柴胡DNA鉴定试剂盒及鉴定方法

摘要

本发明涉及中药检测技术领域，是一种柴胡DNA鉴定试剂盒及鉴定方法，它包含：DNA提取试剂、柴胡鉴定系统和狭叶柴胡鉴定系统；柴胡DNA鉴定方法包括设计柴胡核糖体DNA二对特异寡核苷酸引物、人工合成二对引物、建立柴胡DNA鉴定试剂盒、确定反应程序和结果判定等步骤。本发明可用于中药的鉴定和检测，柴胡DNA鉴定试剂盒能够准确鉴别柴胡的特异性，可同时鉴定柴胡、狭叶柴胡与其易混品种；鉴定方法具有简便、快速等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及使用生物技术鉴定柴胡(柴胡和狭叶柴胡)与其易混品种DNA鉴定试剂盒及鉴定方法。

背景技术

柴胡系伞形科柴胡属多年生草本植物，以根及全草入药，是我国大宗紧缺中药材之一，价格高昂。功能发表和里，疏肝解郁，升提中气等，为临床常用之中药。我国共有柴胡属植物36种，17变种，7变型，《中华人民共和国药典》(2005版)仅规定柴胡(Bupleurum chinense DC.)和狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)两种为正品药用，但市场上的混用品种有十几种。

特别是近年由于资源严重减少，价格一直持上升趋势，使得一些伪品和混淆品大量出现，严重搅乱了正常的市场秩序，危害了患者的身体健康，甚至造成中毒事故的发生。

常用的柴胡鉴别方法有药材性状鉴别、显微鉴别和化学鉴别法。性状鉴别主要是指从柴胡的外形、大小、颜色、表皮特征、质地、断面特征、气味等宏观特征来判断品种。方法虽然简单，但经验在这种方法中的影响很大，主观性较强。即使进行了很详细的性状描述，再由其他人来判断也比较难。而且作为药材形态通常是不完整的，因此鉴定难度较大。

目前已有学者编制了柴胡组织及粉末检索表，为柴胡的显微鉴别提供了一定依据，但柴胡属植物的粉末没有太大的区别，只是纤维的形状、长短、壁的厚薄、淀粉粒的有无、孔纹导管的数量等，只具有相对的鉴别意义，无法准确鉴定真伪。

化学鉴别主要是柴胡皂苷a、d的定性检验，但是大部分柴胡的品种都含有柴胡皂苷，特征性不强，因而仅对柴胡皂苷a、d进行定性检验，难以达到药材质量控制的目的。

核糖体DNA(rDNA)序列因其功能上的高度保守性和进化的时钟性，已被越来越多地用于物种分类和遗传进化关系的研究。核糖体基因转录间隔区(ITS)序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而适合进行各种分子操作。由于该区域受外界环境因素的影响较小，进化速度很快，因而具有种内变异小而种间变异大的特性，是种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，可用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。

目前虽已有研究者探索用DNA分子标记鉴别柴胡，但都未获得理想的结果。大部分是对柴胡幼嫩组织(多为新鲜或干燥叶片)进行研究，而其入药部位为含有大量次生代谢产物的药材干根，且通常经过加工和炮制，研究成果缺乏实用性；而部分针对柴胡药材干根的研究一方面没有获得柴胡特有的分子标记，并且方法也不稳定。

发明内容

本发明的目的是对已掌握柴胡和狭叶柴胡核糖体DNA的全部基因组进行筛选，提供能够准确鉴别柴胡的特异性，可同时鉴定柴胡、狭叶柴胡与其易混品种的鉴定试剂盒；本发明的另一目的是提供简便、快速、检测结果可靠的柴胡DNA鉴定方法。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

一种柴胡DNA鉴定试剂盒，其特征是，它包含：

(1)DNA提取试剂：总体系1000μl，2％CTAB、100mmol/L Tris-HCl、30mmol/L EDTA、2.5mmol/L NaCI、3％PVP-40；

(2)柴胡鉴定系统，包括柴胡鉴定体系、柴胡阳性对照体系和柴胡阴性对照体系，所述的柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，柴胡DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水；

