防御素mNP-1及其在制备抗流感病毒药物中的应用

摘要

本发明利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素对禽流感病毒H5N1和H9N2有很强的抑制或杀灭作用。本发明的结果可应用于制备抗流感病毒药物。

说明书

技术领域

本发明涉及防御素及其在制备抗流感病毒药物中的应用。具体地，涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1，及其在制备抗流感病毒药物中的应用。

背景技术

防御素的结构特点及分类

防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点：(1)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加里福尼亚大学Lehrer教授对其命名以来(Selsted et al.，1985)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类：α防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类：α防御素、β防御素和θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6个保守的半胱氨酸形成了3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5；β防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素——由18个氨基酸残基组成的环状θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。

防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即HNP1-4主要产生于粒细胞，2种HD5-6主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个β-防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β-防御素基因。防御素的表达与病源体的入侵是紧密相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。

到目前为止，分离到的兔防御素有9个，其中7个为α防御素：NP-1，NP-2，NP-3a，NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个兔防御素：RK-1和RK-2，产生于兔肾细胞。α-防御素NP-1比人防御素HNP-1的抗菌活性强5～10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质：在NP-1分子中含有9个净正电荷，而在HNP-1分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1，NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-1由33个氨基酸组成，属于α-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为1-6，2-4，3-5(Ganz，1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。

禽类是人畜共患疾病病原体的重要传播源。人类病原体，如沙门氏菌和弯曲杆菌属，驻留在鸡肠道内可能不会引起临床症状，但是引起食物中毒的主要原因(Helms et a1.，2006；Kessel et al.，2001)。家养禽类也是一个禽流感病毒(Influenza A Virus，IAV)亚型的重要传播源，威胁到动物和人类健康(如H5N1)，并涉及到定期在亚洲暴发的流感的再次发生(Kung etal.，2007)。因此，如果家养禽类的先天性免疫获得提高，那么动物健康和公共健康将大大受益，甚至能阻止人畜共患病原体的增值和蔓延。

家禽先天免疫的提高主要依靠防御素，防御素是一大族具有广谱抗细菌，真菌，原生动物和被膜病毒等微生物活性的阳离子小肽(Zasloff，2002)。防御素除了直接的抗菌活性外，还具有免疫调节作用，防御素可选择性聚集单核细胞，T淋巴细胞，树突状细胞和肥大细胞趋化到炎症部位以促进适应性免疫(Territo et al.，1989；Chertov et al.，1996；Yang et al.，1999；Niyonsaba et al.，2002)。此外，防御素还能诱导腹腔肥大细胞释放组胺和提高巨噬细胞的吞噬作用(Befus et al.，1999；Fleischmann et al.，1985；Ichinose et al.，1996)。抗炎症的特性已被归因于防御素，如抑制多核型白细胞甲酰肽受体介导的炎症和结合细菌内毒素(Grutkoski et al.，2003；Motzkus et al.，2006)。此外，防御素可诱导成纤维细胞和上皮细胞的增殖以促进伤口的修复(Murphy et al.，1993；Aarbiou et al.，2002，2004)。在禽流感物种，特别是鸡形目中，发现了几个β-防御素，而在系统发育上较古老的脊椎动物中还未发现存在α防御素和θ防御素，如禽类和鱼类，这暗示所有防御素亚家族一定是从一个祖先β-防御素基因通过重复和多样化进化而来的(Semple et al.，2003)。

防御素抗微生物机理

在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。防御素的抗菌作用机理为：它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-1形成瞬时的，人防御素HNP-1形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。正是由于这种特殊的作用机理，目的微生物难以产生抗防御素的抗性突变，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类。

不同防御素的抗微生物活性

由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差别。各种α-防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100μg/ml之间(Patterson Delafied et al.，1980，1981；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989；Selsted et al.，1984，1985c，1987，1992；Ganz，1985a；Segal et al.，1985；Daher et al.，1986；Levitz et al.，1986；Shafer et al.，1988；Eisenhauer et al.，1989；Yamashita and Saito，1989；Cullor et al.，1990，1991；Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990b；Borenstein et al.，1991a，1991b；Kohashi et al.，1992；Ogata et al.，1992；Nakashima，1993)。与其它抗微生物肽相比，防御素具有更广的抗性谱，尤其是兔防御素NP-1，NP-2，不但抗性谱广，抑菌活性也较强。

1985年，Lehrer等首次发现兔MCP-1和MCP-2(现名分别为，兔防御素NP-1和NP-2)在体外对1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1，HSV-1)具有中和活性作用，而4个结构同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5对HSV-1无效。兔防御素NP-1和NP-2对单纯疱疹病毒的灭活作用依赖于肽浓度以及肽与HSV-1孵育的时间，温度和pH。2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus)，流感病毒A/WSN(influenza virus A/WSN)也易被MCP-1和MCP-2直接中和，但MCP-1和MCP-2对巨细胞病毒(cytomegalovirus)，埃可病毒II型(echovirus type 11)，和呼肠孤病毒3型(reovirus type 3)无效。

1986年，Lehrer等也首次报道HNP1对包膜病毒单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、水泡性口炎病毒，人流感病毒有直接灭活作用，但对非被膜病毒埃可病毒和呼肠孤病毒没有作用。在包膜病毒的研究中，HNP1对HSV-1和HVS-2有很强的直接抑制作用，对水泡性口炎病毒和流感病毒(IAV)有温和的直接抑制作用，对巨细胞病毒，仅在高浓度时，才有轻微的作用。

对少数禽类的β防御素抗菌活性的研究显示其具有广泛地抗革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌作用。

Evans等(1995)研究结果证明鸡和火鸡的异嗜性粒细胞防御素AvBD1的抗细菌和真菌的肽浓度分别为0.4-3.4μM，0.4-1.8μM，能抗流感病原体，但不能杀死多杀性巴氏杆菌，也不能中和传染性的支气管炎病毒即一种鸡被膜冠状病毒。火鸡的防御素AvBD2的A片段(20个氨基酸)抑制金黄色葡萄球菌生长，但不抑制大肠杆菌E.coli的生长(Evans et al.，1994)。合成的鸡抗菌肽AvBD9对革兰氏阴性菌空肠弯曲菌，革兰氏阳性菌——产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌和白色念珠酵母菌及酿酒酵母等显示出较强的杀菌活性，但对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌没有抑杀作用(vanDijk et al.，2007)。合成鸡防御素AvBD13肽仅在高浓度时杀死李斯特菌(114μM)，沙门氏菌野生型(114μM)和鼠伤寒沙门氏菌P突变体(57μM)，而在肽浓度≤57μM时对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌生长的抑制作用微不足道或没有(Higgs et al.，2005)。

