L-丝氨酸的柱状结晶体结晶工艺及用途

摘要

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及L-丝氨酸的柱状结晶体结晶工艺及用途。本发明组合了氨基酸的冷却结晶和溶析结晶两个工艺，形成新的结晶工艺，并用于L-丝氨酸的柱状结晶体生产。本发明以L-丝氨酸粗品为原料，经溶解、脱色处理后，先于30～50℃水相体系中育成L-丝氨酸柱状结晶体晶核和微晶，再控制甲醇或乙醇浓度10～50%，在水-有机溶剂相体系中搅拌长成，得到L-丝氨酸的柱状结晶体产品。所得L-丝氨酸柱状结晶体，按日本味之素株式会社质量标准（2002版本）检测，产品含量与透过率均不低于99.0%。本发明工艺只需控制温度、醇浓度和搅拌速度，有利于生产工艺和产品质量的稳定，同时具有操作简便、无需特殊设备等优点，易于工业化推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及L-丝氨酸柱状结晶体的结晶工艺及用途。

背景技术

1865年德国化学家Cramer首次从丝胶蛋白水解液中分离出一种带甜味的晶体，于是依其来源将此结晶命名为丝氨酸（Serine）。1880年另一德国化学家Erlenmeyer推定此化合物的化学结构为α-氨基-β-羟基丙酸（α-amino-β-hydroxy propionic acid）。1902年德国帕林大学著名化学家Fischer与Leuchs等人验证了此结构式，并确定其分子结构。1907年Fischer发现天然蛋白质中的丝氨酸是一种具有光学活性的物质，其光学活性为L-型，故蛋白质中的丝氨酸通称为L-丝氨酸。

L-丝氨酸在生物体内可由糖代谢的中间产物3-磷酸甘油酸经三步反应合成，故称为非必需氨基酸。同时，在生物体内L-丝氨酸通过体内酶作用，经脱水、脱氢生成丙酮酸，所以是一种生糖氨基酸。L-丝氨酸具有许多重要的生理功能，在生物体内是合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱等的前体物，在医药、化妆品、化工和科学研究中有广泛的用途。在医药领域，L-丝氨酸是氨基酸营养输液的重要成分，是合成L-多巴、抗生素——雷米普利等产品的中间体，是合成抗癌、抗艾滋病新药和多种药物如偶氮丝氨酸、环丝氨酸、磷脂酰丝氨酸、α-取代丝氨酸和 (s)-异丝氨酸等的出发原料。在化妆品领域，L-丝氨酸是重要的自然保湿因子，应用于化妆品可起增加表皮细胞活力，延缓皮肤衰老，同时还具有抗菌、改善皮肤弹性和强化营养的作用，因此是高级化妆品必需的添加剂。

L-丝氨酸的生产方法有蛋白质提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶转化法四种。蛋白质提取法是以丝胶、丝素、废蚕丝等蛋白质为原料，经酸水解、树脂分离、结晶提取制备L-丝氨酸。上世纪我国主要采用此法生产；化学合成法是以丙烯腈或丙烯酸甲酯或甘氨酸等为出发原料，经多步化学反应制成DL-丝氨酸，再拆分制备L-丝氨酸。日本采用丙烯腈为出发原料生产；微生物发酵法是以具有高活力丝氨酸转羟甲基酶的菌株为生产菌株，甘氨酸为前体物，经发酵把甘氨酸转化为L-丝氨酸；酶转化法是以甘氨酸和甲醛为原料，在辅助因子5-磷酸吡哆醛（PLP)和四氢叶酸(THFA)存在下，经丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）酶促反应制备L-丝氨酸。目前微生物发酵法和酶转化法已在国内外应用。

L-丝氨酸虽然有四种生产方法，但最后均需采用结晶工艺提纯产品，才能获得L-丝氨酸产品，实现经济价值。目前用于氨基酸生产的结晶工艺主要有冷却结晶、溶析结晶、蒸发结晶和等电点反应结晶四种。

1、冷却结晶是利用氨基酸在不同温度下溶解度不同的性质，采用降温方式改变溶液体系介稳定区，使氨基酸从溶液中析出。通常采取把待结晶溶液浓缩至一定浓度，然后转入结晶

罐内以逐步降温的方式，使氨基酸从溶液中析出。此工艺的溶液体系为水相，故所得产品为水合物结晶，结晶体为单斜晶。很多氨基酸如L-纈氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸等采用此结晶工艺。

