蛋白质及蛋白质组在制备肝硬化诊断试剂中的应用

摘要

本发明涉及蛋白质及蛋白质组在制备肝硬化诊断试剂中的应用，蛋白质包括基膜聚糖蛋白(Lumican)、四连接素(Tetranectin)、亲血小板碱性蛋白(Pro-platelet basic protein，PBP)、色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein，IGFbp-3)、性激素结合球蛋白(Sex hormone-binding globulin，SHBG)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)以及部分的组合在肝硬化诊断试剂中的应用。本发明采用蛋白质组技术，大范围鉴定和评估与健康和疾病状态相关的多种蛋白质，使用这些筛选鉴定肝炎肝纤维化的生物标志物来预测肝炎肝纤维化的程度，可用于制备诊断肝硬化及肝硬化级别的试剂盒，这些蛋白质标记物鉴定肝纤维化及其程度的灵敏度，结合各蛋白质标记物的最佳状况，灵敏度可达89％，特异性达90％以上，高于已知的任何检测方法。

说明书

技术领域

本专利属于检测试剂领域，尤其是一种蛋白质及蛋白质组在肝硬化诊断试剂中的应用。

背景技术

肝硬化(Liver cirrhosis)是一种常见的慢性肝病，可由一种或多种原因引起肝脏损害，肝脏呈进行性、弥漫性、纤维性病变。具体表现为肝细胞弥漫性变性坏死，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生，这三种改变反复交错进行，结果肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，使肝变形、变硬而导致肝硬化。该病早期无明显症状，后期则出现一系列不同程度的门静脉高压和肝功能障碍，直至出现上消化道出血、肝性脑病等并发症死亡。引起肝硬化的病因很多，不同地区的主要病因也不相同。欧美以酒精性肝硬化为主，我国以肝炎病毒性肝硬化多见，其次为血吸虫病肝纤维化，酒精性肝硬化亦逐年增加。研究证实，两种病因先后或同时作用于肝脏，更易产生肝硬化，如血吸虫病或长期大量饮酒者合并乙型病毒性肝炎等。肝炎病毒是慢性肝炎的重要原因，是肝硬化的主要原因，是肝癌和肝移植的最常见的原因。病毒性肝炎患者有不同的转归，其中一部分将发展为肝炎后肝硬化，2002年全球的死亡率预测数据显示，92.9万人死于慢性乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染所致的肝病，其中包括44.6万人死于肝硬化(HBV相关者23.5万，HCV相关者21.1万)，肝硬化是正常肝组织结构的破坏，特征是形成放射状无功能瘢痕组织围绕有功能的肝组织。肝损伤最常见的结局是肝硬化，在美国，肝硬化最常见的原因是酗酒，在45～65岁的人群中，肝硬化排到死因的第三位，仅次于心脏疾病与癌症。在大多数亚非国家，慢性肝炎是肝硬化的主要原因。肝硬化通常是进行性的，如早期酒精性肝硬化病人停止酗酒，肝内瘢痕增生可停止，但已形成的瘢痕组织不会改变，因此，早期诊断，早期治疗尤为重要。

长期以来，经皮肝穿刺活检病理结果是肝纤维化分期的最终标准，但肝穿刺为有创操作，存在取样误差、观察偏倚等局限性，肝穿取样组织只占整个肝脏的五万分之一，加之纤维化分布不均匀，导致肝穿刺活检存在取样误差(10％-45％)，非常影响准确性，此外，静态病理学表现常难以与动态的组织学改变同步，局部取材亦难以反映肝脏的整体改变，且反复穿刺往往是患者不易接受而难以随访的。因此，经皮肝穿刺活检难以推广为肝纤维化动态评估的常规方法。采用简单、无创、可重复的方法对肝纤维化进行评估，以监测疾病进展、临床预后、治疗反应及逆转肝纤维化药物的疗效，是临床上需要的。

将来肝穿刺对诊断不明原因的肝病仍具重要价值，但新的无创检查方法，如血清学生物标志物的检测和弹性扫描等，用于评估和判断酒精性和病毒性肝病的肝纤维化程度，有可能替代肝活检。Fibrospect是一项新颖、无创、无痛、快速和客观的诊断肝纤维化的方法。由于Fibrospect局限性，目前还没有建立统一的诊断纤维化分期的标准，原则上就需要建立不同人群的界定值来评估肝纤维化的分期。FT(FibroTest)在区分严重和轻微/无纤维化病例时准确度优于肝活检，但对纤维化程度介于其间者无明显优势。