在径向扩散试验中，鸵鸟异嗜性粒细胞β防御素，AvBD-1，AvBD-2，和AvBD-7，有效地抑制大肠杆菌的0157：H7和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌1056(MRSA)的生长，最小抑菌浓度(MIC)0.2至0.6μM(Sugiartoand Yu，2006)。鸵鸟AvBD8对这些菌(MIC，2.4μM)很少有效，鸵鸟防御素中只有AvBD1具有抗真菌——白色念珠菌的作用。

Periathamby等(2000)研究发现，人防御素HNP-1与HNP-2均具有念珠菌真菌抗性，人防御素HNP-3完全没有念珠菌的真菌抗性。HNP-3与HNP-1仅在N-端有一个氨基酸的差异即在N-端HNP-3为Asp氨基酸，HNP-1为Ala氨基酸。Asp是天冬氨酸，是酸性氨基酸；Ala是丙氨酸，是疏水性脂肪族氨基酸。革兰氏阴性菌——伴放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌，革兰氏阳性菌——格登(氏)链球菌变形链球菌对人防御素不敏感。然而，在HNP-2的N-端和C-端分别加上两个碱性氨基酸Arg之后，明显提高了其抗真菌和细菌活性。在HNP-2的N-端和C-端分别加上两个酸性氨基酸Asp之后，其完全丧失了活性。在HNP-2的N-端加上两个疏水性氨基酸Val缬氨酸，C-端加上两个碱性氨基酸精氨酸Arg，使其在N-端和C-端氨基酸与兔防御素NP-1相同，经此改造后的HNP-2对口腔病原体具有最好的活性。这些结果表明在防御素小肽中，N-端和C-端的氨基酸残基是关键的功能元件，起到决定防御素的杀菌效力的作用。所有的防御素三维结构都是由相同的双亲性β-片层结构组成的，由N-端和C-端氨基酸残基形成极性表面，这些残基在决定杀菌活性和抗菌谱中起了重要作用。

正粘科病毒及危害

正粘病毒科(Orthomyxoviridae)是与粘液蛋白有特殊亲和性病毒中的1个科(见副粘病毒科)，又称流感病毒群。流行性感冒病毒，属于正粘病毒科，有5个属，即A、B、C流感病毒属，传染性鲑鱼贫血病毒属和托高土病毒属(见表2)。A型和B型感染动物和人，C型仅感染人而很少感染动物。该科病毒能引起人、马、牛、猪、鸡和火鸡等畜禽的流行性疾病，严重时造成死亡。

该科典型的病毒粒子呈球形，直径80～120纳米。表面有突起，有时呈丝状，长可达数微米。核酸为8个节段的负链RNA，总分子量约5×10⁶编码10种蛋白质。病毒粒结构分3层：中心为螺旋形核壳，宽9～15纳米，是由RNA、核蛋白和RNA多聚酶构成；中间为膜蛋白；外层为脂质囊膜，膜上装有许多糖蛋白突起，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种微粒。

病毒的血凝素HA具有凝集多种动物红细胞的活力，其神经氨酸酶NA能从粘蛋白中释放出N-乙酰神经氨酸。乙醚和脱氧胆酸钠等能破坏脂质膜而使病毒裂解灭活。病毒感染细胞后，先合成互补RNA。互补RNA有两种，一种起mRNA的作用，翻译病毒蛋白，另一种是复制病毒RNA的模板。RNA的8个节段分别复制，然后与核蛋白结合并一起转移至细胞质膜下，此时细胞质膜已被病毒修饰而含有血凝素和神经氨酸酶，再通过芽生形式形成新的病毒粒。本科病毒于复制初期可被放线菌素D抑制。两株同型病毒在同一细胞内复制时易发生重组，形成重组株。

流感病毒对干燥和低温的抵抗力强，在-70℃稳定，冻干可保存数年。60℃，20min可使病毒灭活，一般消毒剂对病毒均有作用，对碘蒸气和碘溶液特别敏感。易感动物A型流感病毒：可以感染猪、马、禽类、人、貂、海豹、鲸等，而且一般只侵袭其自然宿主，但某些亚型能从一种动物传向另一种动物，包括在动物和人之间的相互传播，特别是人与猪、人与禽之间传播的可能性较大；各种动物不分年龄、品种和性别均可感染，但以猪、马、鸡、火鸡和人的发病较为严重。B型和C型流感病毒：自然状态下仅感染人，一般呈散发或地方流行性，偶尔暴发。人流感在老年和儿童中可引起严重的后果，往往导致肺炎或继发其他疾病而死亡。

表2正粘科病毒分类

其中A型流感病毒是三个属流感病毒中最致命人类病原体，已造成最严重的疾病。在人类流感中发生了大流行并造成人的死亡，已确认了血清型的流感病毒见表3。

表3在人类中大流行的流感病毒

A型流感病毒是引起发病和死亡的主要原因，在美国，A型流感病毒每年造成约4万人死亡(Morens，2003)。最近的禽A型流感病毒感染人的事件提醒人们A行流感病毒具有大发生大流行的潜力(Webby和Webster，2003)。在抗A型流感病毒方面，天然宿主的先天免疫系统起到了重要的作用。在这些先天免疫蛋白中，具有显著抗A型流感病毒活性的有I型干扰素(I IFNs)，肿瘤坏死因子(TNF)，collectins和防御素(Daheret al.，1986；Seo and Webster.2002；Wang，et al.，2000；Li et al.，2004)。

1976年，美国暴发猪流感疫情，10月，美国执行国家流感免疫计划，约4000万美国人接种了新研制出来的流感疫苗。两个月后，500多位接种者出现了严重的不良反应——“吉兰-巴雷综合征”，其中25人死亡。这是一种非常罕见的神经失调综合症，具体的发病原因和治疗方法至今未知，有的人瘫痪一个月后康复，有的人却永远瘫痪，甚至死亡。

