一种重组大肠杆菌及应用其以单一碳源生产PHBV的方法

摘要

本发明公开了一种重组大肠杆菌QW103PT及其在利用单一碳源生产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)中的应用，本发明的重组大肠杆菌能够高效利用单一碳源合成PHBV，与重组菌DH5α(pBHR68)相比，其3HV的摩尔分数由0.45％提高到17.5％，对PHBV的商业生产具有显著的意义。本发明解决了丙酸作为辅助碳源成本过高及生产过程中控制策略过于复杂的问题，开创了利用简单碳源合成PHBV的新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌及其生产生物可降解塑料的方法，尤其涉及一种产PHBV(聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)的重组大肠杆菌及其利用廉价的单一的简单碳源生产PHBV的方法，属于基因工程和微生物发酵领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoat，简称PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及由官能团引起的其它特殊性能。PHA的性质决定了它具有可作为生物可降解塑料、组织工程的支架材料等许多潜在的应用前景，因此，国内外都对其进行大量的基础和应用开发研究。

PHBV是PHA聚合物家族中的一员，它是由3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)两种短链单体聚合而成的一类高分子化合物。PHBV与均聚物PHB相比，其性能更接近于石化来源的聚乙烯塑料。PHB的化学结构决定了它的高结晶度(60～80％)，因而硬且脆，断裂延伸率很低；而且PHB在加热温度高于熔点(180℃)10℃以上时，就会裂解，从而增加了PHB的加工处理难度。针对这些缺点，渗入3HV单体使得共聚物PHBV的结晶度下降，相应的硬度下降，但强度提高，韧性增强；并且PHBV的熔点随着3HV单体浓度的增加而下降，但PHBV分子的分解温度却没有相应下降。PHBV的优良性能决定了它相对于PHB具有更为广泛的用途。随着世界范围内能源危机的加剧、以及环境保护意识的增强，PHBV类材料的开发以及利用已引起了科研领域以及工业界的广泛兴趣。

从PHBV的合成途径可以看出，细胞中丙酰辅酶A的含量直接决定PHBV中3HV单体的含量。一般来说，要在细胞中合成PHBV，除了以葡萄糖作为主要碳源外，还必须向发酵液中加入含有奇数碳的辅助碳源，作为合成丙酰辅酶A的前体，如丙酸、戊酸、正戊醇等。在利用重组大肠杆菌合成PHBV的相关报道中，绝大部分都是利用丙酸作为PHBV合成的辅助碳源。但是，丙酸作为应用最广泛的PHBV合成的前体物，在PHBV生产中也存在一定的缺点：1)与常用的简单碳源(如葡萄糖)相比，丙酸的价格较贵，增大了PHBV的生产成本；2)丙酸是一种毒性较高的化合物，会抑制细胞的生长。因此，在传统的PHBV的发酵生产上都要严格控制丙酸的浓度以防止其抑制细胞生长。

利用廉价的简单碳源(如葡萄糖)合成PHBV，可以解决PHBV生产成本过高及传统的生产过程控制较为复杂的问题。因此，微生物利用单一的简单碳源合成PHBV成为近年来研究的热点。在早期的研究中，研究者们分别在Alcaligenes eutrophus和大肠杆菌中实现了利用葡萄糖等简单碳源合成PHBV。但是，这些尝试获得的PHBV产物中3HV的摩尔分数都较低，无法满足工业材料的需要。最近，Aldor等人在重组Salmonella enterica SerovarTyphimurium中构建了一条利用甘油合成PHBV的途径，可以获得3HV摩尔分数达到30％以上的PHBV共聚物。然而，该方法在生产过程中，需要向培养基中加入昂贵的CN-B₁₂，从而增加了PHBV的生产成本。

自然界中存在某些微生物能够利用单一碳源直接合成PHBV。例如诺卡氏菌属(Nocardia)或红球菌属(Rhodococcus)中的某些野生菌能够利用葡萄糖为单一碳源合成3HV高含量的PHBV共聚物(3HV摩尔分数可达到75％以上)。这些野生菌用于合成3HV的丙酰CoA来源于2-甲基丙二酰CoA途径，该途径能够将TCA循环和PHBV合成途径联系到一起。