蛋白质组技术已被用来识别特定疾病或疾病阶段的蛋白标志物。早期的结果为肝脏疾病标志物寻找已报告。血清，去除血浆凝血因子，包含除了各种小分子，如盐，脂肪，氨基酸和糖含蛋白60-80毫克/毫升。据估计，整个血清中含有多达10,000种来源于细胞和组织的蛋白质，由于肝脏是其主要来源，血清蛋白质可能反映肝脏疾病。

蛋白质组学技术已被开发，以提高蛋白质组进行调查。二维凝胶电泳(2-DE)的，一个典型的方法分离和比较复杂的蛋白质混合物，在其基础上建立的荧光差异蛋白表达分析系统(DIGE)。DIGE在传统双向电泳技术的基础上，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE技术可检测到样品间小于10％的蛋白表达差异，统计学可信度达到95％以上。

另一种蛋白质组技术同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)正被广泛应用。iTRAQ技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达八种不同样本同时进行定量分析。研究人员采用iTRAQ蛋白质定量技术加速蛋白质的定量研究，iTRAQ技术依托于溶液同位素标记体系，利用同位素质量标签对蛋白质进行标记，使具有相同的离子化能力，将标记蛋白质混合起来，应用液相色谱与质谱串联进行分析，可以通过比较质谱峰的强弱得到相对定量的数值。

Imbert-Bismut等建立了一个更特异的检测肝纤维化方法(Imbert-Bismut F，Ratziu V，Pieroni L，Charlotte F，Benhamou Y，Poynard T.Biochemical markers of liver fibrosisin patients with hepatitis C virus infection：a prospective study.The Lancet.2001；357：1069-1075.)。检测丙型肝炎病人一组17种血清标志物(主要是蛋白质)并同时作肝活检。血清标志物是：α₂巨球蛋白，谷草转氨酶，谷丙转氨酶，γ谷氨_转，总胆红素，白蛋白，α₁球蛋白，α₂球蛋白，γ球蛋白，β球蛋白，载脂蛋白AI，结合珠蛋白，白细胞介素10，肿瘤生长因子β1，肝细胞生长因子，载脂蛋白A-II和载脂蛋白B.目前还不清楚这17蛋白的选择标准，但很多是高丰度蛋白质。我们的蛋白组学方法是一种无偏差的方法，因为所有的蛋白质，已知与未知的，都可用DIGE和iTRAQ进行评价。Imbert-Bismut等用METAVIR评分系统评估肝纤维化程度，结合统计分析回归等确定的六个最可靠的标记物为：α₂巨球蛋白，触珠蛋白，γ球蛋白，载脂蛋白AI，γglutamyltrans-酶和总胆红素。另一组作者认为，通过使用这组基本血清标志物(命名为FibroTest)，可检测肝纤维化，肝活检的患者数量可以大大减少。但迄今为止，独立的验证得出的结论是FibroTest无法准确预测明显存在的肝纤维化。

最近有研究者建立了另一个非侵入性的检测慢性丙型肝炎患者的肝纤维化和肝硬化得方法。其指数分别为血小板计数，谷草转氨酶(AST)，碱性磷酸酶和AST与血小板比值指数率(APRI)。然而，其预测肝纤维化的准确率只有51％，证明低于Fibrotest。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种新型、高效、准确率高蛋白质及蛋白质组在制备肝硬化诊断试剂中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

蛋白质亲血小板碱性蛋白(pro-platelet basic protein，PBP)在制备肝硬化诊断试剂中的应用。

蛋白质组性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFbp-3)、基膜聚糖蛋白(lumican)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)、亲血小板碱性蛋白(pro-plateletbasic protein，PBP)和硫氧还蛋白(thioredoxin)在制备肝硬化诊断试剂中的应用。

蛋白质组性激素结合球蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3、基膜聚糖蛋白、色素上皮衍生因子、亲血小板碱性蛋白、硫氧还蛋白、四连接素(tetranectin)在制备肝硬化诊断试剂中的应用。

