黄热、登革、乙型脑炎多重病毒荧光定量PCR检测新方法及该多重病毒检测PCR体系

摘要

本发明公布了一种黄热、登革、乙型脑炎多重荧光定量PCR检测新方法及该多重病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，三对引物和探针的特异性良好，灵敏度颇高，非常适用于黄热、登革、乙型脑炎病毒同时检测，与其它几种虫媒出血热病毒如马尔堡、裂谷热无交叉反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及黄热、登革、乙型脑炎病毒的快速定性和定量检测方法，各提供一对特异性引物和探针。

背景技术

黄热病(俗称“黄杰克”、“黑呕”，有时又称美洲瘟疫)是一种急剧性病毒病。曾导致过一些毁灭性的疫疾。此病从猴子向人或人际间的传染中，蚊子是主要的介导者。每年全世界至少有20万黄热病病例，造成3万人死亡，其中90％病例来源于非洲。由于黄热病的高死亡率及强传染性，已被纳入世界卫生组织规定之检疫传染病之一。

流行性乙型脑炎(epidemicencephalitisB)是由嗜神经的乙脑病毒所致的中枢神经系统性传染病，简称乙脑。经蚊等吸血昆虫传播，流行于夏秋季，多发生于儿童，临床上以高热、意识障碍、惊厥、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。部分患者留有严重后遗症，重症患者病死率较高。全球报告病例数每年在16000以上，死亡5000例。

登革病毒(Dengue virus)感染引起登革热(Denguefever，DF)或登革出血热(Dengue haemorrhagic fever，DHF)。该病流行于热带、亚热带地区，特别是东南亚、西太平洋及中南美洲。我国于1978年在广东佛山首次发现本病，以后在海南岛及广西等地均有发现。据WHO估计，每年DF感染人数有5000万，其中DHF约50万，死亡在2万人以上，受威胁人口达25亿。

三种病毒均属于黄病毒，目前检测黄病毒的方法有逆转录聚合酶反应，SYBR Green Real-time PCR，微孔杂交，蛋白芯片技术等，还未有报道使用TaqMan Real-time PCR方法进行多种黄病毒同时检测，而这种方法无疑更加快速准确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒荧光定量PCR检测新方法及该多重病毒检测PCR体系，该方法能够快速定性和定量检测黄热病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒，包括三对特异性更高、 灵敏度高、重复性好的引物和探针。

为实现上述目的，本发明黄热、登革、乙型脑炎多重病毒荧光定量PCR检测新方法，该方法中：

1)设计检测黄热病毒的第一对引物探针为：

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   FP   ATGTCTGGTCGTAAAGCTCAGG  119-140   58.7    RP   AGGTCCAGGTCTGTTTCCAAT  218-238   57.6    Probe   TCAATATGGTACGACGAGGAGTTCGC  156-181   67.7   FAM/BHQ-1

2)设计检测登革病毒的第二对引物探针为：

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   FP   GCTGGAAGGACTAGAGGTTAGAG  10627-10649   56.6    RP   GATTCAACAGCACCATTCCAT  10748-10768   57.2    Probe   AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGA  10670-10695   67.4   Texas Red/BHQ-2

3)设计检测乙型脑炎病毒的第三对引物探针为：

  Name   Sequence   Strand   Position   Tm℃   Modification   FP   GTTTATCTGTGTGAACTTCTTGGC  forward   5-28   57.9    RP   TTTAGTCATGGTTATCTTCCGTTC  reverse   81-104   57.7    Rrobe   AGTATCGTTGAGAAGAATCGAGAGATTAGTGC  reverse   31-62   67.8   CY3/BHQ-2

进一步，所述的黄热、登革、乙型脑炎多重病毒荧光定量PCR检测新方法，具体为：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

进一步，所述步骤2)中荧光素的供选择的荧光发射基团有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，荧光淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TM RQ、Lowa Black^TM FQ、Dabcyl。

进一步，所述步骤4)中采取基因合成方式制作阳性质粒CBG228-3、CBG231-3、CBG229-1作为阳性样品：将引物设计过程中筛选出的高保守 区域bp119-bp238，bp10627-bp10768，bp5-bp104前后分别延长5～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为所述阳性质粒样品，编号CBG228-3，CBG231-3，CBG229-1。

进一步，所述步骤5)中荧光定量PCR反应适用于所有荧光定量PCR反应仪；

进一步，所述荧光定量PCR反应仪包括SmartCyclerII、ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。

