片段作为免疫原的主动和被动免疫作为实验性治疗。

实验性治疗是在淀粉状蛋白β肽聚集物的体外模型中、在产生淀粉状蛋白β肽的细胞模型中、以及在脑中形成淀粉状蛋白β肽聚集物的转基因小鼠模型中进行的。更特别地，主动和被动免疫作为疗法在淀粉状蛋白β肽聚集物的转基因小鼠模型中进行(Schenk等人，Nature，1999；Bard等人，2003)。在主动免疫的首次描述中，使用了全长L-淀粉状蛋白β肽作为免疫原，并在免疫的情况下引起了阿尔茨海默病小鼠模型中斑块的清除(Schenk等人，Nature，1999)。在类似的小鼠模型中，也成功地应用了被动免疫。从而可见，淀粉状蛋白β肽1-11区域中的N末端表位在引起淀粉状蛋白β肽原纤维的脑清除中特别有效(Bard等人，2003，PNAS 100(4)：2023-2028)。目前在阿尔茨海默病患者中进行两个被动免疫(即抗体/抗体片段)的研究(Brody和Holtzman；2008，Annual Reviews in Neuroscience 31：175-193)。

在动物实验中成功地测试了免疫，但人中的主动免疫导致了T细胞介导的自身免疫应答或自身免疫疾病，其中内源性免疫系统在患者脑中引起了脑膜脑炎(Brody和Holtzman；2008，Annual Reviews inNeuroscience 31：175-193)。因此，利用淀粉状蛋白β肽片段的主动免疫目前被认为有很小的前景。

Bard等人(PNAS 100(4)：2023-2028)、Dodel等人(2002；Ann Neurol 52：253-256)描述了用于被动免疫治疗的抗淀粉状蛋白β肽的抗体，并且Gardberg等人(PNAS104(40)：15659-15664)在2007年描述了抗淀粉状蛋白β肽的氨基酸1-8的抗体。

用完整的(1-42)纤维化淀粉状蛋白β肽免疫老的猎犬狗也被例如，Head等人所描述(2008；The Journal of Neuroscience 28(14)：3555-3566)。然而，狗和人之间在利用淀粉状蛋白β肽作为免疫原方面有严重的差异，因为与人相反，狗不表现对抗性的自身免疫应答。

Cribbs等人(1997；The Journal of Biological Chemistry 272(11)：7431-7436)研究了淀粉状蛋白β肽的机理，并且利用了完整的淀粉状蛋白β肽以及截短型淀粉状蛋白β肽(氨基酸1-42或25-35)的D-和L-异构体。Esler等人同样地研究了立体特异性。Orser等人(US2008，0171341A1)显示了利用对应于待检测靶蛋白的序列来检测具有改变的构象的蛋白质/朊病毒。

Willbold等人(WO 02/081505 A2)表明了应用噬菌体展示来鉴定结合Ass肽的氨基酸序列。Findeis等人(US 6,689,752 B2)研究了由3-5个氨基酸组成的序列对于淀粉状蛋白β肽的聚集的影响。

Cribbs等人从他们的结果中推断，神经毒性不是立体异构特异的。然而，没有进行免疫应答的测试，但是参考了D-异构体的更低的免疫原性。

Geylis等人描述了获得自健康人的细胞系(所述细胞系合成结合淀粉状蛋白β肽的氨基酸1-16的抗体)，并且讨论了其在被动免疫中的用途。Lee等人(2005；American Neurological Association 58：430-435)比较了在淀粉状蛋白β肽免疫后，患有或不患有脑膜脑炎的人的抗体血清。此研究的结果是该抗体主要针对淀粉状蛋白β肽的氨基酸1-8。

因此，本发明的任务是提供在蛋白质聚集/错折叠疾病的预防性治疗或疗法中用作治疗剂的组合物。所述组合物应当能够用于抵抗阿尔茨海默病和其它蛋白质聚集疾病的主动免疫方法中。由此，应该将实现在避免T细胞免疫应答时选择性地唤起B细胞免疫应答。

