用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测下述基因群表达的一种或多种试剂；所述基因群由下述基因中两个或两个以上基因组成：BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R和VEGF-D。本发明通过对多个基因表达水平的检测和鉴定，来评估临床治疗的疗效，从而判断哪些患者的预后较差，哪些患者不适合使用常规的治疗方案。本发明试剂盒检测方法简便、准确性强，且成本较低，易于被广大患者接受。

说明书

技术领域

   本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说是一种用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的检测试剂盒。

背景技术

食管癌是发生在胃肠道上端恶性程度最高的肿瘤之一。它的发生源于食管的上皮组织，大致可分为腺癌和鳞状细胞癌。目前认为食管癌的发生可能与吸烟、嗜酒、胃食管返流性疾病、感染、饮食习惯（如常吃辛辣食物）、嚼烟、年龄及其它未知因素有关。

虽然食管癌在全球范围内总体发生率较低，但在中国、冰岛、爱尔兰、日本、韩国和英国却是一种高发的恶性肿瘤。在美国食管癌发生率较低，2007年美国仅有15,000多新发病例，而在英国却有近8,000新发病例，这使得食管癌成为英国第九位高发的恶性肿瘤。而全世界每年约有500,000食管癌新发病例，尤其是在最近20年，食管癌的发生呈现出持续上升趋势。中国的食管癌发生率位居全世界第一，其次是某些非洲国家和日本。

食管癌是一种预后很差的恶性肿瘤，往往在患者初诊时肿瘤已经出现了转移，结果导致食管癌患者的疗效很差，五年生存率还不到5%。而在英国，食管癌患者的一年生存约为30%，五年生存率为8%。另一个导致食管癌预后差的原因是 存在严重的医疗问题使得患者不能接受手术或辅助治疗。因此而导致2007年英国有近7600名食管癌患者死亡，而全世界有超过400,000名患者死亡。

目前没有一种有效的手段对食管癌患者的预后进行检测，且可辅助医生选择合理的有针对性的治疗方案。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可准确、快速的用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提出一种用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的基因芯片。

本发明的第三目的在于提出一基因群的在制备食管癌治疗方案选择和/或预后评估检测试剂盒中的新用途。

本发明的发明思路为：发明人鉴定出一组基因，其表达水平的变化具有显著的临床意义。再经过后期大量的统计学分析最终鉴定出16个基因（包括两个管家基因）并制备得到检测试剂盒，对这些基因的表达水平进行综合分析后可以很好地对患者的预后进行评估。运用该试剂盒可以对手术后或组织活检患者进行快速的临床检测，从而帮助临床医师对患者的预后进行很好的评估。此外，该检测结果还可以鉴别出哪些患者不适合于常规的治疗方案，从而建议患者选用更加合适的个体化治疗方案。最后，这些分子标记物在将来可能作为潜在的药物作用靶点用于肿瘤的治疗。

为了实现上述发明目的，本发明的具体技术方案为：

一种用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测下述基因表达的试剂；

所述基因包括：

BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R及VEGF-D。

所述基因还包括管家基因：GAPDH及CK19。

所述试剂为对权利要求1所述基因进行免疫组化检测所用试剂。

所述试剂盒具体组成为：

（1）Hot-start Q-master mix (Abgene)；

（2）用于检测权利要求1所述基因的引物；

（3）FAM标记的通用探针。

所述引物序列如SEQ ID No.1至36所示。

用于检测上述各基因表达的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID No.1至36所示。

一种用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体和探针，所述探针与下述基因和/或其互补序列进行杂交；所述基因包括：

BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R和VEGF-D。

一基因群用于制备食管癌治疗方案选择和/或预后评估检测试剂盒的用途，所述基因群包括下述基因：

BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R及VEGF-D。

一基因群用于制备食管癌治疗方案选择和/或预后评估基因芯片的用途，所述基因群包括下述基因：

BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R及VEGF-D。

上述各基因的命名均来自于www.NCBI.LM.NIH.gov数据库或者文献中所公认的命名，均为本领域技术人员公知的。

本发明的有益效果：

本发明试剂盒通过对多个基因表达水平的检测和鉴定，来评估临床治疗的疗效，从而判断哪些患者的预后较差，哪些患者不适合使用常规的治疗方案，为医生选择治疗方案提供辅助参考。本发明试剂盒检测方法简便、准确性强，且成本较低，易于被广大患者接受。