而上述野生的PHBV产生菌一般对营养要求较高，生长速度较慢，聚合物需要在营养不均衡的条件下产生，且回收困难，不利于大规模生产。

大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，底物利用范围广，生长速度较快，易于大规模培养，且细胞容易破碎，是理想的PHBV生产菌种。然而，申请人在相关的检索中发现，通过基因工程技术构建重组大肠杆菌，利用葡萄糖、木糖等单一碳源经苏氨酸合成途径生产PHBV，解决传统PHBV生产上成本过高和控制策略相对复杂问题的专利和文献还未见报道。

发明内容

针对现有技术中利用丙酸合成PHBV成本过高及控制策略过于复杂的问题，本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌并利用所述重组大肠杆菌以单一碳源生产PHBV的方法。

本发明所述产PHBV(聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)的重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌QW103PT，由如下方法制得，即：以基因工程技术敲除大肠杆菌中的prpC基因，得到大肠杆菌QW100；再在菌株QW100中敲除scpC基因得到大肠杆菌QW102；再进一步在菌株QW102中敲除pta基因，获得基因型为E.coli ΔprpC ΔscpC Δpta的大肠杆菌QW103；然后将来源于大肠杆菌MG1655的已将thrA基因1034位的C碱基突变为T碱基的thrABC基因簇插入到载体pCL1920中，获得thrABC基因表达载体pCL-thrABC，将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutropha)中的phbCAB基因簇以及来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的ilvA基因依次插入到载体pBluescript SK^-中，获得PHBV合成酶和苏氨酸脱氨酶双表达载体pHB-ilvA；最后将获得表达载体pCL-thrABC和pHB-ilvA分别转化进入大肠杆菌QW103中，得到产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)的重组大肠杆菌菌株QW103PT。

上述产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)的重组大肠杆菌的出发菌株大肠杆菌选大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌W3110或大肠杆菌XL1-Blue。进一步优选大肠杆菌DH5α。

上述产PHBV的重组大肠杆菌QW103PT外形呈杆状，大小为0.4～0.7微米×1～3微米，无芽胞。有普通菌毛与性菌毛，属于革兰氏阴性杆菌。此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42～44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15～46℃。

本发明所述重组大肠杆菌在利用单一碳源生产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)中的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌应用的方法是：

(1)菌种选择：重组大肠杆菌QW103PT；

(2)平板培养：将重组大肠杆菌QW103PT菌种接种于含有质量百分比为1.5～2.0％的琼脂并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，25～42℃条件下，静置培养8～16小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100毫升并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以体积比为5～15％的的接种量，将步骤(3)的种子液接种于200～1000毫升并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟振荡培养8～16小时，制得扩大量的培养菌液；

(5)发酵培养：以5～15％的体积比的接种量，将步骤(4)所述培养菌液接种于含培发酵养基工作体积为2.5～3.5升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为50～150微克/毫升氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其终浓度达到0.2～0.6毫摩尔/升；在25～40℃下诱导培养1～3小时使菌体OD₆₀₀达到1～2，之后向菌液中加入碳源，使菌液中的总糖含量达到5～30克/升，维持pH值在5.5～9.0，搅拌转速为100-500转/分钟，25～42℃条件下，发酵培养24～72小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心10～30分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，再5,000转/分钟离心10～30分钟收集细胞；

(7)聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中12～30小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其8～10倍体积的丙酮，50～60℃处理20～60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体8～10倍体积的氯仿，40～60℃浸提1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)产物。

上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度优选是35～40℃；氨苄霉素的终浓度优选是80～120微克/毫升，壮观霉素的终浓度优选是45～60微克/毫升。

上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养时间优选为10～14小时。

上述的应用中，步骤(5)中所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入的终浓度优选为0.3～0.5毫摩尔/升，诱导时间优选为2～3小时。

