一种采用联合色谱法纯化丹参酚酸A的方法

摘要

本发明基于丹参化学成分的理化性质、色谱行为及其与单元分离技术适应性，提供了一种采用联合色谱法纯化丹酚酸A的方法，所述的联合色谱法为大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用，其中所述前沿色谱中的填料选自大孔吸附树脂ADS-5、D101或DM130，所述置换色谱的填料选自大孔吸附树脂ADS-8或HPD100，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为(0.5～1)∶4。该方法制备的产品质量稳定可控、成本可接受。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用联合色谱法纯化丹参酚酸A的方法。

背景技术

丹参是我国心脑血管病的基本治疗药物，因疗效确切，丹参已成为我国用量最大(1.5万吨/年)、销售额最高、制剂生产厂最多的中药(制剂生产厂960家，剂型主要有丹参滴丸、丹参注射液、丹参片、丹参颗粒、丹参冲剂和丹参胶囊)，此外丹参还与其它药材复方，用于肺心病、高脂血症、高血粘度综合征、哮喘、支气管肺炎、肝炎、肝硬化、肾病综合征、关节炎、糖尿病循环障碍、各种细菌性和病毒性感染、抗内毒素、肿瘤、硬皮病、皮肤炎、银屑病、过敏性紫癜、红斑狼疮、血栓闭塞性脉管炎、痤疮、难治性癫痫、视网膜病变等多种疾病的治疗。

丹参的主要有效成分是丹酚酸。现代药理研究表明，丹酚酸是以抗氧化、抗炎(通过NF-κβ途径抑制多种炎性细胞因子表达)为特点、同时具有保护脉管内皮细胞、降脂、升高高密度脂蛋白、保护心肌缺血缺氧、扩张冠脉血管、改善微循环、抑制血小板聚集、抑制纤维蛋白原合成、激活纤溶、抑制血栓形成、螯合钙铁离子等多种药理作用。在所有已知酚类化合物中(包括黄酮类化合物)丹酚酸类化合物的抗氧化活性最强，其中又以丹酚酸A(salvianolic acid A，SA)的活性最佳〔《中草药现代研究》II，1996，498-533.Yi Yang Hu et al.，World JGastroentero，2000；6(3)：402-404.Cheng Hai Liu et al.，World J Gastroentero，2000；6(3)：361-364.Yun-Lian Lin et al.J.Nat.Prod.2002，65，745-747.Lin YL et al..J.Ethnopharmacol.2005.Chen YF et al..J.Chromatogr A.2005；1088(1-2)：140-5.Hsu YC et al..J Biomed Sci.2005；12(1)：185-95.Lay IS et al..J Surg Res.2003；115(2)：279-85.Lay IS et al..Planta Med.2003；69(1)：26-32.Chen YL et al..J CellBiochem.2001；83(3)：484-93.Chen YH et al..J Cell Biochem.2001；82(3)：512-21.Hung HH et al..Histol Histopathol.2001；16(1)：175-83.Wu YJ et al..ArteriosclerThromb Vasc Biol.1998；18(3)：481-6.〕，但是，丹参中丹酚酸A的天然含量及其纯化技术一直制约着丹酚酸A的研发。

丹参药材中，主要含丹酚酸B，丹酚酸A的含量约为0.03％～0.06％。在高温处理丹参提取物制备丹酚酸A的技术建立，基本解决了其资源供给后，丹酚酸A的开发利用主要面临批量分离纯化的挑战。

但由于丹酚酸A水溶性高、不结晶、共存大量性质相近化合物和拟“胶体”类杂质，目前文献报道和专利公开的纯化技术或不能批量制备(如葡聚糖疑胶sephadex LH-20价格高昂、流速低、处理量小；C₈或C₁₈处理量小、寿命短)，或产品达不到安全可控的药用要求，致使丹酚酸A至今没有得到实际应用。

根据色谱行为(图1、图2)，丹A待分离体系的化学物质分为四大类：1、前沿杂质(主要是以丹参酮为代表的低极性物质)；2、酚酸类杂质(主要是丹参素、原儿茶醛和丹B)；3、丹A邻近杂质；4、拟“胶体”类杂质(主要是以在TLC分析中原点处物质为代表的一类杂质)。

前沿杂质较容易分离，大孔吸附树脂便可有效实现；酚酸类杂质无论在反相色谱或正相色谱上均具有满足批量制备的分离度(分离度≥2)，分离难度不大，分离拟“胶体”类化合物也有一些相关技术如正相色谱或膜分离等，因此，目前丹A原料药制备所面临的主要问题是邻近杂质的分离。