2、溶析结晶是利用有机溶剂能迅速改变体系的介稳定区，影响氨基酸在体系中的溶解度，使氨基酸从溶液中析出。此工艺的溶液体系为水-有机溶剂相或有机溶剂-水相，故所得产品以无水物结晶为主，结晶体一般为斜方晶或方晶。一些在水相体系不易结晶或水溶解度大的氨基酸多采用此结晶工艺，如L-组氨酸、L-脯氨酸等。但加入体系的有机溶剂量越大，有机溶剂残留机率越高。

3、蒸发结晶是采用减压蒸发水分方式，在较高温度下将待结晶溶液浓缩至超溶解度状态，再逐步降温，使氨基酸从溶液中析出。此工艺的溶液体系为水相，处于超溶解度状态的氨基酸溶液放入结晶罐后，温度下降导致大量结晶迅速析出，故所得结晶是水合物和无水物的混合体。一些水溶解度很大的氨基酸盐如L-精氨酸酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐等采用这一结晶工艺。此结晶工艺比其它工艺设备投资大、能耗高。

4、等电点反应结晶是采用加入碱调节氨基酸溶液的pH值，使氨基酸在其特定等电点下结晶析出的结晶工艺。此工艺的溶液体系为水相，结晶的晶型与加碱液速度、搅拌速度有密切关系。主要用于水溶性很低的氨基酸如L-胱氨酸、L-酪氨酸的结晶。

氨基酸的晶型不但直接关系到氨基酸产品本身的品质，而且影响下游产品的质量，也增加下游产品的生产成本。2002年，韩金玉等（化工进展，2002，21（12）：945-948）在介绍“新型药物结晶技术”一文中，引述了Shekunov 和York关于结晶晶型对药物影响的研究并指出：结晶度(不定型或半结晶形态的存在)影响药物的物理化学稳定性，多晶型、晶格缺陷等影响药物的溶解度曲线和溶解速率，颗粒尺寸分布大影响药物的加工性能，颗粒表面结构影响药剂的稳定性和均匀性，有机、无机杂质和残余溶剂等给药物带入毒性。国内某药厂用国产粉状晶体和小粒状方晶L-丝氨酸产品生产L-丝氨酸衍生物，与用日本进口的柱状结晶体L-丝氨酸对比，原料消耗量分别增加4.8%和3.8%，而且用柱状结晶体L-丝氨酸生产的L-丝氨酸衍生物不结球，用粉状晶体的则结球。

为了获得氨基酸的优良晶型，不少研究者展开了相关研究。1999年，吴月等（南京化工大学学报，1999，21（3）：27-31）采用加入2%晶种，匀速滴加硫酸，间歇冷却操作方式，以等电点沉淀结晶工艺和冷却结晶工艺制备L-天冬氨酸，得到L-天冬氨酸的晶体晶形完整，颗粒大小分布均匀，分散性好。2001年，于淑娟等（齐齐哈尔大学学报，2001，17（3）：5-8）采用磁场-溶剂协同起晶法制得α型谷氨酸晶体晶种，然后以加晶种等电点提取L-谷氨酸的工艺，得到的晶体外观、颜色和晶习都有较大改善，晶体的纯度也有较大提高的L-谷氨酸产品，比工业上常用的结晶工艺结晶收率提高了约5%。2008年，孟献梁等（中国矿业大学学报，2008，37（3）：412-415）采用正交试验对水与L-苯丙氨酸质量比、结晶体系、结晶温度三个影响L-苯丙氨酸结晶的因素进行工艺优化，确定了水和L-苯丙氨酸的质量比为1：3，以盐酸-三乙胺/ DMF 为结晶体系，结晶初始温度25℃，中期温度55℃，终了温度15℃的优化工艺，制得L-苯丙氨酸结晶粒度分布均匀, 晶面完整，收率达到85 % 以上。2008年，李侠等（化学工业与工程，2008，25（2）：129-133）采用激光法测定了L-丝氨酸在水中的溶解度表明L-丝氨酸无水合晶体与水合晶体的晶型转变温度为309.14 K，并发现在水相体系冷却结晶过程中，高温条件下L-丝氨酸主要通过分子间的氢键作用形成无水合晶体，但冷却至晶型转变温度以下时，则主要通过L-丝氨酸与水分子的氢键作用形成水合晶体（六角片状的水合晶体）。