上述的应用中，步骤(5)中所述碳源选葡萄糖、木糖或甘油；进一步优选木糖。

上述的应用中，步骤(5)中所述菌液中的总糖含量优选为10～20克/升。

其中，所述的总糖质量的计算方式为(以葡萄糖计)：总糖质量(克)＝使用碳源的物质的量(摩尔)×该碳源所含碳原子数÷6×葡萄糖的分子量(克/摩尔)。

上述的应用中，步骤(5)中所述菌体发酵时间优选为36～60小时，所述pH值维持在7.0～8.0。

本发明所述的大肠杆菌MG1655、JM109、W3110和DH5α来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；真养产碱杆菌Alcaligenes eutropha和谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)；质粒pBluescript SK^-、pKD46、pKD3、pKD4和pCP20来源于DSMZ(德国微生物保藏中心)。

本发明创造性地利用重组大肠杆菌，使其能够利用单一碳源生产PHBV，在发酵48小时后，大肠杆菌胞内PHBV含量达到11.1％，其中3HV的摩尔分数达到17.5％。与传统的PHBV生产方法相比，解决了丙酸作为辅助碳源成本过高及生产过程中控制策略过于复杂的问题，开创了利用简单碳源合成PHBV的新思路。

具体实施方式

实施例1.菌株构建

(a).prpC基因的敲除：

I)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

①挑取大肠杆菌单菌落接种于LB液体试管，37℃振荡培养过夜。之后按1％转接量(体积比)接种过夜培养物于30毫升新鲜LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养，约2h至OD₆₀₀为0.4～0.5。

②4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。之后用10毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂悬浮菌体。

③4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。之后用10毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂悬浮菌体，置于冰上放置30分钟。

④4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂-甘油溶液悬浮菌体。

⑤将菌液以100微升/管分装入1.5毫升无菌离心管中，放置于-70℃冻存备用。

II)质粒pKD46的大肠杆菌转化

①取100微升贮存于-70℃的大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴使之成为液态。

②加入连接产物10微升，轻轻混匀，冰浴30分钟。

③在42℃水浴中热激90秒，之后迅速转移至冰浴中，继续冰浴2～3分钟。

④加入LB液体培养基900微升，于37℃缓慢振荡培养60分钟。

⑤取适量培养液涂于1.5％琼脂LB的氨苄霉素抗性平板，37℃正面向上培养1小时，之后再倒置培养至菌落长出。

III)同源重组片断的克隆

设计引物pKD-prpC1与pKD-prpC2，以质粒pKD3为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片断。

其中，上述pKD-prpC1、pKD-prpC2引物序列为：

pKD-prpC1：

5′-ACCCATGTCATTAAACCGAAAAAATCTGTGGC

ACTTTCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-prpC2：

5′-GCGGTCTTCCGGTCCAACATAATTGGCGGAAG

GACGGATATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

PCR反应体系如下：(引物浓度为20微摩尔/升)

10×缓冲液    5微升；

25mmol/L MgCl₂    4微升；

10mmol/L四种dNTP混合液  1微升；

引物pKD-prpC1与pKD-prpC2  各1微升；

Taq DNA聚合酶  0.5微升；

模板DNA 1微升，加水补至50微升；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。

IV)电转化感受态细胞的制备

①挑取已转入质粒pKD46的大肠杆菌DH5α，转入LB培养基中，培养OD₆₀₀至0.6；

②冰浴15分钟，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤三次；

③加入10％的甘油，浓缩50倍，分装感受态细胞。

V)电转化，筛选重组子

①吸取7～10微升的上述(I)获得的同源重组片断，加入100微升的上述感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5千伏，电击；

②加入900微升的LB培养基，37℃，100转/分钟培养1小时；

③涂布卡那霉素抗性平板培养，挑取重组子，以引物prpC-testF和prpC-testR进行PCR检测，挑取prpC缺陷型的大肠杆菌菌株。

其中，上述prpC-testF、prpC-testR引物序列为：

prpC-testF：5′-GCCCGTAGCCAGGTGAAATA-3′

prpC-testR：5′-CGGATGTTGTTGATTTGAGC-3′

VI)质粒pKD46的消除

将上述得到的大肠杆菌菌株在42℃培养16-30小时后，划线挑取单菌落分别涂布含有100μg/mL的氨苄霉素和25μg/mL的卡那霉素的LB平板，挑取在氨苄霉素平板上不能生长而在卡那霉素平板上可以生长的菌落，即为消除质粒pKD46的大肠杆菌菌株。