进一步，所述步骤5)中最佳扩增条件为：

一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒检测PCR体系，该体系包括引物或者其他能与黄热全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒检测PCR体系，该体系包括引物及能与黄热全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与黄热全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒检测PCR体系，该体系包括引物或者其他能与登革全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒检测PCR体系，该体系包括引物及能与登革全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与登革全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒检测PCR体系，该体系包括引 物或者其他能与乙型脑炎全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种黄热、登革、乙型脑炎多重病毒检测PCR体系，该体系包括引物及能与乙型脑炎全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与乙型脑炎全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

本发明设计三对新的引物探针，结合运用SmartCyclerII建立一种快速、敏感、特异的荧光定量PCR方法同时检测黄热、登革、乙型脑炎病毒。通过序列比对的方式挑选出三种病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上分别设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为多重检测的扩增曲线图；

图2为多重检测中黄热病毒的标准曲线图；

图3为多重检测中乙脑病毒的标准曲线图；

图4为多重检测中登革病毒的标准曲线。

具体实施方式

本发明黄热、登革、乙型脑炎多重病毒荧光定量PCR检测新方法的工作原理即是利用荧光信号的变化定性分析，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。本发明还涉及上述检测体系所包含的所有内容。

该方法包括以下步骤：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

1、引物探针的设计

根据拟研究基因名称黄热、登革、乙型脑炎，在genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和blast序列分析，筛出黄热病病原的高度保守序列5′UTR119-238(总长120bp)，登革热病毒的高保守序列bp10627-bp10768(总长141bp)，乙脑病毒的高保守序列bp5-bp104(总长100bp)作为检测目的基因，采用引物设计软件Primer Premier 5进行引物探针的设计，序列见表1.表2.表3.

表1荧光定量PCR检测黄热病毒的引物和探针

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   FP   ATGTCTGGTCGTAAAGCTCAGG  119-140   58.7    RP   AGGTCCAGGTCTGTTTCCAAT  218-238   57.6    Probe   TCAATATGGTACGACGAGGAGTTCGC  156-181   67.7   FAM/BHQ-1

注：引物和探针在黄热病毒基因组上的核酸位点依据的是GenBank序列号为NC_002031的毒株序列。

表2荧光定量PCR检测登革病毒的引物和探针

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   FP   GCTGGAAGGACTAGAGGTTAGAG  10627-10649   56.6    RP   GATTCAACAGCACCATTCCAT  10748-10768   57.2    Probe   AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGA  10670-10695   67.4   Texas Red/BHQ-2

注：引物和探针在登革病毒基因组上的核酸位点依据的是GenBank序列号为NC_001474的毒株序列。

表3荧光定量PCR检测乙型脑炎病毒的引物和探针

  Name   Sequence  Position  Tm℃   Modification  FP   GTTTATCTGTGTGAACTTCTTGGC  5-28   57.9    RP   TTTAGTCATGGTTATCTTCCGTTC  81-104   57.7    Rrobe   AGTATCGTTGAGAAGAATCGAGAGATTAGTGC  31-62   67.8   CY3/BHQ-2

注：引物和探针在乙型脑炎病毒基因组上的核酸位点依据的是GenBank序列号为NC_001437的毒株序列。

2、荧光素的选择

使用仪器为美国Cepheid公司的SmartCyclerII，黄热病毒荧光发射基团采用特性最为稳定的FAM基团，荧光淬灭基团采用BHQ-1；登革病毒荧光发射基团采用Texas Red，荧光淬灭基团采用BHQ-2；乙脑病毒采用CY3/BHQ-2，三者使用不同荧光信号以示区别。

3、引物及探针的合成交予宝生物工程(大连)有限公司完成。

4、本发明采取基因合成方式制作阳性质粒作为阳性样品。将引物设计过程中筛选出的高保守区域前后分别延长30～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为我们的阳性质粒样品，编号CBG228-3，CBG231-3，CBG229-1。

5、质粒标准品的制备

由委托公司合成并提取的阳性质粒样品原液，通过超微量紫外分光光度计测得浓度分别为黄热310ng/μl、登革299ng/μl、乙脑301ng/μl，根据单链DNA的拷贝数计算公式“拷贝数浓度(copies/μl)＝DNA浓度(ng/μl)×6.02×1023(copies/mol)/324×2×(载体碱基数+目的基因碱基数)”计算得知黄热病毒质粒原液的DNA拷贝数浓度约为1×10¹¹copies/μl；登革约为9.6×10¹⁰copies/μl，乙脑同样约为1×10¹¹copies/μl。使用EASY Dilution(一种专门用于标准品稀释使用的液体，由大连宝生物公司生产)分别进行梯度稀释最终得到1×10⁰～1×10¹⁰copies/μl的质粒标准品。

