一种黑曲霉及其固态曲发酵生产饲料的方法

摘要

本发明涉及饲料加工领域，公开了一种保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉及其固态曲，以及包含该黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲的混合菌种固态曲，以及该黑曲霉固态曲、该混合菌种固态曲在发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料中的应用。利用混合菌种固态曲发酵生产蛋白饲料，能够将果胶含量由17.51％降低至0.98～1.26％，减少了果胶对饲料中营养成分的影响，减弱了果胶包裹水的作用，将饲料中水分含量由77～82％降低至75％以下，从而加快产品干燥速率，降低干燥能耗，同时提高了饲料中蛋白质含量，利于实现柑橘皮渣综合开发利用的产业化。

说明书

技术领域

本发明涉及饲料加工领域，特别涉及一种黑曲霉及其固态曲发酵生产饲料的方法。

背景技术

近年来，随着我国畜牧业的快速发展，对饲料的需求在数量和质量上都有了更高的要求。提供营养价值高、生产成本低的饲料是饲料工业发展的趋势。

我国柑橘产量位居世界第三，近年来柑橘年产量均在2000万吨以上，一般柑橘类果实榨汁后会产生40～50％的柑橘皮渣，大量的柑橘皮渣未经充分利用便遭丢弃，不仅造成资源的浪费，而且胡乱堆放霉变发臭造成环境污染。柑橘皮渣除含有香精油、果胶、黄酮类化合物、纤维素、木质素外，还含有丰富的粗蛋白、粗脂肪、糖类化合物、微量元素等营养物质，其中粗蛋白含量6.4～8.1％、粗纤维含量9.5～10.6％、粗灰分含量3.1～3.6％、脂肪含量2.3～2.6％、钙含量0.77～0.85％、磷含量0.17～0.19％，氨基酸总量为5.85％(主要是含量为0.48％的赖氨酸和含量为0.29％的苏氨酸)。因此，对柑橘皮渣进行综合利用，既能提高经济效益，又能充分利用资源保护环境。

国内外学者对柑橘皮渣的综合利用进行了大量研究，主要有以下方法：提取柑橘皮渣中的有效成分，如黄酮类化合物、果胶、香精油等；将柑橘皮渣直接干燥作饲料或发酵生产工业原料和蛋白饲料等。将柑橘皮渣直接干燥后作为动物饲料，由于未发酵的柑橘皮渣粗蛋白含量低、适口性差，加之干燥过程能耗较大，影响柑橘皮渣直接干燥应用于饲料的工业化生产。但是，柑橘皮中普遍含有果胶，易与纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等结合，不溶于水，导致现有工业化生产中，发酵柑橘皮渣生产饲料的蛋白含量较低。由于动物体内缺乏降解果胶的酶类，无法依靠自身降解果胶，难以吸收饲料中营养物质，进而影响动物养殖业的发展，因而果胶被认为是动物饲料中的抗营养因子。此外，果胶具有包裹水的作用，增加了饲料中的水分含量，易 导致饲料霉变，如果对水分进行处理就增大了饲料加工工艺中的干燥耗能。

目前，工业生产多采用微生物菌株制备的固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料，能够大幅提高蛋白质尤其是可溶性蛋白的含量，并能够较好地降解柑橘苦素、柚皮苷等苦味物质，提高其适口性。但是现有微生物菌种产果胶酶的能力较低，无法有效降解果胶，限制了微生物发酵法在饲料工业生产中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉，该黑曲霉与普通黑曲霉相比，产果胶酶的能力显著提高(P＜0.05)，对果胶具有显著的降解作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种黑曲霉，菌株名称为黑曲霉315(Aspergillus niger315)，保藏编号为CCTCC No.M2011055。由编号为CICC40014，购自中国工业微生物菌种保藏中心的原始菌株黑曲霉(Aspergillus niger)经紫外光诱变和果胶诱导，获得的一株新型黑曲霉菌株。

本发明所述黑曲霉315(Aspergillus niger315)菌株已于2011年3月2日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，保藏中心地址为武汉省武昌市珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No.M2011055。

本发明还提供了通过紫外光诱变和果胶诱导获得保藏编号为CCTCCNo.M2011055的黑曲霉的方法，包括：

步骤1：活化菌种：挑取上述黑曲霉接种于添加2.0％葡萄糖的PDA斜面培养基，置培养箱中于28℃下培养3～4d；所述PDA培养基可由质量分数为20％的马铃薯、2％的蔗糖或葡萄糖、2％的琼脂，加蒸馏水配制而成，自然pH值。

步骤2：配制菌悬液：用无菌水将斜面上的黑曲霉孢子洗下，震荡制成黑曲霉菌悬液，约10³～10⁴个/mL。

步骤3：查氏-果胶培养基的配制：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，果胶5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌后装培养皿备用。

步骤4：紫外诱变：将上述菌体悬浮液按0.2mL/皿的量用无菌玻璃棒涂抹在查氏-果胶培养基上，后将培养皿置于与紫外灯(40W)相距40cm处开盖照射10min，进行诱变，再将培养皿倒置于30℃恒温箱中培养2～3d，用刚果红染色法，选出水解圈最大的一株菌落。