2008-2009年流感季节，在美国盛行的季节性流感H1N1病毒几乎百分之百地对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)有抗药性，以及几乎所有的H3N2病毒株对金刚烷胺有耐药性。而由H5N1亚型感染的人群，有一半死于用这两类药物治疗。

在美国，每年由于感染造成的死亡人数超过250万例，因此感染已成为造成死亡的首要原因。而且在美国，每年有70％感染患者有抗药性，使耐药细菌迅速的增加，已成为世界所面临的最严重的医疗问题之一。感染耐甲氧西林金黄色葡萄菌(MRSA)仅4年已增加了700％。在美国，2008年MRSA的住院费用超过了685,000美元，并预计到2013年增至240万美元。MRSA感染直接花费美国医疗系统的100亿美元和每年总花费达180亿美元。

抗生素耐药菌的出现，甚至多重耐药菌的发现，以及耐药菌感染的急剧上升，急需不会带来病原菌耐药性的新药物。由于防御素具有强大的抗菌和免疫调节作用，防御素对抗生素耐药菌及多重耐药菌也均具有抑杀作用。与传统的抗生素相比，细菌从防御素中获得耐药性极为困难。因此，广泛地认为防御素是最具有潜力的新一代抗感染生物肽。

兔防御素的生产

像兔防御素这样的抗菌肽由于本身对宿主有很强的毒害作用，所以很难用常规的基因工程表达系统如大肠杆菌和酵母来生产(Li et al.，2004)。目前文献报道获取兔防御素的途径大部分是从兔子中获得的(Judith et al.，1980；Selsted et al.，1983，1984，1985；Lehrer et al.，1981，1983，1985；Sinha etal.，2003)。

中国科学院遗传与发育生物学研究所以椭圆小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体为受体，以NPTII和硝酸还原酶基因为筛选标记，以Ubiquitin启动子控制NP-1，获得了能够在硝酸盐培养基上培养而且具有较强NP-1活性的转基因小球藻(安洋等2008)。

NP-1的抗菌活性已有较多报道(Patterson-Delafield et al.，1980，1981；Selsted et al.，1984，1985c；Lehrer et al，1983，1985a，1985b，1986；Levitz et al.，1986；Miyasaki et al.，1990b，Borenstein et al.，1991a，1991b；Kohashi et al.，1992)，但其在抗病毒方面的报道较少(Nakashima et al.，1993；Lehrer et al，1985b；Sinha et al.，2003)，在抗禽流感病毒方面还没有报道。

发明内容

本发明提供了一种改造的NP-1(即mNP-1)及其在抗禽流感病毒方面的应用，所述的改造的NP-1(即mNP-1)具有34个氨基酸，第一个氨基酸为甲硫氨酸，是新加上的，其余的33个氨基酸来自兔防御素NP-1的序列，改造后的NP-1的核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16(简称mNP-1)。mNP-1具有较强抗禽流感病毒的能力，在活体(鸡胚)水平mNP-1浓度为200pg/mL以上时，对杀灭流感病毒(H5N1亚型Re-4株)有效。而前人从兔中获得的防御素NP-1浓度为20ng/mL以上时，对杀灭流感病毒(H5N1亚型Re-4株)有效，说明mNP-1比NP-1具有更强的抗病毒能力。最低有效浓度为200pg/mL。mNP-1具有较强抗禽流感病毒的能力。与前人结果相比，mNP-1抗病毒能力显著增强。

具体地，在本发明的一个方面，提供了一种短肽mNP-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的序列。

在本发明的另一个方面，提供了编码所述短肽mNP-1的核酸。所述核酸的序列为SEQ ID NO：15所示的序列。

在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含上述之一的核酸。

在一个具体的实施方案中，所述表达载体是通过将Nos终止子(SEQ IDNO：6)，Ubiquitin基因启动子(SEQ ID NO：1)，含有编码上述mNP-1(SEQID NO：13)的基因以及NR基因表达框(SEQ ID NO：5)依次连接到载体的多克隆位点中，获得表达载体pGreen-NR-U-mNP1。

在本发明的另一个方面，提供了宿主细胞，其包含上述的核酸或上述的表达载体。

在本发明的又一个方面，提供了药物组合物，其包含上述的短肽mNP-1或上述的编码所述短肽mNP-1的核酸和任选地药用载体。优选地，所述的药物组合物为溶液、片剂、胶囊、雾剂、膏剂、粉剂或注射剂的形式。

在本发明的又一个方面，提供了上述的短肽mNP-1或上述的编码所述短肽mNP-1的核酸在制备抗病毒药物中的应用。

在一个具体的实施方案中，所述的病毒为流感病毒，被膜病毒。更优选地，所述流感病毒是正粘科病毒，包括A、B和C型病毒。进一步优选地，所述的流感病毒为HN系列病毒，包括H1N1，H1N2，H2N2，H3N1，H3N2，H3N8，H5N1，H5N2，H5N3，H5N8，H5N9，H7N1，H7N2，H7N3，H7N4，H7N7，H9N2，H10N7，优选H5N1或H9N2。

本发明在一个优选实施方案中，在活体(鸡胚)水平证明了mNP-1在与禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)混合后浓度为200pg/mL以上时，对杀灭禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)有效。而防御素NP-1在与禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)混合后浓度为20ng/mL以上时，对杀灭禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)有效，充分说明mNP-1比NP-1具有更强的抗病毒能力。

本发明在另外一个优选实施方案中，在细胞水平证明了mNP-1具有很强的抗H5N1的能力，有效浓度为1-10ng/ml。

本发明在另外一个优选实施方案中，还在细胞水平证明了mNP-1具有很强的抗H9N2的能力，有效浓度为1-10ng/ml。

附图说明

图1.PBI221质粒结构图。

图2.pbinUGUS质粒结构图。

图3.pGreen0029质粒结构图。

图4.pGreen0029nos质粒结构图。

图5.pGreen0029-U-nos质粒的结构图。

图6.pGreen0029-U-mNP1-nos质粒结构图。

图7pGreen-NR-U-mNP1质粒结构图。

图8.电击方法转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体得到的抗G418的藻落。

图9.NPTII基因PCR检测结果。1泳道为阳性质粒，2泳道为未转化藻株nrm-4；3-11泳道为转化藻株1-9；

图10.Ubi-mNP-1-Nos基因PCR检测结果。1泳道为未转化藻株nrm-4；2泳道为阳性质粒；3-11泳道为转化藻株1-9。

图11Sephadex G-50的紫外吸收峰图。

图12Sephadex C-25的紫外吸收峰图。

图13从转基因小球藻中纯化mNP-1的电泳图。1，4：蛋白质分子量标准；2，3：纯化的mNP-1(箭头所指)。

图14mNP-1胰蛋白酶解肽段LC-MS分析结果。

具体实施方式

下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6×Loading Buffer)购自TaKaRa公司；普通Taq酶，plus 2000Maker，DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，购自鼎国公司；Sephadex G-50，Sephadex C-25购自pharmacia公司。