L-丝氨酸是水溶性很大的氨基酸，在100g水中的溶解度为25.4g(10℃)、72.0g(50℃)，因此上述的前三种结晶工艺均可采用。国内厂家生产L-丝氨酸主要采用冷却结晶或溶析结晶这两种结晶工艺。L-丝氨酸的分子结构决定了它与水分子的结合能力极强，若采用冷却结晶工艺，在晶体长成过程中L-丝氨酸易形成水合晶核和水合微晶，且微晶长大过程较缓慢，因此很容易使溶液中的杂质包埋于结晶体内，在随后的结晶干燥工序水分挥发，水合结晶破碎成粉状晶，杂质则残留在产品中，所以采用冷却结晶工艺的L-丝氨酸结晶为不定型或半结晶形态，纯度较低。采用溶析结晶工艺，有机溶剂改变了溶液体系的极性，使L-丝氨酸晶体长成过程中结合水分子的机率减少，从而可获得颗粒状方晶。不过，此工艺的晶核是在加入有机溶剂后形成，晶体长成过程很难避免有机溶剂包埋于结晶体内，虽然所得L-丝氨酸的晶型较冷却结晶工艺好，纯度也较冷却结晶工艺高，但包埋的有机溶剂给L-丝氨酸的应用带来不利影响。如果有机溶剂加入量控制不当，结晶迅速长大，有机溶剂包埋量更高。

现行采用的上述两种结晶工艺，很难获得优良晶型的L-丝氨酸。因此，解决L-丝氨酸的晶型问题，是当前L-丝氨酸生产的关键技术。但迄今为止，涉及本发明的L-丝氨酸柱状结晶体结晶工艺尚未见文献或专利报道。

发明内容

本发明的目的在于建立一种L-丝氨酸的柱状结晶体结晶工艺和为医药领域、化妆品领域提供优质L-丝氨酸原料。

本发明可通过以下技术方案来达到：

1.        L-丝氨酸粗品经溶解、脱色等处理，制成纯化的L-丝氨酸结晶液；

2.        纯化的L-丝氨酸结晶液在30～50℃，搅拌下培育不含结晶水的L-丝氨酸晶核，并逐渐长成柱状体微晶；

3.        在搅拌下加入甲醇或乙醇，控制醇浓度10～50%，搅拌下使L-丝氨酸的柱状体微晶不断长大，控制搅拌速度，使长大至一定重量的柱状结晶体缓慢沉降，待柱状结晶体析出完成时，停止搅拌，放料；