VII)卡那霉素抗性的消除

将上述消除pKD46的大肠杆菌菌株按照上述I)中的方法制备成感受态细胞，然后按照上述II)中的方法将质粒pCP20转入VI)中所述消除质粒pKD46的大肠杆菌菌株。然后，将该菌株30℃培养8-10小时后，转接到LB液体培养基中42℃培养2-4小时后划线挑取单菌落，然后分别涂布卡那霉素平板和无抗性LB平板，获得去除卡那霉素抗性的大肠杆菌prpC缺陷型菌株QW100。

(b).scpC基因的敲除：

I)大肠杆菌QW100感受态细胞的制备

①挑取大肠杆菌单菌落接种于LB液体试管，37℃振荡培养过夜。之后按1％转接量(体积比)接种过夜培养物于30毫升新鲜LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养，约2h至OD₆₀₀为0.4-0.5。

②4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。之后用10毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂悬浮菌体。

③4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。之后用10毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂悬浮菌体，置于冰上放置30分钟。

④4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂-甘油溶液悬浮菌体。

⑤将菌液以100微升/管分装入1.5毫升无菌离心管中，放置于-70℃冻存备用。

II)质粒pKD46的大肠杆菌转化

①取100微升贮存于-70℃的大肠杆菌QW100感受态细胞，冰浴使之成为液态。

②加入连接产物10微升，轻轻混匀，冰浴30分钟。

③在42℃水浴中热激90s，之后迅速转移至冰浴中，继续冰浴2～3分钟。

④加入LB液体培养基900微升，于37℃缓慢振荡培养60分钟。

⑤取适量培养液涂于1.5％琼脂LB的Amp抗性平板，37℃正面向上培养1h，之后再倒置培养至菌落长出。

III)同源重组片断的克隆

设计引物pKD-scpC1与pKD-scpC2，以质粒pKD3为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片断。

其中，pKD-scpC1、pKD-scpC2引物序列为：

pKD-scpC1：

5′-GCCGCTGACGATGTACTTTCTGACGCCGTAGC

TGTTTCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-scpC2：

5′-TTAACCCAGCATCGAGCCGGTTGCAATTAAAT

TACGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

PCR反应体系如下：(引物浓度为20微摩尔/升)

10×缓冲液    5微升；

25mmol/L MgCl₂    4微升；

10mmol/L四种dNTP混合液  1微升；

引物pKD-scpC1与pKD-scpC2  各1微升；

Taq DNA聚合酶  0.5微升；

模板DNA 1微升，加水补至50微升；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。

IV)电转化感受态细胞的制备

①挑取已转入质粒pKD46的大肠杆菌QW100，转入LB培养基中，培养OD₆₀₀至0.6；

②冰浴15分钟，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤三次；

③加入10％的甘油，浓缩50倍，分装感受态细胞。

V)电转化，筛选重组子

①吸取7～10微升的上述(I)获得的同源重组片断，加入100微升的上述感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5千伏，电击；

②加入900微升的LB培养基，37℃，100转/分钟培养1小时；

③涂布25μg/mL的卡那霉素抗性平板培养，挑取重组子，以引物scpC-testF和scpC-testR进行PCR检测，挑取scpC缺陷型的大肠杆菌菌株。

其中，上述scpC-testF、scpC-testR引物序列为：

scpC-testF：5′-ATGGAAACTCAGTGGACAAG-3′

scpC-testR：5′-TTAACCCAGCATCGAGCCGG-3′

VI)质粒pKD46的消除

将上述得到的大肠杆菌菌株在42℃培养16-30小时后，划线挑取单菌落分别涂布含有100μg/mL的氨苄霉素和25μg/mL的卡那霉素的LB平板，挑取在氨苄霉素平板上不能生长而在卡那霉素平板上可以生长的菌落，即为消除质粒pKD46的大肠杆菌菌株。