步骤5：底物诱导：挑取上述筛选出的水解圈最大的菌落制成约10³～10⁴个/mL菌悬液，再将其按0.2mL/皿的量用无菌玻璃棒涂抹在查氏-果胶培养基上，后将培养皿倒置于30℃恒温箱中培养2～3d，用刚果红染色法，选出水解圈最大的一株菌落，重复操作诱导培养20代，得到高产果胶酶的优势菌株，即本发明所述黑曲霉。

试验证明，未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉的活菌数量为5.9×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为635.9021U/g曲；本发明提供的经紫外光诱变和果胶底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉活菌数量为6.2×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为787.201IU/g曲。经紫外线诱变和果胶诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌株与未经诱变的黑曲霉菌株产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株降解果胶的能力显著提高。

本发明还提供了由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲。

本发明还提供了保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉固态曲的制备方法，包括：

步骤1：活化菌种：挑取保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉，接种于添加2.0％葡萄糖的PDA斜面培养基，于28℃下培养3～4d。

步骤2：配制菌悬液：将培养后的黑曲霉制成黑曲霉菌悬液后接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基中，在温度为24～40℃下静置培养，制得上述黑曲霉固态曲；黑曲霉制曲用的麸皮培养基中，麸皮填装量为40g/L，加水量30％。

试验证明，将未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉和经紫外光诱变和果胶底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉在相同条件下制成固态曲，其产果胶酶酶活分别为1330IU/g曲和1650IU/g曲，经紫外线 诱变和果胶诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌株制备的固态曲与未经诱变的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉制备的固态曲降解果胶的能力显著提高。

本发明提供了上述制备方法制得的黑曲霉固态曲及其在发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料中的应用。

本发明提供了一种混合菌种固态曲，包含保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲。

作为优选，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲中活菌数量为7.2×10⁸～7.9×10⁸个/g曲，测得果胶酶酶活为1550～1650IU/g曲。

优选地，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲中活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，测得果胶酶酶活为1650IU/g曲。

作为优选，上述混合菌种固态曲还可以包含嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。

作为优选，嗜单宁管囊酵母固态曲中活菌数量为1.45×10⁸～1.52×10⁸个/g曲，测得纤维素酶酶活为1000～1100IU/g曲；米曲霉固态曲中活菌数量为1.75×10⁸～1.90×10⁸个/g曲，测得β-葡萄糖苷酶酶活为1200～1300IU/g曲。

优选地，嗜单宁管囊酵母固态曲中活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，测得纤维素酶酶活为1100IU/g曲；米曲霉固态曲中活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，测得β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

本发明还提供了上述混合菌种固态曲的制备方法，包括：

步骤1：活化菌种：分别挑取保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，接种于添加2.0％葡萄糖的PDA斜面培养基，置培养箱中于28℃下培养3～4d；上述PDA培养基含质量分数为20％的马铃薯、2％的蔗糖或葡萄糖、2％的琼脂，加蒸馏水配制而成，自然pH值。

步骤2：配制菌悬液，制备单菌种固态曲：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌悬液、嗜 单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液后，分别接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基、嗜单宁管囊酵母制曲用的麸皮培养基和米曲霉制曲用的麸皮培养基中，在温度为24～40℃下静置培养，制得黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。

上述黑曲霉制曲用的麸皮培养基中，将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的黑曲霉菌悬液按0.1mL/g接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基中；黑曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量30％，制曲温度为28℃，制曲时间为4d。

将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的菌悬液按0.1mL/g接种于嗜单宁管囊酵母制曲用的麸皮培养基中；嗜单宁管囊酵母制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，添加1％尿素作辅料，加水量40％，制曲温度为30℃，制曲时间为5d。

将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的菌悬液按0.1mL/g接种于米曲霉制曲用的麸皮培养基中；米曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量40％，制曲温度为32℃，制曲时间为5d。

步骤3：制备混合种固态曲：将上述保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲混合，制得混合菌种固态曲。

为了保证上述混合菌种固态曲中保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲中的活菌数量，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲可以按照重量比1∶0.5～3∶0.5～3混合，制得混合菌种固态曲。

作为优选，上述黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲按照重量比为1∶1.5∶0.5混合，制得所述混合菌种固态曲。

本发明还提供了上述混合菌种固态曲在发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料中的应用。

本发明还提供了一种混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法，其特征在于，所述混合菌种固态曲包含由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法 中，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲中活菌数量为7.2×10⁸～7.9×10⁸个/g曲。

优选地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲中活菌数量为7.9×10⁸个/g曲

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲还包含嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。

优选地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述嗜单宁管囊酵母固态曲中嗜单宁管囊酵母活菌数量为1.45×10⁸～1.52×10⁸个/g曲；上述米曲霉固态曲中米曲霉活菌数量为1.75×10⁸～1.90×10⁸个/g曲。

优选地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，嗜单宁管囊酵母固态曲中活菌数量为1.52×10⁸个/g曲；米曲霉固态曲中活菌数量为1.90×10⁸个/g曲。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲中，黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲的重量比为1∶0.5～3∶0.5～3。