实施例1.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体构建方法

根据Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：1)设计引物，上游引物：5’CCGGAAGCTTGTGCAGCGTGACCCG3’(SEQ ID NO：2)；下游引物：5’GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3’(SEQ ID NO：3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点(下划线标出部分)，下游引物中加入BamH I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR方法从玉米基因组中得到Ubiquitin启动子，测序结果显示为Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：4，其在SEQ ID NO：1的5’端及3’端分别添加了Hind III酶切位点和BamH I酶切位点)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物2007bp大小的片段，用Hind III和BamH I内切酶双酶切，质粒pBI221(Clontech)(图1)也经Hind III和Bam HI内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Hind III和BamH I内切酶双酶切鉴定，能够得到1987bp大小片段(即Ubiquitin启动子)的质粒即命名为pbinUGUS(图2)。

实施例2.利用pGreen0029框架来构建表达载体。

根据Nos终止子序列(SEQ ID NO：6)设计引物，上游引物：5’ATAAGAATGCGGCCGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’(SEQ ID NO：7)下游引物：5’CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA3’(SEQ ID NO：8)其中在上游引物中加入Not I酶切位点(下划线标出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR的方法从pBI221(Clontech)中获得了Nos终止子，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物268bp大小的片段，用Not I和Sac I内切酶双酶切，质粒pGreen0029(图3，来自BBSRC)也经Not I和Sac I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Not I和Sac I内切酶双酶切鉴定，能够得到270bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreen0029nos(图4)。

实施例3.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体pGreen-NR-U-mNP1的构建.

按照常规技术，将Ubiquitin启动子(SEQ ID NO：1)从载体pbinUGUS(图2)中通过HindIII和BamHI双酶切回收后，连接到同样经过HindIII和BamHI双酶切的pGreen0029nos载体上(图3，来自于BBSRC)获得pGreen0029-U-nos初级中间载体(图5)。通过化学合成方法合成带有目的基因mNP-1的序列(其序列如SEQ ID NO：13)，为提高NP-1的抗病毒活性，在合成的过程中，在NP-1的N端添加了一个甲硫氨酸，将NP-1改造成了mNP-1，因mNP-1基因太小，为方便构建载体，在该基因的C端添加了75bp辅助序列，同时在基因的5’和3’端分别添上两个酶切位点BamHI和Not I，最终得到合成的带有mNP-1基因的201bp序列(SEQ ID NO：13)，将合成的序列(SEQ ID NO：13)通过BamH I和Not I双酶酶切回收189bp的带有mNP-1基因的片段，然后与经同样经过BamH I和Not I双酶酶切的载体pGreen0029-U-NOS连接(图5)，获得载体pGreen0029-U-mNP1-nos(图6)。最后通过HindIII酶切pSK-NR质粒(含有硝酸还原酶表达框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收号为AY275834，NR表达框序列如SEQ ID NO：5所示，涉及pSK-NR质粒及NR表达框的专利公开号：CN1676597)，回收4518bp NR表达框片段，单酶切NR表达框和载体pGreen0029-U-mNP1-NOS，然后将它们相连，则构建成椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的mNP-1植物表达载体pGreen-NR-U-mNP1(见图7)。

实施例4.小球藻电击转化

小球藻E₄液体培养基见表4。

小球藻固体培养基：液体培养基+7％琼脂pH 5.4～7.0。

小球藻筛选培养基：小球藻固体培养基的Na₂NO₂0.69g/L替换为10mmol/L NO₃^-，并添加抗生素G418至终浓度为15mg/L。

取50ml对数生长期的硝酸还原酶突变体小球藻nrm-4(公开号：CN1676597A)，50×g，离心10min离心收集藻细胞(RefrigeratedCentrifuge CR 20B2，HIACHI)；用高渗液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M)冰上处理1-3h；50g离心10min，去上清，沉淀用5ml电击缓冲液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M，KCL 0.08M，CaCL₂0.005M，HEPES 0.01M)悬浮，并用电击缓冲液调细胞密度到1×10⁶个/mL；加入终浓度为10μg/mL的质粒pGreen-NR-Ubi-mNP1和25μg/mL的鲑精DNA，混匀，冰上放置5-10min后电击，取400μl混合好的小球藻细胞放入电击杯中，电击。脉冲电压为6-10.5KV，脉冲持续时间分别为0.001-0.2s，脉冲次数为2¹⁰，脉冲距离为2mm，循环周期为100。电击后将小球藻转入筛选培养基中培养(图8)。

实施例5.转基因小球藻的分子检测

a.转基因小球藻总DNA的提取

挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25℃，光照2500lux，120rpm)。2周后(浓度达到约为1×10⁸个/mL)，1600g离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻总DNA，提取的DNA存于-20℃备用。

b.转基因小球藻的PCR检测

以转基因藻基因组DNA为模板，分别进行NPTII基因(载体质粒pGreen0029中的卡那抗性基因，序列为SEQ ID NO：14)和Ubiquitin启动子mNP-1-Nos终止子的PCR扩增。检测NPTII基因的PCR引物为：正向引物NPTII-f，5’GTCCTGATAGCGGTCCGCCAC3’(SEQ ID NO：9)；反向引物NPTII-r，5′TCCGGTGCCCTGAATGAACT3’(SEQ ID NO：10)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min 30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约501bp的片段。Ubiquitin-mNP1-Nos的基因序列的PCR扩增，扩增的引物分别为：Ubi-852-L：5’-GCTCCTTCGCTTTCCCTTCC-3’(SEQ ID NO：11)；Nos-2429-R：5’-GCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG-3’(SEQ IDNO：12)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约1578bp的DNA片段，即Ubiquitin-mNP1-Nos片段。