VII)卡那霉素抗性的消除

将上述消除pKD46的大肠杆菌菌株按照上述I)中的方法制备成感受态细胞，然后按照上述II)中的方法将质粒pCP20转入VII)中所述消除质粒pKD46的大肠杆菌。然后，将该菌株30℃培养8～10小时后，转接到LB液体培养基中42℃培养2～4小时后划线挑取单菌落，然后分别涂布卡那霉素平板和无抗性LB平板，获得去除卡那霉素抗性的大肠杆菌prpC和scpC缺陷型菌株QW102。

(c).pta基因的敲除：

I)大肠杆菌QW102感受态细胞的制备

①挑取大肠杆菌单菌落接种于LB液体试管，37℃振荡培养过夜。之后按1％转接量(体积比)接种过夜培养物于30毫升新鲜LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养，约2h至OD₆₀₀为0.4-0.5。

②4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。之后用10毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂悬浮菌体。

③4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。之后用10毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂悬浮菌体，置于冰上放置30分钟。

④4000转/分，4℃离心10分钟，收集菌体。加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂-甘油溶液悬浮菌体。

⑤将菌液以100微升/管分装入1.5毫升无菌离心管中，放置于-70℃冻存备用。

II)质粒pKD46的大肠杆菌转化

①取100微升贮存于-70℃的大肠杆菌QW102感受态细胞，冰浴使之成为液态。

②加入连接产物10微升，轻轻混匀，冰浴30分钟。

③在42℃水浴中热激90秒，之后迅速转移至冰浴中，继续冰浴2～3分钟。

④加入LB液体培养基900微升，于37℃缓慢振荡培养60分钟。

⑤取适量培养液涂于1.5％琼脂LB的氨苄霉素抗性平板，37℃正面向上培养1h，之后再倒置培养至菌落长出。

III)同源重组片断的克隆

设计引物pKD-pta1与pKD-pta2，以质粒pKD4为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。

其中，上述pKD-pta1、pKD-pta2引物序列为：

pKD-pta1：

5′-GTGGCCGCTTGCCTGGCAGCCATGAACGGCGT

AGAAATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-pta2：

5′-TTACTGCTGCTGTGCAGACTGAATCGCAGTCA

GCGCGATATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

PCR反应体系如下：(引物浓度为20微摩尔/升)

10×缓冲液    5微升；

25mmol/L MgCl₂    4微升；

10mmol/L四种dNTP混合液  1微升；

引物pKD-pta1与pKD-pta2  各1微升；

Taq DNA聚合酶  0.5微升；

模板DNA 1微升，加水补至50微升；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。

IV)电转化感受态细胞的制备

①挑取已转入质粒pKD46的大肠杆菌QW100，转入LB培养基中，培养OD₆₀₀至0.6；

②冰浴15分钟，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤三次；

③加入10％的甘油，浓缩50倍，分装感受态细胞。

V)电转化，筛选重组子

①吸取7～10微升的上述(I)获得的同源重组片断，加入100微升的上述感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5千伏，电击；

②加入900微升的LB培养基，37℃，100转/分钟培养1小时；

③涂布氯霉素抗性平板培养，挑取重组子，以引物pta-testF和pta-testR进行PCR检测，挑取pta缺陷型的大肠杆菌菌株。

其中，pta-testF、pta-testR引物序列为：

pta-testF：5′-GTGCCGTGGAGCTTTGACCT-3′

pta-testR：5′-TTACTGCTGCTGTGCAGACT-3′

VI)质粒pKD46的消除

将上述得到的大肠杆菌菌株在42℃培养16-30小时后，划线挑取单菌落分别涂布含有100μg/mL的氨苄霉素和20μg/mL的氯霉素的LB平板，挑取在氨苄霉素平板上不能生长而在氯霉素平板上可以生长的菌落，即为消除质粒pKD46的大肠杆菌菌株。