4.        柱状结晶体离心甩干，醇洗涤后，60℃干燥，获得L-丝氨酸的柱状结晶体产品；

5.        离心机甩出的溶液输回结晶罐，在醇浓度30%-50%、温度5℃-10℃条件下继续结晶，回收滤液中未结晶的L-丝氨酸。

本发明的L-丝氨酸柱状结晶体可作为抗癌、抗艾滋病新药、医药中间体原料，用于高级化妆品添加剂。

上述1中的L-丝氨酸粗品为经醇洗涤后离心甩干的未经干燥产品，溶解水为反浸透水，脱色用活性炭为味精级碳，添加量为L-丝氨酸粗品的3～5%，脱色液经碳棒过滤器过滤。

上述2中的温度控制，30～50℃温度范围采用全自动控制电热水箱的热水控制。

上述3中采用的甲醇为96～97%，采用的乙醇为95%、98%。

上述4中的洗涤用醇为95%乙醇，干燥方式为常压下烘干。

上述5中的不低于5℃温度采用乙二醇冷媒控制。

本发明与现有国内结晶工艺相比具有如下优点：

1.        本发明采用的结晶工艺，是在水相体系中，控制结晶过程不稳定区和介稳定区之间变化，使L-丝氨酸首先形成不带结晶水的晶核，并适当长成柱状微晶；

2.        本发明采用的结晶工艺，是当水相体系的柱状微晶育成后即加入有机溶剂，不断改变溶液体系的极性，使柱状结晶体在水-有机溶剂相体系下长成；

3.        本发明采用的结晶工艺，既不是单纯的水相体系下冷却结晶工艺，也不是单一的溶析结晶工艺，而是两个工艺经优化组合产生的一个新的结晶工艺；

4.        按本发明的结晶工艺操作，所得L-丝氨酸不是粉末晶体或六角斜方晶体，而是柱状结晶体；

5.        本发明采用的结晶工艺，所得L-丝氨酸产品，按日本味之素株式会社质量标准（2002版本）检测，产品含量与产品透过率均不低于99.0 %；

6.        本发明采用的结晶工艺，可以在通用的结晶罐中完成L-丝氨酸的结晶，不需要增添特殊结晶设备，生产厂可应用原生产设备实施本发明的结晶工艺，所以有投资少，见效快，效益高的优点；

7.        本发明采用的结晶工艺，只需控制温度、醇浓度、搅拌速度三个控制点，有利于生产工艺和产品质量的稳定，实用性强；

8.        本发明采用的结晶工艺，操作简单，易被操作工人掌握，适合工业化推广应用。

附图说明

1、图1  冷却结晶工艺，水相体系所得的L-丝氨酸结晶体，易破碎成不定型或半结晶形态，×10

2、图2  溶析结晶工艺，甲醇-水相体系经降温所得的L-丝氨酸结晶体，为含包埋物的方晶形态，×10

3、图3  溶析结晶工艺，甲醇-水相体系所得的L-丝氨酸结晶体，为含包埋物的颗粒状方晶形态，×10

4、图4  本发明结晶工艺水相体系育成的L-丝氨酸柱状结晶微晶，×40

5、图5  本发明结晶工艺水-醇相体系所得的L-丝氨酸柱状体结晶形态，×10。

具体实施方式

实例一

1.        称取L-丝氨酸粗品5000g，投进装有8.0L反浸透水的反应罐中，搅拌下升温至约70℃溶解粗品，粗品溶解完全后，加入150～250g活性炭，脱色30min，然后将溶液输入碳棒过滤器过滤去除活性炭，过滤清液约10.0L为待结晶溶液；

2.        将待结晶溶液输入结晶罐中，以电热水箱热水控制结晶罐内温度30～50℃，搅拌至可看见L-丝氨酸微晶出现；

3.        待L-丝氨酸微晶出现后，加入比例量甲醇、控制温度30～50℃，使L-丝氨酸的柱状结晶体缓慢长大，视结晶情况再加入比例量甲醇，控制甲醇浓度在10～50%，使生成的柱状结晶体不断增加，控制搅拌速度，让已长成的柱状结晶体沉降，保障生成的结晶体均一；

4.        观察结晶罐内L-丝氨酸的柱状结晶体结晶情况，当发现柱状结晶体不再长大时，停止搅拌，使已长成的柱状结晶体沉降；

5.        将沉降于结晶罐下部的柱状结晶体移入离心机，甩干，滤液输回结晶罐，甩干的结晶体加入适量乙醇洗涤二次，甩干后从离心机移出；

6.        将甩干的结晶体置于干燥箱内，控制温度60℃，常压下干燥约6h，获得L-丝氨酸的柱状结晶体2950g；

7.        输回结晶罐的滤液，在醇浓度约50%，温度不低于5℃条件下继续结晶，回收滤液中未结晶的L-丝氨酸；

8.        干燥后的柱状结晶体送捡，按日本味之素株式会社质量标准（2002版本）检测，产品含量99.2 %，产品透过率99.0%。

实例二

1.        称取L-丝氨酸粗品5000g，投进装有8.0L反浸透水的反应罐中，搅拌下升温至约70℃溶解粗品，粗品溶解完全后，加入150～250g活性炭，脱色30 min，然后将溶液输入碳棒过滤器过滤去除活性炭，过滤清液约10.0L为待结晶溶液；

2.        将待结晶溶液输入结晶罐中，以电热水箱热水控制结晶罐内温度30～50℃，搅拌至可看见L-丝氨酸微晶出现；

3.        待L-丝氨酸微晶出现后，加入比例量甲醇，控制温度30～50℃，使L-丝氨酸的柱状结晶体缓慢长大，视结晶情况再加入比例量甲醇，控制甲醇浓度在10～50%，使生成的柱状结晶体不断增加，控制搅拌速度，让已长成的柱状结晶体沉降，保障生成的结晶体均一；