共对9个藻株进行了检测，检测结果见图9，10。转化藻株1-9，能够扩增出外源NPTII基因，在转化藻株1-4和6-9中能够扩增出外源Ubiquitin-mNP1-Nos片段，在转化藻株1-4和6-9中NPTII和Ubiquitin-mNP1-Nos片段都能够扩增出来。证明NPTII和Ubiquitin-mNP1-Nos片段PCR均为阳性的藻株为转基因藻株，选取这些藻株进行液体扩繁培养，用以进一步转基因藻株的-mNP1的提取、纯化和抗病毒活性检测(见下述实施例)。

实施例6.转基因小球藻可溶性蛋白的提取

用E4培养基(培养基成分见表4)培养转基因藻，离心收集对数生长期(浓度约为1×10⁸个/mL)的细胞，约3g湿藻重，然后按湿藻重∶无菌水：＝1∶1进行混合。超声破碎9s，间隔4s，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，沸水煮10min使大分子量蛋白质变性沉淀。4℃过夜后7500g离心10min，取上清液。

表4培养基组成

  组成成份  E4液体培养基  葡萄糖(g)  5  KNO₃(g)  /

  Na₂NO₂(g)  0.69  KH₂PO₄(g)  0.075  MgSO₄·7H₂O(g)  0.175  CaCl₂(mg)  25  FeCl₃·6H₂O(mg)  5  NaCl(mg)  25  FeCl₃·6H₂O(mg)  0.81  EDTA(mg)  20  微量元素(mL)  1  水(mL)  1000

其中的微量元素溶液配方为：H₃BO₃ 1.43g，ZnSO4·7H₂O 0.11g，MnCl₂·4H₂O 0.905g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0185g，CuSO₄·5H₂O 0.0395g，水1000mL。

实施例7.防御素mNP-1的纯化

通过Sephadex G-50初步纯化mNP-1

转基因小球藻表达的mNP-1是34个氨基酸小肽，分子量为4028.98Da。提取转mNP-1基因的小球藻总蛋白(见实施例6)，将该提取物冷冻干燥后，用0.2％乙酸溶解，然后用葡聚糖凝胶Sephadex G-50进行分离纯化(图11)，通过凝胶层析的方法进行组别分离除去大分子量的蛋白，收集分子量为1.5×10³～30×10³的小肽(即图11中的紫外线280nm吸收峰的第二个峰)，并进行低温冷冻干燥，待进一步分离纯化。

通过阳离子交换柱Sephadex C-25进一步纯化mNP-1

将经过了Sephadex G-50获得的活性部分冻干物进行阳离子交换柱Sephadex C-25纯化(见图12)。收集洗脱部分，然后透析，再进行低温冷冻干燥，进行电泳检测。

电泳检测纯化的mNP-1

将经过多级纯化后获得的mNP-1进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测，电泳结果(见图13)表明获得了高纯度的mNP-1纯化产物。Tricine-SDS-PAGE的三明治胶浓度范围分别是6％，12％，16.5％。

LC-MS检测电泳获得的mNP-1

将电泳条带切胶回收，并进行胶内胰蛋白酶消化，将消化后的产物进行LC-MS分析。肽段AGFCRIRGR，MH⁺＝1093.26，当它带4个电荷时，对应的质荷比M/Z＝274.3(见图14)。提取274.3的离子流，含量较高，且此离子峰的MS2碎片匹配较好，因此认为此肽段是AGFCRIRGR，该肽段是mNP-1小肽的一小段。

实施例8.防御素mNP-1抑制禽流感病毒H5N1鸡胚实验

1.材料：防御素mNP-1(20μg/mL)，禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株，郑州生物制药厂保存)生产种毒，9-11日龄SPF鸡胚，阿氏(Alsevers)液，鸡红细胞悬液，pH 7.2，0.01M PBS，NP-1(20μg/mL)(按Selsted et al.，1984的方法从兔中提取和纯化)。

2.方法：

2.1将种毒稀释104倍，防御素mNP1和NP-1以10倍法进行系列稀释，然后分别取稀释10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的防御素mNP1和NP-1组1ml加入9ml稀释了10⁴的种毒中，混匀后室温下放置30min，进行中和。

2.2取每组中和后的样品，以0.2ml/胚的量，接种到9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，设未与防御素mNP1中和的种毒组为对照组，于36℃孵化箱内孵化，18h后每隔8h观察鸡胚存活情况。

2.3无菌收取96h仍存活的鸡胚，并检测每胚凝血活性(HA)。

2.4血凝(HA)试验(微量法)

1)在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。

2)吸取0.025mL鸡胚尿囊液加入第1孔，混匀。

3)从第1孔吸取0.025m L病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025m L加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之。

4)每孔再加入0.025ml PBS。

5)每孔均加入0.025ml体积分数为1％鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。

6)振荡混匀，在室温(20℃-25℃)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4℃环境下)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

7)结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌，不流淌的为完全血凝。

3.结果

mNP1与禽流感病毒中和后，接种SPF鸡胚，培养96h后检测每胚HA，结果见表1和2。

表1接种mNP-1鸡胚的HA检测结果

表2接种NP-1鸡胚的HA检测结果

注：表中“-”表示该胚96h前死亡，没有检测其HA。

由表3可知，10⁰、10^-1、10^-2、10^-3稀释的防御素mNP-1可以完全制该病毒的生长，或者杀灭了该病毒。而10^-4稀释的防御素mNP1对病毒具有部分抑杀作用。对照组成立。

4.结论

防御素mNP-1在与禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)混合后浓度为200pg/mL以上时，对杀灭禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)有效。而防御素NP-1在与禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)混合后浓度为20ng/mL以上时，对杀灭禽流感病毒(H5N1亚型Re-4株)有效。