VII)氯霉素抗性的消除

将上述消除pKD46的大肠杆菌菌株按照上述I)中的方法制备成感受态细胞，然后按照上述II)中的方法将质粒pCP20转入VI)所述消除质粒pKD46的大肠杆菌。然后，将该菌株30℃培养8-10小时后，转接到LB液体培养基中42℃培养2-4小时后划线挑取单菌落，然后分别涂布氯霉素平板和无抗性LB平板，获得去除氯霉素抗性的大肠杆菌prpC、scpC和pta缺陷型菌株QW103。

(d)苏氨酸脱氨酶及PHBV合成酶表达载体的构建

I)将含有phbCAB基因簇的真养产碱杆菌Alcaligenes eutropha和含有ilvA基因的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum分别接种于LB培养基中，利用通用细菌基因组提取试剂盒提取基因组；

II)根据Genbank公布的真养产碱杆菌和谷氨酸棒杆菌的基因组序列，分别设计引物PHB1、PHB2、ilvA1和ilvA2。

其中，上述PHB1、PHB2、ilvA1和ilvA2，引物序列如下：

PHB1：5′-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3′

PHB2：5′-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3′

ilvA1：5′-ATTAAGCTTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGT

GTGGAATTGTGAGGAAACAGAATGCATATGAGTGAAACATACGTG-3′

ilvA2：5′-ATTCTCGAGTTAGGTCAAGTATTCGTACTCAGGG-3′

III)克隆PHBV合成酶基因和苏氨酸脱氨酶基因

分别以含有phbCAB基因簇的真养产碱杆菌和含有ilvA基因的谷氨酸棒杆菌为模板，PCR扩增phbCAB基因簇和ilvA基因。

PCR反应体系如下：(引物浓度为20微摩尔/升)

10×缓冲液    5微升；

25mmol/LMgCl₂    4微升；

10mmol/L四种dNTP混合液  1微升；

上下游引物  各1微升；

TaqDNA聚合酶  0.5微升；

模板DNA1微升，加水补至50微升；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸5.5分钟(phbCAB基因簇)或1.5分钟(ilvA基因)，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

IV)PHBV合成酶表达载体的构建

将pBluescript SK^-和上述PCR产物(phbCAB基因簇)通过SmaI和EcoRI双酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，16℃反应16小时，获得PHBV合成酶表达载体pBHR68。

V)PHBV合成酶和苏氨酸脱氨酶双表达载体的构建

将上述得到的pBHR68和PCR获得的livA基因通过HindIII和XhoI双酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，16℃反应16小时，获得PHBV合成酶和苏氨酸脱氨酶双表达载体pHB-ilvA。

(e)苏氨酸合成酶表达载体的构建

I)thrA基因的定点突变

以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，分别利用两对引物thrA1/thrA2和thrA3/thrA4进行PCR扩增，分别得到大小为1061bp和1441bp的两条片段。将这两条片段纯化后混合，并以其为模板，以thrA1和thrA4为引物，进行PCR扩增，得到定点突变后的片段thrA^C1034T。

其中所述引物序列如下：

thrA1：5′-ACGCATGCATCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTA-3′

thrA2：5′-GATTGCGTAATCAGCACCACGAAAATACGGGCGCGTGACATCG-3′

thrA3：5’-CGATGTCACGCGCCCGTATTTTCGTGGTGCTGATTACGCAATC-3′

thrA4：5′-CACGCTCGAGTCAGACTCCTAACTTCCATGAG-3′

II)thrA基因表达载体的构建

将pCL1920和上述定点突变的thrA^C1034T片段通过通过NsiI和SacII双酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，16℃反应16小时，获得thrA基因表达载体pCL-thrA。

III)thrABC表达载体的构建

将pCL-thrA和从大肠杆菌MG1655中利用引物thrB1和thrC2克隆得到的thrBC基因通过SacII和XhoI双酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，16℃反应16小时，获得thrABC基因表达载体pCL-thrABC。

(f)PHBV生产菌株QW103PT的构建

将上述得到的QW103按照前述(a)-I中方法制成感受态细胞后，分别将质粒pHB-ilvA和pCL-thrABC转化进入菌株QW103，得到PHBV生产菌株重组大肠杆菌QW103PT。