优选地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲中，黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲的重量比为1∶1.5∶0.5。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲的接入量以质量分数计，为5～11％。

优选地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲的接入量以质量分数计，为9％。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，培养温度为32～38℃。

优选地，混合菌种固态曲发酵生产蛋白饲料的培养温度为32℃。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，培养时间为4～6d。

优选地，混合菌种固态曲发酵生产蛋白饲料的培养时间为6d。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，还可以添加0～7％的谷壳、秸秆或麸皮作辅料。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法，还包括干燥、封装和灭菌的步骤。

具体地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法，包括：对柑橘皮渣进行预处理、粉碎成柑橘皮渣颗粒；在柑橘皮渣颗粒中接入5～11％混合菌种固态曲，添加0～7％的谷壳、秸秆或麸皮作辅料，在培养温度为32～38℃下，培养时间为4～6d，制得蛋白饲料；混合菌种固态曲包含由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲；上述黑曲霉固态曲中黑曲霉活菌数量为7.2×10⁸～7.9×10⁸个/g曲，测得果胶酶酶活为1550～1650IU/g曲。作为优选，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲中活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，测得果胶酶酶活为1650IU/g曲。作为优选，混合菌种固态曲还包含嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，嗜单宁管囊酵母固态曲中嗜单宁管囊酵母活菌数量为1.45×10⁸～1.52×10⁸个/g曲，测得纤维素酶酶活为1000～1100IU/g曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，嗜单宁管囊酵母固态曲中嗜单宁管囊酵母活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，测得纤维素酶酶活为1100IU/g曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，米曲霉固态曲中米曲霉活菌数量为1.75×10⁸～1.90×10⁸个/g曲，测得β-葡萄糖苷酶酶活为1200～1300IU/g曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，米曲霉固态曲中米曲霉活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，测得β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

本发明提供了保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉。试验证明，未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉的活菌数量为5.9×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为635.902IU/g曲；本发明提供的经紫外光诱变和果胶底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉活菌数量为6.2×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为787.201IU/g曲。经紫外线诱变和果胶诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌株与未经诱变的黑曲霉菌株产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑 曲霉菌株降解果胶的能力显著提高。本发明还提供了保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲，试验结果表明，未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉固态曲产果胶酶酶活为1330IU/g曲，本发明提供的经紫外光诱变和果胶底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉固态曲产果胶酶酶活为1650IU/g曲，经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株制备的固态曲与未经诱变的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株制备的固态曲降解果胶的能力显著提高。本发明还提供了包含保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料的方法，该方法能够将饲料中果胶含量由17.51％降低至0.98～1.26％，降低了果胶对饲料中营养成分的影响以及包裹水的作用，将饲料中水分含量由77～82％降低至75％以下，加快产品干燥速率，减少干燥能耗；同时可以充分利用柑橘皮渣中的有益成分，提高发酵产品的蛋白含量，将粗蛋白含量由8.15％提高到23.05～24.30％；真蛋白含量由7.00％提高至19.73～21.59％；可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至309.37～397.97μg/g。既减少了柑橘皮渣对环境的污染，又提供了果胶含量较低、蛋白含量较高的饲料，能够有效推进柑橘皮渣综合开发利用的产业化进程。

生物保藏说明

菌株黑曲霉315：分类命名：黑曲霉315(Aspergillus niger315)于2011年3月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址为武汉省武昌市珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No.M2011055。

附图说明

图1示混合菌种固态曲的制备工艺。

具体实施方式

本发明公开了保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉，该黑曲霉制 备的固态曲，包含该黑曲霉制备的固态曲的混合菌种固态曲及其制备方法，以及利用该黑曲霉固态曲、该混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

菌株名称为黑曲霉315(Aspergillus niger315)，保藏编号为CCTCC No.M2011055。由编号为CICC40014，购自中国工业微生物菌种保藏中心的原始菌株黑曲霉(Aspergillus niger)经紫外光诱变和果胶诱导，获得的一株新型黑曲霉菌株。

本发明所述黑曲霉315(Aspergillus niger315)菌株已于2011年3月2日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，保藏中心地址为武汉省武昌市珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No.M2011055。

本发明提供了一种由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲。

本发明还提供了由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲在发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料中的应用。

柑橘皮渣中含有大量木质纤维原料和果胶。果胶是植物组织中与纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等结合的不溶于水的一类物质，果胶广泛存在于高等植物如水果、蔬菜、大豆以及玉米等植物中，主要由D-半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷键连接形成直链状聚合物，是非淀粉多糖的成分之一。由于动物体内缺乏降解果胶的酶类，因而果胶被认为是动物饲料中的抗营养因子。再加上果胶的包裹水的作用，导致饲料干燥速率低，干燥世间长、耗能高，生产成本高。因此，常在饲料中添加果胶酶对果胶进行分解。

果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶，通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降 解生成半乳糖醛酸。果胶酶可以由黑曲霉(Aspergillus niger)经发酵精制而得，对分解果胶具有良好的作用。作用pH值为：2.5～6.0，最适作用pH值为：3.5。

黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。本发明将黑曲霉进行紫外光诱变和果胶底物诱导，目的是提高黑曲霉生产果胶酶的能力。试验证明，未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉的活菌数量为5.9×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为635.902IU/g曲；本发明提供的经紫外光诱变和果胶底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉活菌数量为6.2×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为787.201IU/g曲。经紫外线诱变和果胶诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌株与未经诱变的黑曲霉菌株产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株降解果胶的能力显著提高。未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉固态曲产果胶酶酶活为1330IU/g曲，本发明提供的经紫外光诱变和果胶底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉固态曲产果胶酶酶活为1650IU/g曲，未经诱变的黑曲霉菌株制备的固态曲和经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶的能力显著提高。

本发明还提供了一种混合菌种固态曲，包含由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲。

柑橘皮渣中的木质纤维原料可再生，资源丰富，将这类物质转化为葡萄糖、木糖等可发酵性糖，极具应用前景。木质纤维原料主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成。纤维素是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的线性长链高分子聚合物，呈微元纤束状态，具有很强的结晶性。半纤维素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)和糖醛酸所组成的不均一聚糖，为异质多糖，排列松散，无晶体结构。木质素以苯丙烷为 结构单元，通过醚键-碳键彼此连接成具有三度空间结构的高聚物。柑橘皮渣中，天然半纤维素水解产物的85～90％是木糖，如何充分利用半纤维素是提高生物利用率的关键。木糖是木制纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，含量可达植物纤维水解糖类的35％以上。在戊糖发酵的微生物中，酵母的戊糖发酵能力最强，酵母菌种可发酵木糖的菌株主要有假丝酵母、毕氏酵母和管囊酵母三个属。嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)是目前研究最多最有工业应用前景的木糖发酵微生物之一，能够分泌纤维素酶，提高木糖的生物利用率。因此，将含有嗜单宁管囊酵母固态曲的混合菌种固态曲用来发酵柑橘皮渣生产饲料，可以有效分解木质纤维原料。

纤维素酶是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。β-葡萄糖苷酶可以由米曲霉发酵制得。

米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。鉴于此，将含有米曲霉固态曲的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料，能够有效降解其中的木质纤维原料和蛋白质。

作为优选，上述混合菌种固态曲还包含嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。

优选地，本发明提供的混合菌种固态曲中，选用黑曲霉315(保藏编号为CCTCC No.M2011055)、嗜单宁管囊酵母(编号CICC1771，购自中国工业微生物菌种保藏中心)和米曲霉(编号AS3.951，西南大学赠送，可市售 获得)作为菌源。

作为优选，所述黑曲霉固态曲中黑曲霉活菌数量为7.2×10⁸～7.9×10⁸个/g曲；所述嗜单宁管囊酵母固态曲中嗜单宁管囊酵母活菌数量为1.45×10⁸～1.52×10⁸个/g曲；所述米曲霉固态曲中米曲霉活菌数量为1.75×10⁸～1.90×10⁸个/g曲。

本发明还提供了上述混合菌种固态曲在发酵柑橘皮渣生产饲料中的应用。

本发明还提供了一种混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法，混合菌种固态曲包含由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲。

作为优选，上述黑曲霉固态曲中黑曲霉活菌数量为7.2×10⁸～7.9×10⁸个/g曲。

作为优选，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲还包含嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。

作为优选，上述混合菌种固态曲中，嗜单宁管囊酵母固态曲中活菌数量为1.45×10⁸～1.52×10⁸个/g曲，优选为1.52×10⁸个/g曲；米曲霉固态曲中活菌数量为1.75×10⁸～1.90×10⁸个/g曲，优选为1.90×10⁸个/g曲。

本发明提供的生产饲料的方法，为了保证混合菌种固态曲中保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的活菌数量，上述混合菌种固态曲中，黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲的重量比可以为1∶0.5～3∶0.5～3。

具体地，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法，包括：对柑橘皮渣进行预处理、粉碎成柑橘皮渣颗粒；在上述柑橘皮渣颗粒中接入5～11％混合菌种固态曲，添加0～7％的谷壳、秸秆或麸皮作辅料，在培养温度为32～38℃下，培养时间为4～6d，制得蛋白饲料；混合菌种固态曲包含由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲，其中，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备的黑曲霉固态曲中活菌数量为7.2×10⁸～7.9×10⁸个/g曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，黑曲霉活菌数量为7.9×10⁸个/g曲。作为优选，本发明提供的混合菌种固态 曲发酵柑橘皮渣生产饲料的方法中，上述混合菌种固态曲还包含嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，嗜单宁管囊酵母固态曲中活菌数量为1.45×10⁸～1.52×10⁸个/g曲，优选为1.52×10⁸个/g曲；米曲霉固态曲中活菌数量为1.75×10⁸～1.90×10⁸个/g曲，优选为1.90×10⁸个/g曲。优选地，上述混合菌种固态曲中，黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲和米曲霉固态曲的重量比可以为1∶0.5～3∶0.5～3。