实施例9.防御素mNP-1抑制禽流感病毒H5N1细胞实验

1)在6孔培养板内加入2mL由DMEM(购自Gibco公司)稀释的MDCK细胞(中国农科院哈尔滨兽医研究所)，每个6孔板约含有2×10⁶个细胞，37度培养8h。

2)将病毒H5N1(guangdong/1/96)(中国农科院哈尔滨兽医研究)用DMEM培养基稀释至100PFU/mL，取1mL稀释病毒的培养液，分别加入1mLDMEM稀释的mNP-1(与病毒液混合后mNP-1的浓度分别为1ng/mL，10ng/mL)，以及不加蛋白只加用DMEM稀释的病毒H5N1的液体为对照。37度作用1h。

3)弃去6孔培养板中的培养液，用灭菌PBS洗6孔板培养的MDCK细胞3次，加入作用1h后的病毒与蛋白混合液2mL，37度继续作用1h。

4)倒去6孔培养板上的蛋白和病毒的混合培养液，每孔加入含1％低熔点琼脂糖(购自AMRESCO公司)的DMEM培养基2mL，待室温放置凝固后，37度继续培养约72h。观察噬斑。每组样品重复3次。

5)37度培养72h，用5％甲醛固定细胞30分钟后，用0.5％结晶紫染色，观察蚀斑。结果见表。

  样品  浓度(ng/mL)  噬斑数

  mNP-1  10  0  mNP-1  1  20±3  Ck  60±4

6)结果显示：mNP-1在两个稀释浓度下都对禽流感病毒H5N1(guangdong/1/96)具有抑制作用。

实施例10.防御素mNP-1抑制禽流感病毒H9N2

1)在96孔培养板内加入100μL由DMEM(购自Gibco公司)稀释的MDCK细胞(中国农科院哈尔滨兽医研究所)，每个96孔板约含有2×10⁶个细胞，37度培养8h。

2)将病毒H9N2(sh1001)(中国农科院哈尔滨兽医研究所，血凝价为2⁶HA)用DMEM培养基按照2倍梯度稀释，取50μl稀释梯度2^-4，2^-5，2^-6，2^-7的病毒培养液，分别加入50μL mNP-1(终浓度分别为10ng/mL，1ng/mL)，以不加蛋白的病毒为对照。

3)倒去96孔培养板上的培养液，用灭菌PBS洗96孔板细胞3次，每孔加入100uL混合好的病毒与蛋白混合液。每组样品重复3次。

4)37度培养48h。

5)血凝检测：取细胞表面的培养液，参照检测流感病毒的标准血凝检测方法，检测每孔培养液的血凝性，以细胞培养液有血凝性判定为该孔中有病毒存在，否则判定为无病毒存在，结果见表。

6)结果显示：mNP-1在两个稀释浓度下都对禽流感病毒H9N2(sh1001)具有抑制作用。

参考文献：

Aarbiou J，Ertmann M，van Wetering S，van Noort P，Rook D，Rabe K F，Litvinov S V，van Krieken J H J M，de Boer W I，Hiemstra P S(2002).Human neutrophil defensins induce lung epithelial cell proliferation invitro.J Leukoc Biol，72：167-174

Aarbiou J，Verhoosel R M，Van Wetering S，De Boer W I，Van Krieken J H J M，Litvinov SV，Rabe KF，Hiemstra PS(2004).Neutrophil defensins enhancelung epithelial wound closure and mucin gene expression in vitro.Am JRespir Cell Mol Biol，30：193-201

Balous A，Hausler W J，Herrmann K L，Isenberg H D，and Shadomy H J，eds.Manual of Clinical Microbiology.5th ed(M).Washington DC：AmericanSociety for Microbiology，1991.1138-1152

Befus AD，Mowat C，Gilchrist M，Hu J，Solomon S，Bateman A(1999).Neutrophil defensins induce histamine secretion from mast cells：mechanisms of action.J Immunol，163：947-953

Borenstein L A，Ganz T，Sell S，Lehrer R I，and Miller J N(1991a).Contribution of rabbit leukocyte defensins to the host response inexperimental syphilis.Infect Immun，59：1368-1377

Borenstein L A，Selsted M E，Lehrer R I，and Miller J N(1991b).Antimicrobial activity of rabbit leukocyte defensins against Treponemapallidum subsp.pallidum.Infect Immun，59：1359-1367.

Boynton J E，Gillham N W，Harris E H，Hosler J P，Johnson A M，Jones A R，Randolph-Anderson B L，Robertson D，Klein T M，Shark K B and SanfordJ C(1988).Chloroplast transformation in Chlamydomonas with highvelocity microprojectiles(J)，Science，240：1534-1538

Bricknell I，and Dalmo R A(2005).The use of immunostimulants in fish larvalaquaculture(J).Fish Shellfish Immunol，19：457-472

Chen Y，Wang Y Q，Sun Y R，Zhang L M and Li W B(2001).Highly efficientexpression of rabbit neutrophil peptide-1 gene in Chlorella ellipsoidea cells(J).Curr Genet，39：365-370

Chertov O，Michiel D F，Xu L，Wang J M，Tani K，Murphy W J，Longo D L，Taub D D，Oppenheim JJ(1996).Identification of defensin-1，defensin-2，and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released frominterleukin-8-stimulated neutrophils.J Biol Chem，271：2935-2940

Cullor J S，Mannis M J，Murphy C J，Smtth W L，Selsted M E，and Reid T W(1990).In vitro antimicrobial activity of defensins against ocular pathogens.Archives of Ophthalmology，108：861-864.

Cullor J S，Wood V，Smith W，Panico L，and Selsted M E(1991).Bactericidalpotency and mechanistic specificity of neutrophil defensins against bovinemastitis pathogens.Vet Microbiol，29：49-58

Daher K，Selsted M E and Lehrer R(1986).Direct inactivation of viruses byhuman granulocyte defensins.J Virol，60：1068-1074

Dawson H，Burlingame R and Cannons A C(1997).Stable transformation ofChlorella：rescue of nitrate reductase-deficient mutants with the nitratereductase gene(J).Curr Microbiol，35：356-362

Eisenhauer P B，Harwig S S，Szklarek D，Ganz T，Selsted M E，and Lehrer R I(1989).Purification and antimicrobial properties of three defensins from ratneutrophils.Infect Immun，57：2021-2027

Evans E W，Beach F G，Moore K M，Jackwood M W，Glisson J R，Harmon B G(1995).Antimicrobial activity of chicken and turkey heterophil peptidesCHP1，CHP2，THP1，and THP3.Vet Microbiol，47：295-303.