附图说明

图1 为CTF8模式的分子标记物将食管癌患者分成两组。0为“预后好”组；1为“预后差”组，两组之间存在显著的统计学差异（p<0.00001）。

图2 为CTF8.12模式的分子标记物将食管癌患者分成三组。1为“预后好”组；2为“预后中”组；3为“预后差”组，三组之间存在显著的统计学差异（p<0.00001）。

图3为 淋巴结转移状态与食管癌预后的关系。0为淋巴结转移阴性；1为淋巴结转移阳性。

图4 为TNM分期与食管癌预后的关系。2为TNM分期StageII；3为TNM分期StageIII; 4为TNM分期StageIV。

图5 为肿瘤细胞分化状态与食管癌预后的关系。1为高分化；2为高中分化；3为中分化；4为低中分化；5为低分化。

图6 为肿瘤栓塞与食管癌预后的关系。0为出现肿瘤栓塞；1为无肿瘤栓塞。

图7 为病理类型与食管癌预后的关系。1为鳞状细胞癌；2为腺癌。

图8 为CTF8模式的分子标记物将淋巴结转移阴性的食管癌患者分为两组。0为“预后好”组；1为“预后差”组。

图9 为CTF8模式的分子标记物将淋巴结转移阳性的食管癌患者分为两组。0为“预后好”组；1为“预后差”组。

具体实施方式

实施例1 目的基因的获得

1、组织的收集、储存和记录

测试组织样本由发明人收集，食管癌患者手术切除后的废弃组织样本（包括正常组织、癌旁组织和肿瘤组织）并储存于-80℃冰箱备用。

2、食管癌组织的样本处理及cDNA库的构建

食管癌组织用低温恒冷冰冻切片机（Leica）进行冰冻组织切片，保存部分切片以备组织学分析，约30份切片的组织用于提取RNA（方法如下），在对RNA进行定量后，用等量RNA构建cDNA库。

3、组织RNA的提取以及cDNA的合成

将冰冻组织切成5-10μm厚度，其中一部分用于免疫组化分析(Jiang et al 2003a)。取20-30份切片的组织在冰预冷的RNA提取试剂（RNA isolation reagent）中用匀浆器进行匀浆后。RNA的浓度用紫外分光光度计进行检测(Jiang et al 2003a)。以3μg总RNA为模板，Oligo-dT为引物，用RT试剂盒（Promega）进行逆转录，并以?-actin引物作内参检测所合成cDNA的质量。PCR引物用Beacon Designer (California, USA)进行设计，在Invitrogen? Ltd和Sigma公司合成。实验所用分子生物学级的琼脂糖和DNA Ladder均购自Invitrogen，常规PCR试剂和定量PCR试剂分别购自AbGene和Biorad。

4、分子标记物的定量分析

对上述合成cDNA中待测基因表达水平的检测采用基于Amplifuor?原理改进后的实时定量PCR技术(Nazarenko et al 1997 and Jiang et al 2003a and 2003b)。首先采用Beacon Designer软件(version 2，Biosoft，Palo Alto，California，USA)设计PCR引物，其中一条引物（通常是反义引物）末端加上一个Z序列(5’ actgaacctgaccgtaca’3，序列与通用的Z探针序列互补)。用于?-actin检测的Taqman?试剂盒购自Perkin-Elmer?。

反应体系如下：Hot-start Q-master mix、特异上游引物10pmol，含有Z序列的下游引物1pmol、FAM标记的探针（Intergen Inc.）10pmol以及约50ngRNA。反应在IcyclerIQ? (Bio-Rad?, Hemel Hamstead, England, UK)上进行，具体反应条件如下：首先94℃变性12 min，然后进行50个热循环，包括94℃变性15s，55℃复性40s，72℃延伸20s (Jiang et al 2003b, 2003c)。反应中采用内标与待测样本同时进行扩增，从而确定样本中目的基因的转录水平。结果以两种方式来表示：一种是等量RNA的转录水平，另一种是目的基因与GAPDH基因或CK19基因表达水平的相对比值。

5、根据目的基因的表达方式进行分子标记物选择

首先用Minitab软件 (Minitab Inc., State College, PA16801, USA) 对样本的目的基因转录水平进行分析。

确定最终的入选基因：根据备选基因的表达水平及其是否能将长期患病组同其它组区分开来进行最后选择，筛选条件：收集患者的临床分期、病理类型、治疗方式以及生存时间等临床资料，如果通过备选基因的表达水平能够很好地将患者的这些临床资料进行区分，尤其是能够区分不同生存期患者，则确定为最终的入选基因。通过Excel（Microsoft Office 2007 version）软件进行分组和简单的统计学分析，再用SPSS（SPSS Inc.，Chicago，Illinois，US）软件对患者的生存期作进一步的统计学分析。