然而现有技术中，无论采用反相色谱或正相色谱上均不能满足批量分离邻近杂质，因此，丹A工业化生产的制备一直受此制约，因此，迫切需要提供一种新的纯化丹酚酸A的方法，以便更有效的分离丹A邻近杂质。

发明内容

本发明从现有技术中存在的缺陷出发，提供了一种新的采用联合色谱法纯化丹酚酸A的方法。

本发明提供的联合色谱法为大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用，其中所述前沿色谱中的填料选自大孔吸附树脂ADS-5、D101或DM130，所述置换色谱的填料选自大孔吸附树脂ADS-8或HPD100，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为(0.5～1)∶4。

优选的，所述的前沿色谱填料为大孔吸附树脂ADS-5，置换色谱填料为ADS-8，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为1∶5。

另外，本发明所述的联合色谱法是将丹参酚酸B转化液按先前沿色谱柱后置换色谱柱的顺序上样后，用20％～25％的醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，断开两柱，置换色谱柱用30-50％的醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，再用50-70％的醇洗脱收集含杂质的丹参酚酸A，前沿色谱柱直接再生使用。

其中，优选的，所述的联合色谱法是将丹参酚酸B转化液按先前沿色谱柱后置换色谱柱的顺序上样后，用23％的醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，断开两柱，置换色谱柱用40％的醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，再用60％的醇洗脱收集含杂质的丹参酚酸A，前沿色谱柱直接再生使用。

为了使纯化效果更佳，优选的，丹参酚酸A与置换色谱填料的重量比为1∶(30～50)。

更优选的，丹参酚酸A与置换色谱填料的重量比为1∶40。

另外，所述醇溶液为甲醇、乙醇或丙醇水溶液。

另外，为使纯化效果更理想，优选的，所述丹参酚酸B转化液是将pH为4.0～5.0的转化液经过高温低压热解再使用H₃PO₄调至pH为3.0获得的。

更优选的，所述高温低压热解过程的温度为120～130℃，时间为3.5～4h。

优选的，丹参酚酸B与置换色谱填料的重量比为1∶(10～30)。

更优选的，丹参酚酸B与置换色谱填料的重量比为1∶15。

综上所述，本发明通过大量实验发现，由于丹A待分离体系中的邻近杂质是非酚酸类化合物，因此通过将正相色谱与反相色谱联用，可以克服了现在技术中存在的缺陷。在正相色谱上不能有效分离的非同类物质往往在反相色谱上极易分离，在此基础上，进一步通过合理的配置前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比，从而大大提高了分离丹A邻近杂质的效果，为大批量生产丹酚酸A提供了产品质量稳定可控、成本可接受的新的方法。

附图说明

图1丹参化学成分的TLC图谱

图2丹参化学成分的HPLC图谱

图3丹A纯化的工艺流程图

图4产品样品的TLC图谱

图5产品样品的HPLC图谱

图6产品样品的紫外吸收光谱

图7产品样品的红外吸收光谱

图8产品样品的高分辨质谱图谱

图9产品样品的电喷雾电离负离子质谱图谱

图10产品样品的¹H-NMR图谱

图11产品样品的¹³C-NMR图谱

具体实施方式

首先，附图1中的各数字所代表的含义和具体条件为，1：丹酚酸B；2：丹酚酸A；3：丹参水提物；4：65％丹酚酸B；色谱条件：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长280nm，流动相梯度为：0～8分钟，8～18％B；8～15分钟，18～21％B；14～40分钟，21～34％B；溶剂剂A：H₃PO₄∶H₂O＝0.02∶100；溶剂剂B：H₃PO₄∶CH₃CN＝0.02∶100]。

附图5中的具体条件为色谱条件：ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2％磷酸水(30∶70)；检测波长：285nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min。

下面详细对本发明进行描述。

本发明的联合色谱法为大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用，其中所述前沿色谱中的填料选自大孔吸附树脂ADS-5、D101或DM130，所述置换色谱的填料选自大孔吸附树脂ADS-8或HPD100。

优选的，前沿色谱填料为大孔吸附树脂ADS-5，置换色谱填料为ADS-8。

前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为(0.5～1)∶4，具体的，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比可以采用如下表1所示，但并不局限于表1所示的具体实施方式。

表1：

  前沿色谱的填料∶置换色谱的填料  0.5∶4  前沿色谱的填料∶置换色谱的填料  0.6∶4  前沿色谱的填料∶置换色谱的填料  0.7∶4  前沿色谱的填料∶置换色谱的填料  0.8∶4

  前沿色谱的填料∶置换色谱的填料  0.9∶4  前沿色谱的填料∶置换色谱的填料  1∶4

所述的联合色谱法是将丹参酚酸B转化液按先前沿色谱柱后置换色谱柱的顺序上样后，用20％～25％的醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，断开两柱，置换色谱柱用30-50％的醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，再用50-70％的醇洗脱收集含杂质的丹参酚酸A，前沿色谱柱直接再生使用。