根据本发明，通过将包含D-肽或抗体的组合物用作治疗剂和/或用于疾病预防解决了上述任务，其中a)所述D-肽与淀粉状蛋白β肽相互作用，和b)所述抗体与a)中的D-肽结合，并且还与a)中的淀粉状蛋白β肽结合。

所以所述组合物包含作为免疫原的D-肽，其与淀粉状蛋白β肽相互作用并引起抗-淀粉状蛋白β肽抗体的抗体形成。所述组合物还可以包含与淀粉状蛋白β肽相互作用的抗体，其中此抗体结合前述D-肽，并且还结合淀粉状蛋白β肽。D-肽和淀粉状蛋白β肽之间的“相互作用”是蛋白质-蛋白质相互作用。

根据本发明的“组合物”可以是例如疫苗，药物(例如，以片剂形式)，注射溶液，食品或食物补充剂。根据本发明的组合物可以仅由D-肽组成或仅由抗体组成，结合各应用所需的助剂，如盐(例如铝盐)，缓冲液，或溶剂。

相对于现有技术的其它优势有：

-免疫原的低分子量

-没有T细胞应答(细胞自身免疫)，并且因而显著更少的副作用

-使用少量的所述组合物就足够，因为免疫原被延迟降解

-免疫原的修饰或组合是简单的。

通过本发明的组合物，利用D-肽的免疫导致产生淀粉状蛋白β肽特异性抗体。利用来自D-肽的、不同于淀粉状蛋白β肽的免疫原的这一免疫优于淀粉状蛋白β肽免疫原，因为引起了抗淀粉状蛋白β肽的抗体应答，而没有同时的、引起副作用的抗-淀粉状蛋白β肽T细胞免疫应答。

“免疫”指产生抗确定抗原的免疫应答，目标是清除此抗原、中和它、和/或另外地使它对生物体无害。主动免疫：引入抗原(通常是肽序列)，从而产生的内源性免疫应答，其引起所述抗原、以及主要是相关抗原的清除。

“被动免疫”指肠胃外引入抗体，其引起抗原的清除。

根据本发明的组合物可以通过抗体与淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域的结合来防止淀粉状蛋白β肽多聚体的形成，其中所述抗体是在用D-肽免疫后形成的。

在本发明的意思中，“淀粉状蛋白β肽多聚体”指获得了新功能(“功能的获得”)的多个淀粉状蛋白β肽分子的稳定集合。

术语“多聚化结构域”定义了涉及淀粉状蛋白β肽彼此相互作用的那些淀粉状蛋白β肽的结构域。在一个变体中，淀粉状蛋白β肽的氨基酸10-42实现此功能。

其它的适应征领域是在阿尔茨海默病，糖尿病，和其它淀粉状蛋白疾病，以及其中蛋白质同源多聚化是关键的疾病(例如帕金森病，额颞叶型失智症，肌萎缩侧索硬化症，囊性纤维化，某些形式的癫痫)的治疗中的用途。

本发明的其它主题是组合物，其中D-肽

a)包含淀粉状蛋白β肽或淀粉状蛋白β肽亚片段的逆-反序列并且完全由D-氨基酸组成，和/或

b)结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域，和/或

c)包含序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2并完全由D-氨基酸组成，和/或

d)包含具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的D-肽，其中所述具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的D-肽部分地包含L-氨基酸，和/或

e)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2同源的序列。

在一个变体中，“D-肽”由淀粉状蛋白β肽或淀粉状蛋白β肽亚片段的逆-反序列组成并完全由D-氨基酸组成。

“亚片段”由与淀粉状蛋白β肽的氨基酸序列同源的3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，或更多的氨基酸组成。

在另外的变体中，根据本发明的D-肽结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域。在其他变体中，D-肽具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2并且完全由D-氨基酸组成。在另外的变体中，D-肽具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2且部分地包含L-氨基酸。在另外的变体中，D-肽具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的同源序列。“D-肽”指由D-型的氨基酸构成的肽。