上述重组大肠杆菌(Escherichia coli)QW103PT外形呈杆状，大小为0.4～0.7微米×1～3微米，无芽胞。有普通菌毛与性菌毛，属于革兰氏阴性杆菌。此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。

实施例2.重组大肠杆菌QW103PT利用木糖发酵生产PHBV，其中加入的总糖浓度为5克/升。

(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)QW103PT；

(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.5％的琼脂并加有终浓度为50微克/毫升的氨苄霉素和25微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，25℃条件下，静置培养8小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20毫升并加有终浓度为50微克/毫升的氨苄霉素和25微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，25℃条件下，150转/分钟摇床振荡培养8小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，将种子液接种于200mL并加有终浓度为50微克/毫升的氨苄霉素和25微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，25℃条件下，150转/分钟振荡培养8小时，制得扩大培养菌液；

(5)发酵培养：以5％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为2.5升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为50微克/毫升氨苄霉素和25微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.2毫摩尔/升；在25℃下诱导培养1小时使菌体OD₆₀₀达到1.0，之后向菌液中加入木糖(按照前述的换算公式木糖浓度应为6克/升)，使菌液中的总糖含量达到5克/升(以葡萄糖计)，维持pH值在5.5，搅拌转速为100转/分钟，25℃条件下，发酵培养24小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心10分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心10分钟收集细胞；

(7)PHBV提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中12小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其8～10倍体积的丙酮，50℃处理20～60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体8倍体积的氯仿，40℃浸提1小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHBV产物。

(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHBV样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，GC检测PHBV含量。

(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的18小时菌体达到最大浓度7.62克/升；发酵24小时后PHBV占细胞干重的8.16％，其中3HV摩尔分数为7.55％。

实施例3.重组大肠杆菌QW103PT利用木糖发酵生产PHBV，其中加入的总糖浓度为20克/升。

(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)QW103PT；

(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为2.0％的琼脂并加有终浓度为150微克/毫升的氨苄霉素和75微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，42℃条件下，静置培养16小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100毫升并加有终浓度为150微克/毫升的氨苄霉素和75微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，42℃条件下，250转/分钟摇床振荡培养16小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以15％的体积比的接种量，将种子液接种于1000毫升并加有终浓度为150微克/毫升的氨苄霉素和75微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，42℃条件下，250转/分钟振荡培养16小时，制得扩大培养菌液；

(5)发酵培养：以15％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为3.5升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为150微克/毫升氨苄霉素和75微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.6毫摩尔/升；在40℃下诱导培养3小时使菌体OD₆₀₀达到2.0，之后向菌液中加入木糖，使菌液中的总糖含量达到20克/升(以葡萄糖计)，维持pH值在9.0，搅拌转速为500转/分钟，42℃条件下，发酵培养72小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心30分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心30分钟收集细胞；

(7)PHBV提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中30小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其10倍体积的丙酮，60℃处理60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体10倍体积的氯仿，60℃浸提3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHBV产物。

(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHBV样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，GC检测PHBV含量。

(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的20小时菌体达到最大浓度8.44克/升；发酵72小时后PHBV占细胞干重的9.37％，其中3HV摩尔分数为10.88％。

实施例4.重组大肠杆菌QW103PT利用木糖发酵生产PHBV，其中加入的总糖浓度为15克/升。

(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)QW103PT；

(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于400毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养菌液；

(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为3升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为100微克/毫升氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在40℃下诱导培养3小时使菌体OD₆₀₀达到1.5，之后向菌液中加入木糖，使菌液中的总糖含量达到15克/升(以葡萄糖计)，维持pH值在7.0，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心20分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞；

(7)PHBV提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其10倍体积的丙酮，55℃处理60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体10倍体积的氯仿，55℃浸提3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHBV产物。

(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHBV样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，GC检测PHBV含量。

(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的20小时菌体达到最大浓度10.78克/升；发酵72小时后PHBV占细胞干重的11.1％，其中3HV摩尔分数为17.5％。