6、引物和探针溶解稀释至所需浓度并避光保存。

引物一般稀释到10μm/L，探针稀释到5μm/L，密封并避光保存到-20℃冰箱。稀释所用水为灭菌Tris水(Ph7.0～8.0)。

7、Real-Time PCR扩增

选用的扩增试剂盒为Premix Ex Taq试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。反应体系组分及其体积见表4。

表4.(M表示马尔堡；E表示埃博拉)

扩增条件如下

8、数据分析

9、提取病毒RNA，进行反转录，所得cDNA使用灭菌水梯度稀释，取代阳性样品进行检测验证。

引物探针浓度的优化

1.首先稀释各引物探针至低浓度备用，引物稀释到10μm/L，探针到5μm/L；

2.首先向25μL体系中分别加入0.5μL三种病毒的上下游引物(10μm/L)和0.5μL Taqman探针(5μm/L)，模板各加1μL，Premix Ex Taq反应液仍旧加入12.5μL，剩余体积用灭菌水补足。运行PCR。结果显示CY3和Texas Red荧光值都非常小，明显低于FAM荧光，表明三种荧光基团同时存在的情况下，CY3和Texas Red发光效率颇低，为不影响阳性判断，预提高CY3和Texas Red探针引物的加入量，以提高其发光效率便于数据读取。

3.将乙脑、登革的引物探针加入量提高一倍，即1μL，同时黄热的引物探针量不变，其它如上，运行PCR。效果有所提高，但仍有很大的荧光值差异。

4.降低黄热病毒引物探针的加入量，减至0.2μL，乙脑、登革病毒均继续加入1μL，再次运行PCR。结果三种荧光的发光值仍不能完全均衡。为此考虑到，荧光差异不可避免，过多的引物和探针也会影响体系的反应效率，故无需过分纠结差异过大的荧光信号，只需能够稳定检测到目的基因，得到稳定的Ct值即可。因此，确定25μL多重荧光定量PCR反应体系中，黄热病毒引物探针浓度为80×40nm/L，乙脑引物探针浓度则为400×200nm/L，登革引物探针浓度同乙脑。

退火温度的选择

理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时要足够高，以减少非特异性结合。在设置退火温度时如下进行：以低于设计引物时估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。初步设定5组温度：52℃，54℃，56℃，58℃，60℃。五组退火温度下均可检测出目的片段，证明该引物和探针性能较好，可适应的温度范围较宽。但荧光信号最强同时Ct值最小的温度为56℃，最终确定最佳退火温度为56℃。

重复性检测

通过图2.3.4.各个浓度梯度的DNA模板荧光定量PCR来看，每个梯度2到3个平行实验中都产生了较为接近的Ct值，反应相关系数r-squared都能达到0.99上下，重复性较好。

特异性检验

用所建立的方法检测与黄热、登革、乙脑病毒同为虫媒出血热病原的马尔堡、裂谷热等病毒，结果均为阴性。

表明本次所设计的引物探针特异性很好。

标准曲线的建立

体系的优劣可通过扩增效率e来反映，e值越趋近于1，说明扩增效率越接近100％，反应体系越佳；e＜1，说明体系扩增效率较低，体系需要优化；e＞1，说明体系中含有抑制物，需要降低甚至排除抑制物的干扰。该领域内公认的扩增效率适宜范围在0.8-1.2之间。分别采用各自梯度模板进行扩增，所得标准曲线为图2.图3.图4，扩增函数

黄热：Y＝-0.295X+11.636，e＝10^-k-1＝0.97＝97％。(k＝-0.295)

乙脑：Y＝-0.296X+12.667，e＝10^-k-1＝0.98＝98％。(k＝-0.296)

登革：Y＝-0.283X+11.958，e＝10^-k-1＝0.92＝92％。(k＝-0.283)

本发明的目的就是设计三对新的引物探针，结合运用SmartCyclerII建立一种快速、敏感、特异的荧光定量PCR方法同时检测黄热、登革、乙型脑炎病毒。通过序列比对的方式挑选出三种病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上分别设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。本发明检测方法非常适用于黄热、登革、乙型脑炎病毒同时检测，与其它几种虫媒出血热病毒如马尔堡、裂谷热无交叉反应。