(3)狭叶柴胡鉴定系统，包括狭叶柴胡鉴定体系、狭叶柴胡阳性对照体系和狭叶柴胡阴性对照体系，所述的狭叶柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，TaqDNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的狭叶柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，狭叶柴胡DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的狭叶柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，TaqDNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水。

一种柴胡DNA鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤：

(1)设计柴胡核糖体DNA二对特异寡核苷酸引物，要求只含有柴胡和狭叶柴胡DNA序列，不含有同属DNA序列，如下引物1、引物2：

引物1为柴胡引物：

5’-ATGACCAACATTCGTAAACTC-3’

5’-TCTTCATTTTAATAGGTTATA-3’

引物2为狭叶柴胡引物：

5’-AGACACATTCGTAACTC-3’

5’-CTCATTTAATAGGTATA-3’

(2)人工合成柴胡核糖体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法；

(3)建立柴胡DNA鉴定试剂盒

(a)DNA提取试剂：总体系为1000μl，2％CTAB、100mmol/L Tris-HCl、30mmol/L EDTA、2.5mmol/L NaCI、3％PVP-40；

(b)柴胡鉴定系统，包括柴胡鉴定体系、柴胡阳性对照体系和柴胡阴性对照体系，所述的柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，柴胡DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水；

(C)狭叶柴胡鉴定系统，包括狭叶柴胡鉴定体系、狭叶柴胡阳性对照体系和狭叶柴胡阴性对照体系，所述的狭叶柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，TaqDNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的狭叶柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，狭叶柴胡DNA 2-5μl，余为双蒸馏水；所述的狭叶柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，TaqDNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水；

(4)设计反应程序

所有待检样本均用DNA提取试剂处理：取待检样本0.1g，洗净、吹干、剪碎，药材干根先除表皮，置于研钵中，加65℃预热的DNA提取试剂250ul，在液氮中研磨，磨碎液转入离心管65℃温浴1h，4℃12000rpm离心10min，上清液转入离心管，加24∶1的氯仿-异戊醇250ul，室温8000rpm离心10min，上清液转入离心管，加-20℃预冷的异丙醇200ul，-20℃冷冻1h，4℃12000rpm离心5min，弃上清液，晾干，加70％乙醇200ul清洗，室温12000rpm离心3min，弃去乙醇，干燥后加pH8.0的50ulTE或双蒸水，放入-20℃冰箱中备用，将试剂盒的柴胡鉴定体系、狭叶柴胡鉴定体系、柴胡阳性对照体系、狭叶柴胡阳性对照体系、柴胡阴性对照体系和狭叶柴胡阴性对照体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：柴胡鉴定体系、柴胡阳性对照体系、柴胡阴性对照体系：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度58℃30s，72℃45s，32个循环，72℃延伸8min，4℃；狭叶柴胡鉴定体系、狭叶柴胡阳性对照体系、狭叶柴胡阴性对照体系：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度56℃30s，72℃45s，32个循环，72℃延伸8min，4℃；

(5)结果判定

反应产物使用1.5-1.8％琼脂糖凝胶，在水平电泳仪上电泳，60-70mV电泳45-60min，分子量100-1200bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察得出结果。

本发明的柴胡鉴定试剂盒和鉴定方法与已有的柴胡鉴定方法相比，本发明在利用柴胡DNA具有种属特异性的基础上，发明了同时区别柴胡、狭叶柴胡与其易混品种的试剂盒和鉴定方法，具有简便、快速等优点。

附图说明

附图为试剂盒检测柴胡、狭叶柴胡与大叶柴胡、黑柴胡结果，柴胡和狭叶柴胡分别出现阳性结果。

其中：1为标准分子量；2为柴胡阳性对照，为300bp；3为狭叶柴胡阳性对照，为220bp；4为柴胡结果；5为狭叶柴胡结果；6为柴胡阴性对照；7为狭叶柴胡阴性对照。

具体实施方式

下面利用实施例对本发明作进一步说明。

一种柴胡DNA鉴定试剂盒，它包含：

(1)DNA提取试剂：总体系为1000μl，2％CTAB、100mmol/L Tris-HCl、30mmol/L EDTA、2.5mmol/L NaCI、3％PVP-40。