实施例5.重组大肠杆菌QW103PT利用甘油发酵生产PHBV，其中加入的总糖浓度为15克/升。

1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)QW103PT；

(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于400毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养菌液；

(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为3升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为100微克/毫升氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在40℃下诱导培养3小时使菌体OD₆₀₀达到1.5，之后向菌液中加入甘油，使菌液中的总糖含量达到15克/升(以葡萄糖计)，维持pH值在7.0，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心20分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞；

(7)PHBV提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其10倍体积的丙酮，55℃处理60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体10倍体积的氯仿，55℃浸提3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHBV产物。

(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHBV样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，GC检测PHBV含量。

(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的20小时菌体达到最大浓度7.36克/升；发酵48小时后PHBV占细胞干重的9.21％，其中3HV摩尔分数为9.89％。

实施例6.重组大肠杆菌QW103PT利用葡萄糖发酵生产PHBV，其中加入的总糖浓度为15克/升。

(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)QW103PT；

(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于400毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养菌液；

(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为3升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为100微克/毫升氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在40℃下诱导培养3小时使菌体OD₆₀₀达到1.5，之后向菌液中加入葡萄糖，使菌液中的总糖含量达到15克/升(以葡萄糖计)，维持pH值在7.0，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心20分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞；

(7)PHBV提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其10倍体积的丙酮，55℃处理60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体10倍体积的氯仿，55℃浸提3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHBV产物。

(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHBV样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，GC检测PHBV含量。

(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的20小时菌体达到最大浓度8.74克/升；发酵48小时后PHBV占细胞干重的8.75％，其中3HV摩尔分数为9.62％。

实施例7.重组大肠杆菌DH5α(pBHR68)利用木糖发酵生产PHBV，其中加入的总糖浓度为15克/升。

(1)菌种构建：将质粒pBHR68按照实施例1中的方法转化到大肠杆菌DH5α中，得到菌株DH5α(pBHR68)；

(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于400毫升并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养菌液；

(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为3升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为100微克/毫升氨苄霉素和50微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在40℃下诱导培养3小时使菌体OD₆₀₀达到1.5，之后向菌液中加入木糖，使菌液中的总糖含量达到15克/升(以葡萄糖计)，维持pH值在7.0，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心20分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞；

(7)PHBV提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其10倍体积的丙酮，55℃处理60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体10倍体积的氯仿，55℃浸提3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHBV产物。

(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHBV样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，GC检测PHBV含量。

(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的20小时菌体达到最大浓度10.78克/升；发酵48小时后PHBV占细胞干重的30.5％，其中3HV摩尔分数为0.45％。

通过实施例4、5与实施例6的对比可以看出，以重组大肠杆菌QW103PT分别利用木糖、甘油和葡萄糖为碳源生产PHBV，以木糖为碳源得到的PHBV中3HV的摩尔分数明显高于以葡萄糖和甘油为碳源时的产量，说明以木糖作为碳源合成PHBV具有明显的优势。

通过实施例4与实施例7的对比可以看出，以重组大肠杆菌QW103PT利用单一碳源生产PHBV，与重组菌DH5α(pBHR68)相比，其3HV的摩尔分数由0.45％提高到17.5％，具有很大幅度的提高。

鉴于此，重组大肠杆菌QW103PT能够高效利用单一碳源合成PHBV，对PHBV的商业生产具有显著的意义。

本发明所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHBV的方法中涉及的培养基及其配方是：

菌体培养使用的液体LB培养基配方为：

蛋白胨10克/升，酵母粉5克/升，氯化钠10克/升，pH 7.0，121℃条件下灭菌20分钟。

菌体发酵使用的M9培养基的配方为：

Na₂HPO₄·12H₂O 17.1克/升，KH₂PO₄3克/升，NaCl 1克/升，NH₄Cl 5克/升，酵母粉2克/升，MgSO40.12克/升，CaCl₂0.011克/升，pH 7.0，121℃条件下灭菌20分钟。

固体平板LB培养基为液体LB培养基成分添加质量百分比浓度为1.6％的琼脂粉。