上述蛋白质的序列的氨基端序列见后面的蛋白质序列表。

本发明的优点及积极效果如下：

1、本发明采用蛋白质组技术，大范围鉴定和评估与健康和疾病状态相关的多种蛋白质，使用这些筛选鉴定肝炎肝纤维化的生物标志物来预测肝炎肝纤维化的程度，可用于制备诊断肝硬化及肝硬化级别的试剂盒，这些蛋白质标记物鉴定肝纤维化及其程度的灵敏度，结合各蛋白质标记物的最佳状况，灵敏度可达89％，特异性达90％以上，高于已知的任何检测方法。

2、本发明用蛋白质谱法找出300多种潜在诊断标志，最后筛选出七种用于准确诊断肝纤维化及肝纤维化程度，72％可准确判断肝纤维化程度，88％以上可准确判断轻度(F0/F1期)或显著(F2/F4期)肝纤维化患者，为制备出准确检测肝硬化的试剂盒打打下了基础。

附图说明：

图1-图4为本发明7种蛋白性激素结合球蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3、基膜聚糖蛋白、色素上皮衍生因子、亲血小板碱性蛋白、硫氧还蛋白、四连接素在不同肝纤维化(F0-F4)血液中的含量图；

图5-图7为本发明酶联法基膜聚糖蛋白、性激素结合球蛋白和亲血小板碱性蛋白检测血清样本检测图；

图8-图10为本发明酶联法胰岛素样生长因子结合蛋白3、色素上皮衍生因子和硫氧还蛋白检测血清样本图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明的技术方案如下：

1、正常F0，肝纤维化F1，F2，F3，F4每组6例活检以巴茨和路德维希法鉴定分级；

2、血清蛋白经IgY12 Beckman系统去除12种高丰度蛋白；

A)CyDye标记蛋白----DIGE分析---Decyder----统计分析---初选标记物1；

B)iTRAQ 8标标记蛋白-----iTRAQ分析---统计分析---初选标记物2；

3、初选标记物1和2经统计分析---候选标记物；

4、为候选标记物建立ELISA，鉴定标记物。

具体步骤如下：

样品分析：样品(血清和肝活检)收集遵循的程序获得英属哥伦比亚大学及英属哥伦比亚省生物安全委员会的批准。血清标本，通常在2小时内冷冻储存。对应匹配的肝活检地分级，由有经验的胃肠病理学家根据巴茨和路德维希系统鉴定。这个系统包括肝纤维化评分(0-4级)和炎症活动等级(0-4级)单独评估。

样品制备

IgY去除血清样本的12个主要高丰度蛋白质(白蛋白，免疫球蛋白，转铁蛋白，纤维蛋白原，免疫球蛋白，α2-巨球蛋白，免疫球蛋白M，α1-抗胰蛋白酶，结合珠蛋白，α1-酸性糖蛋白，载脂蛋白AI)(Beckman，ProteomeLab IgY-12，Folton，California，USA)后再用Plus-2(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)去除样本中的杂质，用Bradford法检测蛋白质浓度(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。样本蛋白质浓缩后经蛋白变性和还原后，将半胱氨酸残基封闭。胰蛋白酶37℃.消化16小时，进行样本蛋白质iTRAQ标记。8plex iTRAQ^TM有8个可检测标记基团(m/z113，114，115，116，and 117，118，119 and 121)，相应的平衡基团(m/z31-28)和一个氨基酸活性基团用以标记(ABI，Foster City，CA，USA)，标记方法按厂家程序，之后，合并标记的多肽，真空干燥后样本溶于～3mL 0.2％formic acid，pH＜3，用3毫升MCX柱(Waters Corporation，Milford，MA)去除杂质，真空干燥净化的多肽供质谱分析。

强阳离子交换层析柱(SCX)色谱分析

上诉的合并标记肽，上载SCX层析分离多肽的方法，方法参照Batts KP，Ludwig J.ChronicHepatitis：an update on terminology and reporting.The American Journal of Surgical Pathology.1995；19：1409-1417文献中的方法。分离多肽洗柱方法如下，55分钟10-100MM钾磷缓冲系梯度继之以55～75分钟100-500MM钾磷缓冲系梯度的线性洗脱，收集间隔3分钟，真空干燥280纳米处的紫外吸收系数＞2.0MAU的收集管供下一步分析。