(2)柴胡鉴定系统，包括三部分：

①柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA2-5μl，余为双蒸馏水。

②柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，柴胡DNA2-5μl，余为双蒸馏水。

③柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mMdNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水。

(3)狭叶柴胡鉴定系统，包括三部分：

①狭叶柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA 2-5μl，余为双蒸馏水。

②狭叶柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mMdNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，狭叶柴胡DNA 2-5μl，余为双蒸馏水。

③狭叶柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水。

一种柴胡DNA鉴定方法，它包含以下步骤：

(1)设计柴胡核糖体DNA二对特异寡核苷酸引物，要求只含有柴胡和狭叶柴胡DNA序列，不含有同属DNA序列，如下引物1、引物2：

引物1为柴胡引物：

5’-ATGACCAACATTCGTAAACTC-3’

5’-TCTTCATTTTAATAGGTTATA-3’

引物2为狭叶柴胡引物：

5’-AGACACATTCGTAACTC-3’

5’-CTCATTTAATAGGTATA-3’

(2)人工合成柴胡核糖体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法；

(3)建立柴胡DNA鉴定试剂盒

(a)DNA提取试剂：总体系为1000μl，2％CTAB、100mmol/L Tris-HCl、30mmol/L EDTA、2.5mmol/L NaCI、3％PVP-40。

(b)柴胡鉴定系统，包括三部分：

①柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA2-5μl，余为双蒸馏水。

②柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，柴胡DNA2-5μl，余为双蒸馏水。

③柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mMdNTP 4-10μl，0.1mM“引物1”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水。

(c)狭叶柴胡鉴定系统，包括三部分：

①狭叶柴胡鉴定体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，待检样本DNA 2-5μl，余为双蒸馏水。

②狭叶柴胡阳性对照体系：总体系为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mMdNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，狭叶柴胡DNA 2-5μl，余为双蒸馏水。

③狭叶柴胡阴性对照体系：总体系均为100μl，含有缓冲液10μl，12.5mM dNTP 4-10μl，0.1mM“引物2”1.5-4.0μl，Taq DNA聚合酶2-10μl，大叶柴胡、黑柴胡DNA按1∶1混合物2-5μl，余为双蒸馏水。

(4)设计反应程序

所有待检样本均用DNA提取试剂处理：取待检样本0.1g，洗净、吹干、剪碎，药材干根先除表皮，置于研钵中，加65℃预热的DNA提取试剂250ul，在液氮中研磨。磨碎液转入离心管65℃温浴1h，4℃12000rpm离心10min，上清液转入离心管，加24∶1的氯仿-异戊醇250ul，室温8000rpm离心10min，上清液转入离心管，加-20℃预冷的异丙醇200ul，-20℃冷冻1h。4℃12000rpm离心5min，弃上清液，晾干，加70％乙醇200ul清洗，室温12000rpm离心3min，弃去乙醇。干燥后加pH8.0为50ulTE或双蒸水，放入-20℃冰箱中备用。DNA提取试剂及各种溶剂均为提取0.1g样本时的加入量，根据实际样本量按比例调整。

将试剂盒的柴胡鉴定体系、狭叶柴胡鉴定体系、柴胡阳性对照体系、狭叶柴胡阳性对照体系、柴胡阴性对照体系和狭叶柴胡阴性对照体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：

柴胡鉴定体系、柴胡阳性对照体系、柴胡阴性对照体系：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度58℃30s，72℃45s，32个循环，72℃延伸8min，4℃。狭叶柴胡鉴定体系、狭叶柴胡阳性对照体系、狭叶柴胡阴性对照体系：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度56℃30s，72℃45s，32个循环，72℃延伸8min，4℃。

(5)结果判定

反应产物使用1.5-1.8％琼脂糖凝胶，在水平电泳仪上电泳，60-70mV电泳45-60min，分子量100-1200bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察得出结果。1.5-1.8％琼脂糖凝胶，市场有售；水平电泳仪由北京市六一仪器厂制造的市售仪器；分子量100-1200bp的DNA Marker为标准分子量，市场有售；凝胶成像分析系统，市场有售。

参照附图，为试剂盒检测柴胡和狭叶柴胡结果示意图，柴胡和狭叶柴胡分别出现阳性结果。