试验结果表明，本发明采用含有保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料，能够将饲料中果胶含量由17.51％降低至0.98～1.26％，降低了果胶对饲料中营养成分的影响以及包裹水的作用，将饲料中水分含量由77～82％降低至75％以下，加快产品干燥速率，减少干燥能耗；同时可以充分利用柑橘皮渣中的有益成分，提高发酵产品的蛋白含量，将粗蛋白含量由8.15％提高到23.05～24.30％；真蛋白含量由7.00％提高至19.73～21.59％；可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至309.37～397.97μg/g。本发明提供的含有保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料的方法，既减少了柑橘皮渣对环境的污染，又提供了果胶含量较低、蛋白含量较高的饲料，能够有效推进柑橘皮渣综合开发利用的产业化进程。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明提供的黑曲霉与未诱变的黑曲霉菌株产果胶酶能力的检测

分别在1号、2号500mL锥形瓶中填装100g麸皮为培养基，按照重量份数计，麸皮含量为60％，加水量为40％。其中，1号锥形瓶中接种未诱变的黑曲霉菌株孢子悬浮液，2号锥形瓶中接种本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉315菌株，培养温度为28℃，培养时间为4d，24h后开始翻曲。培养4d后，分别测定1号锥形瓶和2号锥形瓶培养基中活菌数量及果胶酶酶活。其中1号锥形瓶中，未经紫外光诱变和果胶底物诱导的黑曲霉的活菌数量为5.9×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为635.902IU/g曲；2号锥形中，本发明提供的经紫外光诱变和果胶 底物诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉活菌数量为6.2×10⁸个/g曲时，产果胶酶酶活为787.201IU/g曲。经紫外线诱变和果胶诱导、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌株与未经诱变的黑曲霉菌株产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱导的黑曲霉菌株降解果胶的能力显著提高。

实施例2本发明提供的黑曲霉制备固态曲

斜面菌种培养：挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使黑曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌悬液。

制备固态曲：将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的黑曲霉菌悬液按0.1mL/g接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基中；黑曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量30％，制曲温度为28℃，制曲时间为4d，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲。

实施例3本发明提供的黑曲霉制备固态曲

斜面菌种培养：挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使黑曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌悬液。

制备固态曲：将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的黑曲霉菌悬液按0.1mL/g接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基中；黑曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量30％，制曲温度为26℃，制曲时间为4d，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.2×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1600IU/g曲。

实施例4本发明提供的黑曲霉制备固态曲

斜面菌种培养：挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使黑曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌悬液。

制备固态曲：将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的黑曲霉菌悬液按0.1mL/g接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基中；黑曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量30％，制曲温度为30℃，制曲时间为4d，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.6×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1550IU/g曲。

实施例5本发明提供的黑曲霉制备的固态曲与未诱变的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶能力的检测

分别在1号、2号500mL锥形瓶中填装100g麸皮为培养基，按照重量份数计，麸皮含量为60％，加水量为40％。其中，1号锥形瓶中接种未诱变的黑曲霉菌株孢子悬浮液，2号锥形瓶中接种本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉315菌株，培养温度为28℃，培养时间为4d，24h后开始翻曲。培养4d后，分别分析1号锥形瓶和2号锥形瓶培养基中果胶酶酶活，其中1号锥形瓶培养基中果胶酶酶活为1330IU/g曲，2号锥形瓶培养基中果胶酶酶活为1650IU/g曲，未经诱变的黑曲霉菌株制备的固态曲和经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶的能力具有显著差异(P＜0.05)，表明本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变的黑曲霉菌株制备的固态曲产果胶酶的能力显著提高，在相同发酵条件下，保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉315菌株制备的固态曲降解果胶的能力显著高于普通黑曲霉菌株制备的固态曲。

实施例6本发明提供的黑曲霉与普通黑曲霉菌株制备固态曲发酵生产蛋白饲料

如实施例2，由保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备黑曲霉固态曲。

未诱变黑曲霉固态曲的制备：

斜面菌种培养：挑取一环未诱变的普通黑曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使黑曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌悬液。

制备固态曲：将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的黑曲霉菌悬液按0.1mL/g接种于黑曲霉制曲用的麸皮培养基中；黑曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量30％，制曲温度为28℃，制曲时间为4d，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.8×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1330IU/g曲。

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，含水量75％～80％；分别接入实施例2中制备的本发明提供的黑曲霉固态曲和本实施例制备的未经诱变的黑曲霉固态曲，接种量为9％，在培养温度为20℃下，不添加任何辅料，固态发酵3d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥，分析其蛋白质含量及果胶含量见表1。