所述醇溶液为甲醇、乙醇或丙醇水溶液。

下面，结合图3进一步详细说明本发明，其中附图3中已经明确示出的内容不再重复描述。需要说明的是，下面只是将其中涉及的重点内容进一步加以描述，但以下所有的过程及其工艺条件并不是作为必要条件加以描述的。

将1％的丹B转化液(pH4.0～5.0)经过高温低压热解(120～130℃，3.5～4h)再使用H₃PO₄调pH至3.0→上样串联色谱柱(ADS-5树脂前沿色谱柱与HPD-100树脂置换色谱柱串联)→20％酸性乙醇(1moL/L H₃PO₄调pH至3.0～4.0)洗脱至纯丹A出现(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分杂质和前杂丹A两段合并)→断开两柱。

置换色谱柱→40％乙醇溶液洗脱至丹A微量(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测)→60％乙醇溶液洗脱残留丹A至无丹A(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分纯丹A、后杂丹A和杂质三段合并)。分别合并I级纯丹A、杂质丹A和杂质三段→专用纳滤机过滤浓缩→I级纯丹A浓缩液、杂质丹A浓缩液和杂质浓缩液(滤过液可重复使用)。

杂质丹A浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇杂质丹A浓缩液→并入下次丹B转化液→再次分离。

杂质浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇杂质浓缩液→弃去(附图3)。

置换色谱柱→＞80％乙醇洗脱3BV再生→去离子水洗脱2BV→下次使用。

前沿色谱柱→＞80％乙醇洗脱3BV→去离子水洗脱2BV→2％NaOH溶液洗脱2BV→水洗至中性→下次使用。

醇洗脱液→减压浓缩(70℃)回收乙醇→残液→弃去(附图3)。

实施例1：

丹酚酸B转化液(3.81mg SA/mL，pH 3.0，180L)→串连色谱柱(Φ100×500ADS-5与Φ200×1000HPD100串连)→20％酸性乙醇(pH 3.0)洗脱前杂至纯SA出现(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→A段)→断开两柱。40％醇溶液洗脱置换色谱柱至SA微量(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→B段)→60％醇溶液洗脱残留SA至无SA(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→C段)。实验结果证明，B段总重502克，丹酚酸A 410.2克，含量81.7％，收率61％。A+C段总重457克，丹酚酸A 137.1克，含量30.1％，收率20％。

另外，为了使最终的纯化效果更佳，优选的，丹参酚酸A与置换色谱填料的重量比为1∶(30～50)，具体的，丹参酚酸A与置换色谱的填料重量比如下表2所示，但并不局限于表2所示的具体实施方式。

表2：

  丹参酚酸A∶置换色谱的填料  1∶30  丹参酚酸A∶置换色谱的填料  1∶35  丹参酚酸A∶置换色谱的填料  1∶40  丹参酚酸A∶置换色谱的填料  1∶45  丹参酚酸A∶置换色谱的填料  1∶50

另外，为了使最终的纯化效果更佳，优选的，丹参酚酸B与置换色谱填料的重量比为1∶(10～30)，具体的，丹参酚酸B与置换色谱的填料重量比如下表3所示，但并不局限于表3所示的具体实施方式。

表3：

  丹参酚酸B∶置换色谱的填料  1∶10  丹参酚酸B∶置换色谱的填料  1∶15  丹参酚酸B∶置换色谱的填料  1∶20  丹参酚酸B∶置换色谱的填料  1∶25  丹参酚酸B∶置换色谱的填料  1∶30

对本发明方法纯化所得产品进行了相关的理化性质和结构检测，结果如下。

1、产品样品的TLC检测(图4)

2、产品样品的HPLC检测(图5)

3、产品样品的旋光性

附表1丹酚酸A的旋光性

4、产品样品的紫外吸收光谱(图6)

附表2产品样品的摩尔消光系数

5、产品样品的红外吸收光谱(图7)

附表3产品样品的红外光谱测定数据

6、产品样品的质谱检测

(1)、高分辨质谱(图8)

高分辨质谱测得：(M+Na⁺)517.11052，推测分子式为C₂₆H₂₂O₁₀Na(计算值：517.11107)。

(2)、电喷雾电离图谱(图9)

电喷雾电离质谱测得：(M-H)^-1493.28，符合分子式C₂₆H₂₁O₁₀(计算值：493.11)。

7、产品样品的¹HNMR检测(图10)

附表4产品样品的¹H NMR谱数据

^*溶剂为DMSO

8、产品样品的¹³C-NMR检测(图11)

附表5产品样品的¹³C-NMR光谱数据(ppm)及归属