“部分地”包含L-氨基酸指与由D-氨基酸组成的D-肽的氨基酸序列同源的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多的氨基酸各自被L-构象的相同氨基酸替代。

在本发明的意思中，“同源序列”指与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少70％，75％，80％，特别优选地85％，90％，特别是91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性的氨基酸序列。与由D-氨基酸组成的根据本发明的序列同源的序列也可以部分地包含L氨基酸。在本说明书中同义地使用术语“同源的”或“同源性”来替代术语“同一性”。在基于Smith，T.F.和Waterman，M.S.的算法(Adv.Appl.Math.2：482-489(1981))的程序BESTFIT的辅助下通过比较来计算两个核酸序列或多肽序列之间的同一性，对于氨基酸设置下列参数：缺口制造惩罚为8和缺口延伸惩罚为2；以及对于核酸设置下列参数：缺口制造惩罚为50和缺口延伸惩罚为3。优选地，两个核酸序列或多肽序列之间的同一性是通过跨越各整个序列长度的核酸序列/多肽序列的同一性而确定的，正如是在基于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(J.Mol.Biol.48：443-453)的算法的程序GAP的辅助下通过比较而计算的，对于氨基酸设置下列参数：缺口制造惩罚为8和缺口延伸惩罚为2；以及对于核酸设置下列参数：缺口制造惩罚为50和缺口延伸惩罚为3。

这些同源的D-肽与淀粉状蛋白β肽结合和/或与淀粉状蛋白β肽多聚化结构域结合。它们可以是从淀粉状蛋白β肽衍生的(同源的)，并且在功能上是确定的，即能够引起至少与淀粉状蛋白β肽相同的免疫应答。然而，它们不是淀粉状蛋白β肽本身，并且在小鼠中产生抗淀粉状蛋白β肽和/或淀粉状蛋白β肽多聚体的抗体应答。

根据本发明，术语“逆-反肽”(“Retro-inverses Peptid”或“Retro-inverso Peptid”)表示由D-型的氨基酸构成的肽(逆：α碳原子的手性与L型相逆)，其中原肽的序列顺序也被倒转了(retro＝反向，也见Regenmortel和Muller，1998；Current Opinion in Biotechnology9：377-382)。

本发明另外的主题是包含抗体的组合物，其中所述抗体结合淀粉状蛋白肽或淀粉状蛋白β肽并且

a)结合淀粉状蛋白β肽或淀粉状蛋白β肽亚片段的逆-反序列，和/或

b)结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域并且还结合淀粉状蛋白β肽，和/或

c)结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其同源序列。

有利地，如果对于产生抗体使用的是结合淀粉状蛋白β肽多聚化结构域的肽，那么所述抗体具有淀粉状蛋白β肽本身的特性并且与淀粉状蛋白β肽的多聚化竞争。

本发明另外的主题是制备根据本发明的组合物的方法，其中通过免疫动物或动物细胞并将动物细胞与骨髓瘤细胞融合以及随后的选择和培养来获得产生抗体的杂交细胞，并且分离和纯化抗体。

免疫，融合，选择，培养产生抗体的杂交细胞和抗体分离或抗体纯化可以例如使用“Monoclonal antibodies”(Heddy Zola.SpringerVerlag，New York 2000)中所示的方法和本领域技术人员已知的方法来进行。其他的方法，特别是用于筛选产生抗体的细胞的方法已经由Korth等人，1999，在“Methods in Enzymology”309：106f中显示了。