Evans E W，Beach G G，Wunderlich J，Harmon B G(1994).Isolation ofantimicrobial peptides from avian heterophils.J Leukoc Biol，56：661-665.

Fleischmann J，Selsted M E，Lehrer R I(1985).Opsonic activity of MCP-1 andMCP-2，cationic peptides from rabbit alveolar macrophages.DiagnMicrobiol Infect Dis，3：233-242.

Ganz T，Rayner J R，Valore E V，Tumolo A，Talmadge K and Fuller F(1989).The structure of the rabbit macrophage defensin genes and theirorgan-specific expression(J).Immunl，43：1358-1365

Ganz T，Selsted M E，Szklarek D，Harwig S S，Daher K，Bainton D F，andLehrer R I(1985a).Defensins.Natural peptide antibiotics of humanneutrophils.J Clin Invest，76，1427-1435.

Grutkoski P S，Graeber C T，Lim YP，Ayala A，Simms HH(2003).α-defensin 1(human neutrophil protein 1)as an antichemotactic agent for humanpolymorphonuclear leukocytes.Antimicrob Agents Chemother，47：2666-2668

Helms M，Simonsen J，K(2006).Foodborne bacterial infection andhospitalization：a registry-based study.Clin Infect Dis，42：498-506.

Higgs R，Lynn D J，Gaines S，McMahon J，Tierney J，James T，Lloyd A T，Mulcahy，G，O’Farrelly C(2005).The synthetic form of a novel chickenβ-defensin identified in silico is predominantly active against intestinalpathogens.Immunogenetics 57：90-98.

Ichinose M，Asai M，Imai K，Sawada M(1996).Enhancement of phagocytosisby corticostatin I(CSI)in cultured mouse peritoneal macrophages.Immunopharmacology，35：103-109.

Kessel A S，Gillespie I A，O’Brien S J，Adak G K，Humphrey T J，Ward LR(2001).General outbreaks of infectious intestinal disease linked withpoultry，England and Wales 1992-1999.Commun.Dis.Public Health 4：171-177.

Kohashi O，Ono T，Ohki K et al.(1992).Bactericidal activities of rat defensinsand synthetic rabbit defensins on Staphylococci，Klebsiella pneumoniae(Chedid，277，and 8N3)，Pseudomonas aeruginosa(mucoid and nonmucoidstrains)，Salmonella typhimurium(Ra，Rc，Rd，and Re of LPS mutants)andEscherichia coli.Microbiol Immunol，36：369-380.

Kung N Y，Morris R S，Perkins N R，Sims L D.，Ellis T M，Bissett L，Chow M，Shortridge K F，Guan Y，Peiris M J S(2007).Risk for infection with highlypathogenic influenza Avirus(H5N1)in chickens，Hong Kong 2002.EmergInfect Dis，13：412-418

Lehrer R I，Barton A，Daher K A，Harwig S S，Ganz T，and Selsted M E(1989).Interaction of human defensins with Escherichia coli.Mechanism ofbactericidal activity.J Clin Invest，84：553-561

Lehrer R I，Ganz T，Szklarek D，and Selsted M E(1988).Modulation of the invitro candidacidal activity of human neutrophil defensins by target cellmetabolism and divalent cations.J Clin Invest，81：1829-1835

Lehrer R I，Kathleen D，Ganz T，and Selsted M E(1985b).Direct Inactivationof Viruses by MCP-1 and MCP-2，Natural Peptide Antibiotics from RabbitLeukocytes.Journal of Virology，54：467-472

Lehrer R I，Selsted M E，Szklarek D，and Fleischmann J(1983).Antibacterialactivity of microbicidal cationic proteins 1 and 2，natural peptideantibiotics of rabbit lung macrophages.Infect Immun，42：10-14.

Lehrer R I，Szklarek D，Ganz T，and Selsted M E(1985a).Correlation ofbinding of rabbit granulocyte peptides to Candida albicans withcandidacidal activity.Infect Immun，49：207-211

Lehrer R I，Szklarek D，Ganz T，and Selsted M E(1986).Synergistic activity ofrabbit granulocyte peptides against Candida albicans.Infect Immun.52：902-904

Levitz S M，Selsted M E，Ganz T，Lehrer R I，and Diamond R D(1986).Invitro killing of spores and hyphae of Aspergillus fumigatus and Rhizopusoryzae by rabbit neutrophil cationic peptides and bronchoalveolarmacrophages.J Infect Dis，154，483-489.

Li W，Li H，Lu R，Li F，Dus M，Atkinson P，Brydon E，Johnson K，Garcia-Sastre A，Ball L，et al.(2004).Interferon antagonist proteins ofinfluenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.Proc NatlAcad Sci USA，101：1350-1355

Li X，Shen X，Wang Y Q，Li W B，Sun Y R(2004).High-level expression andone-step purification of neutrophil peptide 1 in E.coli with self-cleavableIntein Tag(J).High Technology Letters(English Language Edition)，10(Suppl.)：264-268

Miyasaki K T，Bodeau A L，Ganz T，Selsted M E，and Lehrer R I(1990a).Invitro sensitivity of oral，gram-negative，facultative bacteria to thebactericidal activity of human neutrophil defensins.Infect Immun，58：3934-3940.

Miyasaki K T，Bodeau A L，Ganz T，Selsted M E，Lehrer R I(1990c).Sensitivity of oral，Gram-negative，facultative bacteria to the bactericidalactivity of human neutrophil defensins.Infect Immun，58：3934-3940

Miyasaki K T，Bodeau A L，Selsted M E，Ganz T，and Lehrer R I(1990b).Killing of oral，gram-negative，fecultative bacteria by the rabbit defensin，NP-1.Oral Microbiol Immunol，5：315-319.

Morens D(2003).Influenza-related mortality：considerations for practice andpublic health.J Am Med Assoc，289：227-229.