LC-MALDI-MS分析

上诉分离的多肽SCX组分使用Tempo LC MALDI点阵系统(AB Sciex，Foster City，CA)来分离多肽，LC洗脱物以1232点阵格式点到一个LC MALDI目标板上。MS数据从4800MALDI TOF/TOF  分析仪(AB Sciex，Foster City，CA)以重复频率为200赫兹的Nd:YAG激光器上收集。TOF MS谱收集段为800-4000m/z。每一个固定的激光设置点的TOF MS谱收集800次激光点击质谱。Tandem MS运作模式是2KV和CID(空气)碰撞能量，设置范围为10m/z至前体质量值的95％。前体的质量窗口设置为250ppm。数据依赖串联质谱设置包括前30名最强烈的离子信号采集每点。2个或更多的连续点的LC运行设置：(在200ppm的误差)相同的前体m/z值，质谱完全根据被收集的最大的S/N(信噪比)，作为确定的TOFTOF质谱(Lund TC，Anderson LB，McCullar V et al.iTRAQ is a useful method to screen for membrane-bound proteinsdifferentially expressed in human natural killer cell types.J.Proteome.Res.2007；6：644-653)。

数据库检索和相对定量：串联质谱分析用Protein Pilot version3.1软件(AB Sciex，FosterCity，CA)，它使用Paragon得分算法和ProGroup蛋白分组算法(Shi lov IV，Seymour SL，PatelAA，Loboda A，Tang WH，Keating SP，Hunter CL，Nuwaysir LM，Schaeffer DA.The ParagonAlgorithm，a next generation search engine that uses sequence temperature values andfeature probabilities to i

统计分析

从iTRAQ的软件ProteinPilot输出的数据用Oberg的方法正常化和统计分析后(方法参照：Oberg AL，Mahoney DW，Eckel-Passow JE，Malone CJ，Wolfinger RD，Hill EG，CooperLT，Onuma OK，Spiro C，Therneau TM，Bergen HR 3rd.Statistical analysis of relativelabeled mass spectrometry data from complex samples using ANOVA.J Proteome Res.2008；7(1)：225-33.)，再对结果进一步评价，旨在观察蛋白质水平以预测与肝纤维化程度的未来未知样品的纤维化程度的差异的关系。虽然我们无法直接评价一个混合样品中的蛋白质有多大的差异，我们评估不同个体中，肝纤维化程度不同的个体中蛋白质水平(相对丰度)的差异。对于每一个蛋白质，对纤维化程度不同的蛋白质丰度的差异值取其对数值，再进行评价。除了相对定量，iTRAQ还提供一个相对误差参数，这个误差参数是根据定量的多肽数及其峰值的百分比误差得来的。根据用于定量该蛋白的多肽数，这个误差参数转化为估计该蛋白质丰度(加权)的标准差.然后再使用相应的蛋白丰度值和在一个T-统计的方式处理这些估计的标准差，对蛋白质组排名比较。评估以递减分割的方式来评估预测一种蛋白质与丙型肝炎病人的肝纤维化程度之间的潜在关系。

DIGE荧光差异蛋白表达分析

去除12种高丰度蛋白的血清蛋白标记CyDye(通用电气医疗生物科学公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)后进行2DE分析(24cmX24 cm，Dattan system)。荧光图像由Typhoon 96oo荧光扫描仪(通用电气医疗生物科学公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)扫描记录。

同组血清样品每组等蛋白量合并去除12种高丰度蛋白后，不同组50ug蛋白分别与Cye3和Cye5标记，每对样品等量蛋白混合用Cye2标记作对照，方法为50ug蛋白与400pmol荧光标记物混合后在暗室室温下反应30分钟，再与10mM赖氨酸在冰上反应10分钟以封闭活性基团.各标记样品等量混合后进行2DE分析，条件为：18cm pH 4-7 IPG strips(Bio-Rad)上样过夜，IEF在Protean IEF cell(Bio-Rad)用42,000KVh聚焦，IPG条用还原剂等平衡后用12.5％SDS-PAGE凝胶(Criterion precast Tris-HCL gels，Bio-Rad)电泳，然后凝胶由Typhoon96oo荧光扫描仪扫描，根据荧光图象，用自动取胶仪挖出Cye3或Cye5标记深的区域，这些凝胶用于鉴定其中的蛋白质。