对于免疫，可以使用动物(或动物细胞)，例如，小鼠，兔子，大鼠，豚鼠，以及常规用于抗体生产的其它动物。如果选择小鼠用于以根据本发明的组合物进行免疫，免疫策略可以如下：可皮下注射所述组合物(例如，三次；第0天：完全弗氏佐剂；第21和22天：不完全弗氏佐剂；第31天抽取约100μl的血液)。在用根据本发明的组合物进行一次或多次加强注射后，例如，在第50天将小鼠麻醉、断头、并取出脾脏。将如此获得的脾脏细胞(脾细胞)与小鼠骨髓瘤细胞以1∶5的比例混合，并通过加入50％的聚乙二醇(PEG)融合(8分钟，室温)。然后，洗涤细胞并过夜培养。生产抗体的杂交瘤细胞的选择例如可以在HAT培养基中、在96孔微量滴定板中以及在ELISA酶测试中进行。

本发明另外的主题是根据本发明的组合物在防止淀粉状蛋白β肽多聚体中的用途。为此可使用结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域的抗体或者D-肽。

在根据本发明的一个变体中，所述组合物包含10-1000μg的免疫原。在另一个变体中，所述组合物包含20-900，25-750，30-600，40-500，50-400，50-300或50-250μg的免疫原。可以设想组合物包含少于10μg的免疫原或者多于1000μg的免疫原。

优选地，“免疫原”指产生免疫性的抗原。免疫原是触发免疫应答的物质。因此，免疫原不同于被抗体识别、但并不是全部都能独立触发免疫应答的抗原。

优选地，“免疫性”指免疫系统针对抗原(例如，病毒，细菌，或外来蛋白质)的改变的反应预备状态，其是由免疫引起的并且特征在于特异性抗体和/或细胞的出现。

本发明另外的主题是根据本发明的组合物在预防和/或治疗阿尔茨海默病中的用途。因此，结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域的D-肽可以用于生产预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。

本发明另外的主题是根据本发明的包含D-肽的组合物作为治疗剂和/或用于阿尔茨海默病的疾病预防的用途，其中所述D-肽

a)包含淀粉状蛋白β肽或淀粉状蛋白β肽亚片段的逆-反序列，并且完全由D-氨基酸组成，和/或

b)结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域，和/或

c)包含序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2并且完全由D-氨基酸组成，和/或

d)包含序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，其中具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的D-肽部分地包含L-氨基酸，和/或

e)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2同源的序列。

本发明另外的主题是根据本发明的包含抗体的组合物作为治疗剂和/或用于阿尔茨海默病的疾病预防或诊断的用途，其中所述抗体

a)结合淀粉状蛋白β肽或淀粉状蛋白β肽亚片段的逆-反序列，和/或

b)结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域并且也结合淀粉状蛋白β肽，和/或

c)结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其同源序列。

本发明另外的主题是包含抗体的组合物用于阿尔茨海默病的诊断，用于生物分子的检测或定量，或用于组织、细胞中生物分子的定位，或者参与特定细胞类型的识别中的用途，其中所述抗体

a)结合淀粉状蛋白β肽或淀粉状蛋白β肽亚片段的逆-反序列并且还结合淀粉状蛋白β肽，和/或

b)结合淀粉状蛋白β肽的多聚化结构域，和/或

c)结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其同源序列，并且还结合淀粉状蛋白β肽。

在本发明的意思中，生物分子的检测或定量在本申请中指通过抗原-抗体反应(例如，免疫测定)测定物质。

在本发明的意思中，组织或细胞中生物分子的定位或特定细胞类型的识别在此指抗体在例如免疫组织化学或免疫细胞化学中的用途。

本发明的优势是引起了治疗性的抗体应答而与此同时所使用的D-肽没有被T细胞加工。

因此，发明了方法，其使得能够容易地开发抗蛋白质聚集疾病或蛋白质构象疾病的免疫策略。因此，在与阿尔茨海默病的治疗相关的方法(其中使用与淀粉状蛋白β肽相互作用的D-肽进行免疫)中，能够在个体中实现中和淀粉状蛋白β肽毒性和/或清除淀粉状蛋白β肽的体液免疫应答。此外，可以开发涉及阿尔茨海默病以外的疾病(CNS的蛋白质构象疾病，糖尿病等)的方法，在所述疾病中蛋白质的聚集或多聚化同样是疾病相关的，并且在所述方法中使用了结合多聚化接触面的D-肽。