Motzkus D，Schulz-Maronde S，Heitland A，Schulz A，Forssmann W-G，M，Maronde E(2006).The novel bdefensin DEFB123 preventslipopolysaccharide-mediated effects in vitro and in vivo.FASEB J，20：1701-1702

Murphy C J，Foster B A，Mannis M J，Selsted M E，Reid T W(1993).Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts.J Cell Physiol155：408-413

Nakashima H，Yamamoto N，Masuda M，Fujii N(1993).Defensins inhibit HIVreplication in vitro.AIDS，7：1129

Niyonsaba F，Iwabuchi K，Matsuda H，Ogawa H，Nagaoka I(2002).Epithelialcell-derived human β-defensin-2 acts as a chemotaxin for mast cellsthrough a pertussis toxin-sensitive and phospholipase C-dependent pathway.Int Immunol，14：421-426

Ogata K，Linzer B A，Zuberi R I，Ganz T，Lehrer R I，and Catanzaro A(1992).Activity of defensins from human neutrophilic granulocytes againstMycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare.Infect Immun，60：4720-4725

Patterson-Delafield J，Martinez R J，and Lehrer R I(1980).Microbicidalcationic proteins in rabbit alveolar macrophages：a potential host defensemechanism.Infect Immun，30：180-192

Patterson-Delafield J，Szklarek D，Martinez R J，and Lehrer R I(1981).Microbicidal cationic proteins of rabbit alveolar macrophages：amino acidcomposition and functional attributes.Infect Immun，31：723-731

Periathamby A R，Antonyraj K J，and Karunakaran T(2000).Large-scalesynthesis and functional elements for the antimicrobial activity of defensins.Biochem J，347：633-641

Segal G P，Lehrer R I，and Selsted M E(1985).In vitro effect of phagocytecationic peptides on Coccidioides immitis.J Infect Dis，151：890-894

Selsted M E，and Harwig S S(1987).Purification，primary structure，andantimicrobial activities of a guinea pig neutrophil defensin.Infect Immun，55：2281-2286

Selsted M E，Brown D M，Delange R J，Harwig S S L，and Lehrer R I.PrimaryStructures of Six Antimicrobial Peptides of Rabbit Peritoneal Neutrophils.JBiol Chem，1985c，260：4579-4584

Selsted M E，Brown D M，Delangel R J and Lehrer R I.(1983).Primarystructures of MCP-1 and MCP-2，natural peptide antibiotics of rabbit lungmacrophages.Journal of Biological Chemistry，258：14485-14489

Selsted M E，Miller S I，Henschen A H，and Ouellette A J(1992).Entericdefensins：antibiotic peptide components of intestinal host defense.J CellBiol，18：929-936

Selsted M E，Szklarek D，and Lehrer R I(1984).Purification and antibacterialactivity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes.Infect Immun，45：150-154

Semple C A M，Rolfe M，Dorin JR(2003).Duplication and selection in theevolution of primate β-defensin genes.Genome Biol，4：R31.

Seo S，and Webster R(2002).Tumor necrosis factor exerts powerfulantiinfluenza virus effects in lung epithelial cells.J Virol，76：1071-1076.

Shafer W M，Engle S A，Martin L E，and Spitznagel JK(1988).Killing ofProteus mirabilis by polymorphonuclear leukocyte granule proteins：Evidence for species specificity by antimicrobial proteins.Infect Immun，56：51-53

Sinha S.，Cheshenko N，Lehrer R I，Herold B C.2003.NP-1，a Rabbitα-Defensin，Prevents the Entry and Intercellular Spread of Herpes SimplexVirus Type 2.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY.494-500.

Sugiarto H，Yu P-L(2006).Identification of three novel ostricacins：an updateon the phylogenetic perspective of β-defensins.Int J Antimicrob Agents 27：229-235.

Territo M C，Ganz T，Selsted M E，Lehrer R(1989).Monocyte-chemotacticactivity of defensins from human neutrophils.J Clin Invest，84：2017-2020.

van Dijk A，Veldhuizen E J A，Kalkhove S I C，Tjeerdsma-van Bokhoven J LM，Romijn R A，Haagsman H P(2007).The bdefensin gallinacin-6 isexpressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activityagainst food-borne pathogens.Antimicrob Agents Chemother，51：912-922

Wang P，Sun Y R，Li X，Zhang L M，Li W B，and Wang Y Q(2004).Rapidisolation and functional analysis of promoter sequences of the nitratereductase gene from Chlorella ellipsoidea(J).J Appl Phycol，2004，16：11～16

Wang P，Wang Y Q，Geng D G，Li W B and Sun Y R(2003).Molecularcloning and characterization of a cDNA encoding nitrate reductase fromChlorella ellipsoidea(Chlorophyta)(J).J Appl Phycol，2003，15：457-463

Wang X，Li M，Zheng H，Muster T，Palese P，Beg A，and Garcia-Sastre A(2000).Influenza A virus NS1 protein prevents activation of NF-_kB andinduction of α/βinterferon.J Virol，74：11566-11573.

Wang Y Q(王义琴)，Chen Y(陈颖)，Bai Q H(白琴华)，Zhao S M(赵世民)，Li W B(李文彬)and Sun Y R(孙勇如)(2001).Using transgenicChlorella ellipsoidea as bio-reactor to produce rabbit defensin(J).HighTechnology Letters(高技术通讯)，11：1-5

Wang Y Q，Chen Y and Sun Y R(2005).Isolation and characterization of anitrate reductase deficient mutant of Chlorella ellipsoidea(Chlorophyta)(J).J Appl Phycol，17：281-286

Webby R J，and Webster R G(2003).Are we ready for pandemic influenza？Science，302：1519-1522.

Yamashita T，Saito K(1989).Purification，primary structure，and biologicalactivity of guinea pig neutrophil cationic peptides.Infect Immun，57：2405-2409

Yang D，Chertov O，Bykovskaia SN，Chen Q，Buffo M J，Shogan J，AndersonM，J M，Wang JM，Howard O M Z，Oppenheim J J(1999).b-defensins：linking innate and adaptive immunity through dendritic and Tcell CCR6.Science，286：525-528.

Zasloff M(2002).Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature415：389-395

Zhang X Y(张小宇)，Wang P(王鹏)，Zhao S M(赵世民)，Li X(李霞)，ShenX(沈昕)，Sun Y R(孙勇如)，Chu C C(储成才)and Wang Y Q(王义琴)(2006).Expression of rabbit neutrophile peptide-1 in nitrate reductasedeficient mutant of Chlorella ellipsoidea(J).Yichuan(Beijing)(遗传)，28：1580-1584