表1黑曲霉菌株制备固态曲发酵生产饲料

*表示P＜0.05，#表示P＜0.01。

表1结果表明，本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备固态曲发酵生产蛋白饲料，粗蛋白含量为11.67％，与未经诱变的普通黑曲霉固态曲相比，具有显著差异(P＜0.05)；本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变的黑曲霉制备固态曲发酵生产蛋白饲料，真蛋白含量为9.01％，与普通黑曲霉固态曲相比，具有显著差异(P＜0.05)；本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变的黑曲霉制备固态曲发酵生产蛋白饲料，可溶性蛋白含量为305.594μg/g，与未经诱变的普通黑曲霉固态曲相比，具有显著差异(P＜0.05)；本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变的黑曲霉制备固态曲发酵生产蛋白饲料，果胶含量为1.66％，与未经诱变的普通黑曲霉固态曲相比，具有极显著差异(P＜0.01)。综合上述试验结果，本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉制备固态曲发酵生产蛋白饲料，极显著降低了饲料中果胶的含量，并且显著提高了粗蛋白、真蛋白、可溶性蛋白的含量。

实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲

斜面菌种培养：挑取一环嗜单宁管囊酵母，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使嗜单宁管囊酵母长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的酵母菌洗下制成嗜单宁管囊酵母菌悬液。

制备固态曲：将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的菌悬液按0.1mL/g接种于嗜单宁管囊酵母制曲用的麸皮培养基中；嗜单宁管囊酵母制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，添加1％尿素作辅料，加水量40％，制曲温度为30℃，制曲时间为5d，制得的嗜单宁管囊酵母固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲。

实施例8本发明提供的米曲霉制备固态曲

斜面菌种培养：挑取一环米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)； 置培养箱中于28℃下培养3d，使米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子洗下制成米曲霉菌悬液。

制备固态曲：将菌种浓度为1.0×10⁷个/mL的菌悬液按0.1mL/g接种于米曲霉制曲用的麸皮培养基中；米曲霉制曲用的麸皮培养基以麸皮为基础，加水量40％，制曲温度为32℃，制曲时间为5d，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

实施例9制备混合菌种固态曲

选用本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉作为菌源。

斜面菌种培养：分别挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使所述黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌悬液、嗜单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液。

制备单菌种固态曲：按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲；按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

制备混合菌种固态曲：按照黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶1∶1混合，制得混合菌种固态曲。

实施例10制备混合菌种固态曲

选用本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉作为菌源。

斜面菌种培养：分别挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使所述黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌悬液、嗜单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液。

制备单菌种固态曲：按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲；按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

制备混合菌种固态曲：按照黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶2∶1混合，制得混合菌种固态曲。

实施例11制备混合菌种固态曲

选用本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉作为菌源。

斜面菌种培养：分别挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使所述黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌悬液、嗜单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液。

制备单菌种固态曲：按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母 菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲；按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

制备混合菌种固态曲：分别按照黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶0.5∶0.5混合，制得混合菌种固态曲。

实施例12制备混合菌种固态曲

选用本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉作为菌源。

斜面菌种培养：分别挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使所述黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌悬液、嗜单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液。

制备单菌种固态曲：按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲；按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

制备混合菌种固态曲：按照黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶1∶2混合，制得混合菌种固态曲。

实施例13制备混合菌种固态曲

选用本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉作为菌源。

斜面菌种培养：分别挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、 保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使所述黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌悬液、嗜单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液。

制备单菌种固态曲：按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲；按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

制备混合菌种固态曲：分别按照黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶1.5∶0.5混合，制得混合菌种固态曲。

实施例14制备混合菌种固态曲

选用本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉作为菌源。

斜面菌种培养：分别挑取一环本发明提供的经紫外线诱变和果胶诱变、保藏编号为CCTCC No.M2011055的黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉，直线法分别接种于培养用PDA斜面培养基(培养用PDA斜面培养基以PDA培养液为基础，加入葡萄糖2.0％)；置培养箱中于28℃下培养3d，使所述黑曲霉、嗜单宁管囊酵母和米曲霉长满斜面。

配制菌悬液：用无菌水将斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌悬液、嗜单宁管囊酵母菌悬液和米曲霉菌悬液。

制备单菌种固态曲：按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲； 按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

制备混合菌种固态曲：按照黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶3∶3混合，制得混合菌种固态曲。

实施例15本发明提供的混合菌种固态曲与单菌种固态曲发酵生产蛋白饲料

按照实施例2制备本发明提供的黑曲霉固态曲，制得的黑曲霉菌种固态曲中，活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲。

按照实施例7制备嗜单宁管囊酵母固态曲，制得的嗜单宁管囊酵母菌种固态曲中，活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲。

按照实施例8制备米曲霉固态曲，制得的米曲霉菌种固态曲中，活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

按照实施例9制备混合菌种固态曲，其中，黑曲霉活菌数量为7.9×10⁸个/g曲，果胶酶酶活为1650IU/g曲；嗜单宁管囊酵母活菌数量为1.52×10⁸个/g曲，纤维素酶酶活为1100IU/g曲；米曲霉活菌数量为1.90×10⁸个/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活为1300IU/g曲。

分别用上述黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲、混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣，接种量均为9％，在培养温度为20℃下，不添加任何辅料，分别固态发酵3d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥；对干燥后的柑橘皮渣样品进行分析，其蛋白质含量及果胶含量见表2。