优选地，“清除(clearing)”、“清除(clearance)”或“清除(clearend)”指从作为器官的特定功能的组织中(例如，肾清除)、从细胞成分中(例如，巨噬细胞，小胶质细胞)，或从亚细胞区室中(蛋白酶体)除去特定的外源或内源性物质。

本发明的其它优点还在于抛弃了淀粉状蛋白β肽的表位空间(“epitope space”)，这在原则上能够以高的自身耐受性限制体液免疫应答。在根据本发明的、结合淀粉状蛋白β肽的D-肽的用途中，T细胞免疫应答被抑制，因为这些肽不能被降解和展示。

本发明的主题还是针对淀粉状蛋白β肽多聚化结构域并且防止淀粉状蛋白β肽的多聚化的抗体。而后，通过以抗体进行的标记，淀粉状蛋白β肽或集合的淀粉状蛋白β肽沉积物可以通过内源免疫系统被降解。其他根据本发明的抗体一般性地针对淀粉状蛋白β肽而非特异性地针对所述多聚化结构域。

实施例

下面借助实施例和附图更详细地描述本发明。

图1显示了合成的淀粉状蛋白β肽(1)、和用APP转染的CHO细胞(3)；不相关的对照(2)的蛋白质印迹。这一蛋白质印迹表明9A6在蛋白质印迹上不识别APP或淀粉状蛋白β肽(左侧)，而通用的抗淀粉状蛋白β肽抗体IC16却能够识别(右侧)。

图2显示了从用APP永久转染的、分泌淀粉状蛋白β肽的CHO细胞的上清液中由IC16(右侧)和9A6(右侧)免疫沉淀的蛋白质印迹。可见9A6识别淀粉状蛋白β肽寡聚物。

图3显示了用9A6对阿尔茨海默病患者的皮质样品进行的免疫组织化学染色。可见9A6抗体微弱地识别淀粉状蛋白β肽斑块。

实施例1(用D3-肽免疫小鼠)

用D-肽免疫小鼠。利用D3-肽和淀粉状蛋白β肽的逆-反肽(riAbeta1-16；逆-反-Abeta(1-16))。在多次加强注射(加强注射(Auffrischungsimpfungen)，加强效果)后，根据标准方法进行融合以生产单克隆抗体。可以分离结合D3，riAbeta1-16，和结合淀粉状蛋白β肽的单克隆抗体。因此，用所述的D-肽免疫导致抗淀粉状蛋白β肽的保护性免疫应答。

优选地，“加强效果”(通过加强注射或加强注射(Auffrischungsimpfung)实现)指在与抗原重复接触后的免疫学继发反应或增强的免疫应答。

用于免疫的肽具有下列序列：

“D3”肽：                  rprtr Ihthr nr(SEQ ID NO：1)

retro-inverso-Abeta(1-16)： kqhhv eygsd hrfea d(SEQ IDNO：2)

将D3与KLH(匙孔血蓝蛋白)共价键合(交联)并利用标准程序免疫小鼠。然后根据标准方案将其与小鼠骨髓瘤细胞融合。然后，在标准的ELISA中测试所产生的骨髓瘤细胞的细胞培养上清液对于D3-肽和淀粉状蛋白β肽的识别。

下面的克隆只识别D3(不识别淀粉状蛋白β肽)：

4G11，13H11，32A11，40B7

下面的克隆既识别D3也识别淀粉状蛋白β肽：

9A6，14B5，39B12

这些实验显示

1.用D3进行的免疫引起了抗淀粉状蛋白β肽的抗体应答和

2.在某些抗体上存在结合位点，其既能够识别淀粉状蛋白β肽也能够识别D3。

在图1、图2和图3所示的测试中进一步对示例性研究的抗-D3/抗淀粉状蛋白β肽抗体9A6进行了测试。