4.        观察结晶罐内L-丝氨酸的柱状结晶体结晶情况，当发现柱状结晶体不再长大时，停止搅拌，使已长成的柱状结晶体沉降；

5.        将沉降于结晶罐下部的柱状结晶体移入离心机，甩干，滤液输回结晶罐，甩干的结晶体加入适量乙醇洗涤二次，甩干后从离心机移出；

6.        将甩干的结晶体置于干燥箱内，控制温度60℃，常压下干燥6h，获得L-丝氨酸的柱状结晶体3030g；

7.        输回结晶罐的滤液，在醇浓度约50%、温度不低于5℃条件下继续结晶，回收滤液中未结晶的L-丝氨酸；

8.        干燥后的柱状结晶体送捡，按日本味之素株式会社质量标准（2002版本）检测，产品含量99.0 %，产品透过率99.0%。

实例三

1.        称取L-丝氨酸粗品5000g，投进装有8.0L反浸透水的反应罐中，搅拌下升温至约70℃溶解粗品，粗品溶解完全后，加入150～250g活性炭，脱色30 min，然后将溶液输入碳棒过滤器过滤去除活性炭，过滤清液约10.0L为待结晶溶液；

2.        将待结晶溶液输入结晶罐中，以电热水箱热水控制结晶罐内温度30～50℃，搅拌至可看见L-丝氨酸微晶出现；

3.        待L-丝氨酸微晶出现后，加入比例量乙醇，控制温度30～50℃，使L-丝氨酸的柱状结晶体缓慢长大，视结晶情况再加入比例量乙醇，控制乙醇浓度在10～50%，使生成的柱状结晶体不断增加，控制搅拌速度，让已长成的柱状结晶体沉降，保障生成的结晶体均一；

4.        观察结晶罐内L-丝氨酸的柱状结晶体结晶情况，当发现柱状结晶体不再长大时，停止搅拌，使已长成的柱状结晶体沉降；

5.        将沉降于结晶罐下部的柱状结晶体移入离心机，甩干，滤液输回结晶罐，甩干的结晶体加入适量乙醇洗涤二次，甩干后从离心机移出；

6.        将甩干的结晶体置于干燥箱内，控制温度60℃，常压下干燥约6 h，获得L-丝氨酸的柱状结晶体2900g；

7.        输回结晶罐的滤液，在醇浓度约50%，温度不低于5℃条件下继续结晶，回收滤液中未结晶的L-丝氨酸；

8.        干燥后的柱状结晶体送捡，按日本味之素株式会社质量标准（2002版本）检测，产品含量99.2 %，产品透过率99.3%。

实例四

1.        称取L-丝氨酸粗品5000g，投进装有8.0L反浸透水的反应罐中，搅拌下升温至约70℃溶解粗品，粗品溶解完全后，加入150～250g活性炭，脱色30 min，然后将溶液输入碳棒过滤器过滤去除活性炭，过滤清液约10.0L为待结晶溶液；

2.        将待结晶溶液输入结晶罐中，以电热水箱热水控制结晶罐内温度30～50℃，搅拌至可看见L-丝氨酸微晶出现；

3.        待L-丝氨酸微晶出现后，加入比例量乙醇，控制温度30～50℃，使L-丝氨酸的柱状结晶体缓慢长大，视结晶情况再加入比例量乙醇，控制乙醇浓度在10～50%，使生成的柱状结晶体不断增加，控制搅拌速度，让已长成的柱状结晶体沉降，保障生成的结晶体均一；

4.        观察结晶罐内L-丝氨酸的柱状结晶体结晶情况，当发现柱状结晶体不再长大时，停止搅拌，使已长成的柱状结晶体沉降；

5.        将沉降于结晶罐下部的柱状结晶体移入离心机，甩干，滤液输回结晶罐，甩干的结晶体加入适量乙醇洗涤二次，甩干后从离心机移出；

6.        将甩干的结晶体置于干燥箱内，控制温度60℃，常压下干燥约6h，获得L-丝氨酸的柱状结晶体2860g；

7.         输回结晶罐的滤液，在醇浓度约50%、温度不低于5℃条件下继续结晶，回收滤液中未结晶的L-丝氨酸；

干燥后的柱状结晶体送捡，按日本味之素株式会社质量标准（2002版本）检测，产品含量99.4 %，产品透过率99.3%。