凝胶件放入一个1500微升管中，在室温下用500μl 50mM碳酸铵，50％的乙腈溶液孵育30分钟，重复两次，然后凝胶完全脱水。每管干凝胶加40μl胰蛋白酶液(160μl of 100mM ammonium bicarbonate，3.2μl of 0.5M CaCl₂，157μl of water，40μl of 0.1μg/μltrypsin stock solution)置冰上15分钟后取出多于液体，再加入60微升消化缓冲液，37℃反应16小时，取上清液在-4℃保存；另用50μl 50mM碳酸铵，50％的乙腈溶液超声洗15分钟，重复两次，上清液合并，50μl  5％氟酸和50μl 50％乙腈各超声洗15分钟，合并所有上清液，加6微升DTT后干燥，提取物再溶于10微升5％氟酸用于质谱鉴定。

酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA))实验室常用的免疫检测方法，补体1q，补体3，补体8，补体4A(Qaidel，CA，USA)，凝血因子IX，α-2-HS型糖蛋白，FEDF，性激素结合球蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白(R & D System)为商品试剂盒，按厂家程序操作。基膜聚糖蛋白(Seretek，CA，USA)，亲血小板碱性蛋白和硫氧还蛋白(Chemicon，CA，USA)的检测，将抗体包被酶联板，封闭后，适当稀释的血清室温下反应1小时，再与适当稀释的另一个第一抗体室温下反应1小时；再加适当稀释的酶标第二抗体室温下反应30分钟。最后，加TMB底物反应10分钟，用2N盐酸终止反应。

用iTRAQ来鉴定筛选肝纤维化的生物标志物。

血清是这一项目的主要样本。由于高丰度蛋白干扰低丰度蛋白质的鉴定识别，iTRAQ的分析前所有样本均去除12种血清高丰度的蛋白质。这12种血清高丰度的蛋白质占血清蛋白质的96％，用去处高丰度的蛋白质的样品大大增加低丰度的蛋白质的鉴定机会。为观察不同程度肝纤维化组及正常样品之间蛋白质及其含量的差异，本发明共进行4组八标iTRAQ试验。四组试验共有1387种蛋白质和2454种多肽含定量数据，合并四组数据，除去共有多肽等剩下518种蛋白质和1282种多肽含半定量数据，数据用Oberg的方法正常化和统计分析后再如上述方法权重分析，68种蛋白质在不同程度肝纤维化组之间或正常样品及程度肝纤维化组或程度肝纤维化组及正常样品有p值＜0.05。审查统计分析P值及组间组合，目视检查质谱鉴定有确定的MS/MS谱图等选出21种蛋白质为肝纤维化的生物标志物。所有的蛋白质最低基于2肽(95％可信度)，见表1a。

5组样品及其内标荧光图像经Decyder分析，2376个定量的蛋白质点经统计分析后发现56蛋白质点肝纤维化样品明显高于或低于对照样品，这些蛋白点因此被切出，消化，最后经质谱鉴定。表1b列举一些与iTRAQ(部分列于表1a)鉴定的蛋白质重叠的蛋白质。

从DIGE和iTRAQ的结果经Ingenuity Pathway Analysis system诊断标记分析，统计分析和文献分析后21种蛋白质被选为肝纤维化候选标记物。

表1a-b中蛋白补体1q，C3，8，补体4A，凝血因子IX，α-2-HS型糖蛋白，基膜聚糖蛋白及胰岛素样生长因子结合蛋白是很好的区别正常人和肝纤维化的候选生物标志物，亲血小板碱性蛋白，细胞粘附分子-同源L1CAM是好的区别正常人，肝纤维化F4和肝纤维化F1-F3的候选生物标志物。抗凝血酶1及丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂7良好的区别正常人，肝纤维化F1和F2的候选生物标志物。维生素D结合蛋白和间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4是好的区别正常人，肝纤维化F1，F2，F3和F4的候选生物标志物。四连接素和性激素结合球蛋白是区别正常人，肝纤维化F1，F4和F2及F3的候选生物标志物。表1a中iTRAQ的“未使用的得分”是专用于鉴定该蛋白质的肽的总数得分(Sui J，Zhang J，Tan TL，ChingCB，Chen WN.Comparative proteomics analysis of vascular smooth muscle cellsincubated with S-and R-enantiomers of atenolol using iTRAQ-coupled two-dimensionalLC-MS/MS.Mol Cell Proteomics.2008 Jun；7(6)：1007-18)。所有的肝纤维化的候选生物标志物的蛋白质，得分在2或2以上，显示出蛋白质鉴定的可信度很高。