表2混合菌种固态曲与单菌种固态曲发酵生产蛋白饲料

  固态曲   黑曲霉   嗜单宁管囊酵母   米曲霉   混合菌种   粗蛋白含量(％)   11.67   11.08   10.94   12.01   真蛋白含量(％)   9.01   9.24   8.77   9.22   可溶性蛋白含量(μg/g)   305.594   314.721   301.962   320.863   果胶含量(％)   1.66   1.76   3.83   1.61

表2结果表明，本发明提供的混合菌种固态曲发酵生产蛋白饲料，与单菌种固态曲相比，果胶降解能力加强，说明混合菌种固态曲较单菌种固态曲，能够有效降低果胶含量；蛋白质提高的能力有所加强，说明混合菌种固态曲较单菌种固态曲，能够提高蛋白含量。因此选择混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣。

实施例16混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料的条件优化

不同接种量的混合菌种固态曲发酵：

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，含水量75％～80％；混合菌种固态曲的制备同实施例9，其中黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的固态曲的重量比为1∶1∶1。在培养温度为20℃下，接入混合菌种固态曲，接种量为1％～11％，不添加任何辅料，固态发酵3d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥，分析其蛋白质含量及果胶含量见表3。

表3不同接种量的混合菌种固态曲发酵产品情况

  接菌量(％)   1   3   5   7   9   11   粗蛋白含量(％)   8.40   8.57   8.76   9.75   12.01   11.96   真蛋白含量(％)   7.67   7.83   7.92   8.69   9.22   9.08   可溶性蛋白含量(μg/g)   272.296   282.014   303.597   297.842   320.863   293.525   果胶含量(％)   3.25   2.14   1.78   1.98   1.61   1.82

表3结果表明，混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，所述混合菌种固态曲的接菌量为5～11％时，能够有效降低果胶含量，由发酵前的17.51％降低至1.61～1.98％，同时，能够提高蛋白含量，将粗蛋白含量由发酵前的8.15％提高至8.76～12.01％，真蛋白含量由7.00％提高至7.92～9.22％，可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至293.525～320.863μg/g。因此，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，混合菌种固态曲 的接种量优选为5～11％。

不同配比的混合菌种固态曲发酵：

不同配比的混合菌种固态曲的制备同实施例9～14，不同配比的混合菌种固态曲接种量均为9％，在培养温度为20℃下，不添加任何辅料，分别固态发酵3d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥；对干燥后的柑橘皮渣样品进行分析，其蛋白质含量及果胶含量见表4。

表4不同配比的混合菌种固态曲发酵产品情况

  混合比例   1∶1∶1   1∶2∶1   1∶0.5∶0.5   1∶1∶2   1∶1.5∶0.5   1∶3∶3   粗蛋白含量(％)   12.01   13.15   13.46   13.65   14.12   13.20   真蛋白含量(％)   9.22   10.64   10.79   10.00   11.93   10.66   可溶性蛋白含量(μg/g)   320.863   305.381   285.54   316.475   334.115   290.213   果胶含量(％)   1.61   1.83   1.69   1.22   1.93   1.47

表4结果表明，混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，所述混合菌种固态曲中，黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比为1∶0.5～3∶0.5～3，能够有效降低果胶含量，由发酵前的17.51％降低至1.22～1.93％；能够提高蛋白含量，将粗蛋白含量由发酵前的8.15％提高至12.01～14.12％；真蛋白含量由7.00％提高至9.22～11.93％；可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至285.54～334.115μg/g。综合考虑，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，混合菌种固态曲中，黑曲霉固态曲、嗜单宁管囊酵母固态曲、米曲霉固态曲的重量比优选为1∶1.5∶0.5。

不同发酵时间的混合菌种固态曲发酵：

混合菌种固态曲的制备同实施例13，其中黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的固态曲的重量比为1∶1.5∶0.5。混合菌种固态曲的接种量为9％，在发酵温度20℃下固态发酵1～7d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥，分析其蛋白质含量及果胶含量见表5。

表5不同发酵时间的混合菌种固态曲发酵产品情况

 发酵时间(d)   1   2   3   4   5   6   7  粗蛋白含量(％)   10.89   11.91   13.66   14.42   14.89   15.06   15.32  真蛋白含量(％)   7.47   7.75   11.56   13.05   13.22   13.39   11.55  可溶性蛋白含量(μg/g)   254.014   282.518   351.885   308.187   333.511   344.662   272.345  果胶含量(％)   5.94   2.96   1.82   1.36   1.59   1.29   1.07

表5结果表明，混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，发酵时间为4～6d，能够有效降低果胶含量，由发酵前的17.51％降低至1.29～1.59％，同时，能够提高蛋白含量，将粗蛋白含量由发酵前的8.15％提高至14.42～15.06％，真蛋白含量由7.00％提高至13.05～13.39％，可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至308.187～344.662μg/g。因此，综合考虑，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，发酵时间优选为4～6d。

不同发酵温度的混合菌种固态曲发酵：

混合菌种固态曲的制备同实施例13，其中黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的固态曲的重量比为1∶1.5∶0.5。混合菌种固态曲的接种量为9％，在不同发酵温度下固态发酵6d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥，分析其蛋白质含量及果胶含量见表6。