ELISA被用于检测这14种蛋白的血清定量，iTRAQ可以鉴定大量蛋白质并可半定量其丰度，是大规模筛选的有效方法。酶联免疫吸附试验被用于检测上述候选生物标志物的蛋白质在血清中的水平。56例正常人，肝纤维化F1，F2，F3及F4的病人血清被用以检测。酶联免疫吸附试验发现蛋白补体1q，C3，8，补体4A，凝血因子IX和α-2-HS型糖蛋白在正常人及肝纤维化F1，F2，F3和F4间的血清水平具有一定差异，但未达到统计差异的水平。基膜聚糖蛋白及胰岛素样生长因子结合蛋白3则可很好的区别正常人和肝纤维化(图1)。四连接素和性激素结合球蛋白血清水平显示它们是区别正常人，肝纤维化F1，F4和F2及F3的良好生物标志物(图2)。硫氧还蛋白和亲血小板碱性蛋白在F3病人血清中明显不同于正常人和肝纤维化F1，F2，F4的血清(图3)。色素上皮衍生因子则在F4病人血清中明显不同于正常人和肝纤维化F1，F2，F3的血清(图4)。结果表明性激素结合球蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白3，基膜聚糖蛋白，色素上皮衍生因子，亲血小板碱性蛋白，硫氧还蛋白等蛋白质是好的肝纤维化定性定量标记物，表2是个蛋白质每组11例的均值和标准差。

表3总结这些蛋白质标记物鉴定肝纤维化及其程度的灵敏度，结合各蛋白质标记物的最佳状况，灵敏度可达89％，特异性达90％以上。

用去除高丰度蛋白质的血清结合蛋白质组学的方法，可大范围的增加鉴定血清蛋白质，可以从5微升血清样品可鉴定超过800种蛋白质。此外，血清中可能含有多达10,000个蛋白质，蛋白质组学的方法很可能鉴定出与健康和疾病的各种状况相关的新的血清蛋白质。我们利用目前新的两种不同的蛋白质组方法筛选肝组织纤维化程度不同的个体的血清中蛋白质种类及其量的差异。在本发明中，我们用iTRAQ和DIGE确定了21个对肝纤维化的程度的检测标志物，并用酶联免疫吸附试验验证其中7种蛋白对肝纤维化的程度的检测作用。迄今为止，用于鉴定显著肝纤维化的非侵入性，无创性测试方法尚未象常规实验室提供的相关方法，如肝脏，血小板计数和凝血酶原时间的测试，得到广泛的使用，特异性血清标志物未得验证。美国国立卫生研究院的共识声明指出，目前没有单一试验或血清学标志物面板可以提供一种这样的准确的评估。同样，肝功能及肝脏影像学的成像定量试验在评估晚期肝纤维化及肝硬化有用，诊断早期肝硬化不敏感。本发明采用两种新蛋白质组技术，以确定新的预测肝纤维化的生物标志物。