表6不同发酵温度的混合菌种固态曲发酵产品情况

 发酵温度(℃)   15   20   25   30   35   40  粗蛋白含量(％)   11.56   15.48   18.97   21.37   23.54   17.21  真蛋白含量(％)   9.40   12.89   15.99   20.02   20.92   14.52  可溶性蛋白含量(μg/g)   258.331   330.273   341.626   384.95   399.439   301.367  果胶含量(％)   2.27   1.44   1.69   1.01   1.23   0.94

表6结果表明，混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，发酵温度为30～40℃，能够有效降低果胶含量，由发酵前的17.51％降低至0.94～ 1.23％，同时，能够提高蛋白含量，将粗蛋白含量由发酵前的8.15％提高至17.21～23.54％，真蛋白含量由7.00％提高至14.52～20.92％，可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至301.367～399.439μg/g。因此，综合考虑，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，发酵温度优选为30～40℃。

不同辅料的混合菌种固态曲发酵：

混合菌种固态曲的制备同实施例13，其中黑曲霉、嗜单宁管囊酵母、米曲霉的固态曲的重量比为1∶1.5∶0.5。混合菌种固态曲的接种量为9％，在分别添加7％谷壳、秸秆或麸皮作为辅料，在培养温度为35℃下固态发酵6d，将发酵后的柑橘皮渣饲料样品进行干燥，分析其蛋白质含量及果胶含量见表7。

表7不同辅料的混合菌种固态曲发酵产品情况

  辅料   柑橘皮渣   柑橘皮渣+7％谷壳   柑橘皮渣+7％秸秆   柑橘皮渣+7％麸皮   粗蛋白含量(％)   23.54   12.19   13.91   21.04   真蛋白含量(％)   20.92   10.02   10.15   18.07   可溶性蛋白含量(μg/g)   399.439   282.216   339.065   402.086   果胶含量(％)   1.23   0.93   0.91   1.06

表7结果表明，混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，添加0～7％的谷壳、秸秆或麸皮时，能够有效降低果胶含量，由发酵前的17.51％降低至0.91～1.23％，同时，能够提高蛋白含量，将粗蛋白含量由发酵前的8.15％提高至12.19～23.54％，真蛋白含量由7.00％提高至10.02～20.92％，可溶性蛋白含量由200.18μg/g提高至282.216～402.086μg/g。因此，综合考虑，本发明提供的混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料时，可添加0～7％的谷壳、秸秆或麸皮作辅料，优选的是不添加任何辅料。

实施例17混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，水分含量77～82％；接入实施例9制备的混合菌种固态曲，接种量为9％，添加3％谷壳，在培养温度为32℃下固态发酵4d，即可得到粗蛋白含量23.51％，真蛋白含量20.89％，可溶性蛋白含量309.373μg/g，水分低于75％，果胶含量1.26％的蛋白饲料。

实施例18混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，水分含量77～82％；接入实施例10制备的混合菌种固态曲，接种量为7％，添加1％秸秆，在培养温度为32℃下固态发酵5d，得到的发酵产品为粗蛋白含量23.87％，真蛋白含量21.59％，可溶性蛋白含量339.834μg/g，水分低于75％，果胶含量1.14％的蛋白饲料。

实施例19混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，水分含量77～82％；接入实施例11制备的混合菌种固态曲，接种量为11％，添加7％麦麸，在培养温度为35℃下固态发酵6d，得到的发酵产品为粗蛋白含量23.93％，真蛋白含量20.27％，可溶性蛋白含量397.974μg/g，水分低于75％，果胶含量1.23％的蛋白饲料。

实施例20混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小 的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，水分含量77～82％；接入实施例12制备的混合菌种固态曲，接种量为9％，不添加任何辅料，在培养温度为35℃下固态发酵5d，得到的发酵产品为粗蛋白含量23.05％，真蛋白含量20.70％，可溶性蛋白含量361.629μg/g，水分低于75％，果胶含量1.16％的蛋白饲料。

实施例21混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，水分含量77～82％；接入实施例13制备的混合菌种固态曲，接种量为5％，不添加任何辅料，在培养温度为38℃下固态发酵5d，得到的发酵产品为粗蛋白含量24.30％，真蛋白含量19.73％，可溶性蛋白含量381.564μg/g，水分低于75％，果胶含量1.05％的蛋白饲料。

实施例22混合菌种固态曲发酵柑橘皮渣生产蛋白饲料

对柑橘皮渣进行预处理，将新鲜的柑橘皮渣粉碎成直径约为5mm大小的柑橘皮渣颗粒。测定初始皮渣成分，粗蛋白含量8.15％，真蛋白含量7.00％，可溶性蛋白含量200.18μg/g，果胶含量17.51％，水分含量77～82％；接入实施例14制备的混合菌种固态曲，接种量为7％，添加1％谷壳，在培养温度为38℃下固态发酵6d，得到的发酵产品为粗蛋白含量23.26％，真蛋白含量20.67％，可溶性蛋白含量357.895μg/g，水分低于75％，果胶含量为0.98％的蛋白饲料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。