验证方法如下：

iTRAQ和DIGE两种新蛋白质组技术都可以半定量，但DIGE要做到每个蛋白质点一个蛋白质很难，因此，每个蛋白质点可能含一个以上的蛋白质，定量数据没有iTRAQ可靠.表1a中除结合珠蛋白外，所有蛋白质从未被用量化肝纤维化，补体C1q，3，4A，8，，免疫球蛋白与炎症和免疫有关，维生素D结合蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白调节胰岛素样生长因子的可用性和活性，可能在组织纤维化中发挥作用.血清淀粉样P组分主要在肝脏中产生的，是两个短pentraxins之一(另一个是C-反应蛋白)，短pentraxins的主要职能是一眼认出各种病原体，然后消灭他们，α-2-HS型糖蛋白，抗凝血酶-III，亲血小板碱性蛋白是一种血小板碱性蛋白和β-thromboglobulin前体，参与凝血过程。细胞粘附分子(同源L1CAM)是相关的神经元和细胞组织形态的变化，α-1-酸性糖蛋白2是与炎症和免疫调节急性相蛋白，硫氧还蛋白有抗氧化，抗炎作用，视黄醇结合蛋白4在非酒精性肝病中起作用，性激素结合球蛋白在代谢性肝病中起作用，色素上皮衍生因子与肝尖细胞纤维化有关，凝血因子IX与肝硬化有关，基膜聚糖蛋白是一种蛋白质，调节胶原纤维聚合，并已被证明是过度非酒精性脂肪肝中高表达，四连接素可能参与炎症和癌症⁴⁴这些蛋白质明显参与了许多免疫反应或影响慢性肝炎的其他机制，这些说明本结果的合理性。

Fibrospect用三个纤维化指标(透明质酸，组织金属蛋白酶抑制因子1和α-2-巨球蛋白)以区分轻度(F0-F1)和重度(F2-F4)纤维化，发现重度纤维化检测，根据受试者工作特征(ROC)曲线0.826，灵敏度71.8％，特异性73.9％，阳性预测值60.9％，阴性预测值82.3％，总73.1％。α-2-巨球蛋白是一种高丰度蛋白，我们早在分析中删除，以研究低丰度蛋白质。另外两个蛋白质在这项研究中没有发现。但本研究发现FibroTest相关的六个用于标记三种蛋白质：结合珠蛋白，γ球蛋白及载脂蛋白AI。表1和2列举的蛋白质中，只用一种或两种以检测肝纤维化及其程度都是不可能的，但综合表2中的结果，结合多个蛋白质来检测肝纤维化并判断其纤维化程度是可能的，如蛋白质基膜聚糖蛋白，四连接素，亲血小板碱性蛋白，色素上皮衍生因子和胰岛素样生长因子结合蛋白3，性激素结合球蛋白，硫氧还蛋白，色素上皮衍生因子等组合都可满足这一要求.这些蛋白质标记物鉴定肝纤维化及其程度的灵敏度，结合各蛋白质标记物的最佳状况，灵敏度可达89％，特异性达90％以上.高于已知的任何检测方法。

肝硬化检测实例

酶联法检测血清样本.图中正常和F1-F4纤维化对照是每组11例，等量血清的混合物。结果显示同时检测多个肝纤维化定性定量标记物可以帮助准确鉴定肝纤维化程度。

酶联法基膜聚糖蛋白，性激素结合球蛋白和亲血小板碱性蛋白检测血清样本(图5-7)，A，44岁，男性，丙型肝炎，肝活检F1；B，54岁，女性，脂肪肝，肝活检F2；C，67岁，男性，酒精型肝炎，肝活检F3；D，39岁，男性，丙型肝炎，肝活检F4。

酶联法胰岛素样生长因子结合蛋白3，色素上皮衍生因子和硫氧还蛋白检测血清样本(图8-10)，E，44岁，男性，丙型肝炎，肝活检F4；F，54岁，男性，丙型肝炎，肝活检F3；R，39岁，男性丙型肝炎，肝活检F1)。

表1a iTRAQ鉴定的肝纤维化蛋白质标记物

a：unused score，用于鉴定该蛋白质的多肽质谱可信度，2等于99％

b：该蛋白质的定量权重值。

表1b DIGE鉴定的肝纤维化蛋白质标记物

  Accession(gi)  Name  111307730  结合珠蛋白  4505047  基膜聚糖蛋白  825722  四连接素

  221044722  α-2-HS 型糖蛋白  148745112  补体H  13529242  载脂蛋白A-I  47479685  性激素结合球蛋白  119575619  Desmoplakin  18088326  视黄醇结合蛋白4  1144299  色素上皮衍生因子  177840  α-1-酸性糖蛋白2  4502261  抗凝血酶-II  4502133  血清淀粉样P成分  4826772 胰岛素样生长因子结合蛋白3  67190748  补体4A  31542984  α间球蛋白抑制剂H4  32483410  维生素D结合蛋白  115298678  补体3

表2 7种ELISA检测结果

表3各种ELISA检测阳性率