试剂盒的配制：在确定最终入选的基因标记物后，具体基因标记物见表1，根据这些标记物配制检测试剂盒。首先配制所有用于检测基因表达的试剂，然后将其自动点样到用于检测临床和细胞样本的96孔板中。试剂盒在实验室配制好后，储存于-20℃备用。

6、分子标记物的鉴定

在实验分析后，最终确定16个基因作为判断食管癌患者预后和疗效评估的分子标记物，见表1。BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R及VEGF-D，GAPDH管家基因对照和CK19管家基因对照。

表1作为食管癌遗传标记物的16个基因标记物

7、食管癌分子标记物与预后的关系的验证

（1）根据16个分子标记物评估患者预后的两组分类法及结果验证：

所选标记基因无论是表达上调还是表达下调，均视为异常表达，如果有多于8个基因表达异常则将患者划为“预后差”组，如果少于或等于8个基因表达异常则划为“预后好”组。

如图1所示，根据这些分子标记物表达水平可将患者分为“预后好组（图中以0表示）”和“预后差组（图中以1表示）”。预后好组的标记物模式命名为CTF8，即检测结果为CTF8模式，经验证患者平均生存期为39.3个月，与此相比，“预后差”标记物，经验证患者平均生存期仅为15.3个月（p<0.00001）。在随访中，78.3%的“预后好”组能够存活到随访结束，而“预后差”组仅有12.5%。将患者的生存时间、生存状态以及标记物的表达水平输入SPSS软件进行生存分析便可以进行分组同时可以得出平均生存期。

将患者的临床资料包括肿瘤栓塞的出现、淋巴结转移状况、肿瘤分期、TNM分期、分化状态、组织学类型以及CTF8输入SPSS后作COX多因素分析可以得出，CTF8是一个独立的预后因素（p<0.001)，同样肿瘤栓塞的出现也可以作为一个独立的预后因素(p=0.013)，而其它因素如淋巴结转移状况(p=0.227)、肿瘤分期（p=0.255）、TNM分期（p=0.313）、分化状态（p=0.162）以及组织学类型（p=0.78）则不能作为独立的预后因素。

（2）根据16个分子标记物评估患者预后的三组分类法及结果验证：

为了更加详细地区分患者的预后，我们采用CTF8.12模式，将患者分为三组，根据少于8个基因表达异常， 8～12个基因表达异常，多于12个基因表达异常将患者划为“预后好组、“预后中组”和“预后差组。

如图2所示，通过检测16个分子标记物将患者分为“预后好组（图中以1表示）”、“预后中组（图中以2表示）”和“预后差组（图中以3表示）”。根据Kaplan-Meier统计学分析显示，这三组患者的生存期存在显著的统计学差异（p<0.00001）。其中87%的“预后好组”患者可以存活到随访结束，其中位生存期为44.6个月，35%的“预后中组”患者存活到随访结束，中位生存期为20.1个月，而所有“预后差组”到随访结束均无存活，且中位生存期仅为6.5个月。

同样根据多因素分析显示，CTF8.12是一个独立的预后因素(p<0.00001)，将患者的临床资料包括肿瘤栓塞的出现、淋巴结转移状况、肿瘤分期、TNM分期、分化状态、组织学类型以及CTF8输入SPSS后作COX多因素分析可以得出。而其它所有临床和病理因素均不能作为独立的预后因素（淋巴结转移状态p=0.314，肿瘤栓塞p=0.074，肿瘤分期p=0.076，TNM分期p=0.231，分化状态p=0.403，组织类型p=0.891）。

8、临床和病理因素及其预后价值

根据统计学分析，预后的三组分类法CTF8.12模式是一个独立的预后因素(p<0.00001)，而现有技术的淋巴结转移状态（图3）、肿瘤分期（图4）、肿瘤细胞分化状态（图5）、肿瘤栓塞（图6）以及组织学类型（图7）等临床和病理因素均不能作为独立的预后因素来评估患者的预后。

9、本发明试剂盒的验证结果

我们将患者的淋巴结转移状态与16个分子标记物联合评估患者预后，如图8所示，淋巴结转移阴性患者中，85.6%的“预后好”组患者存活到随访结束，中位生存期为43.3个月，而所有淋巴结转移阴性的“预后差”组患者均无存活，中位生存期仅为4个月。70%淋巴结转移阳性的“预后好”组患者存活到随访结束，中位生存期为28.5个月。16.7%淋巴结转移阳性的“预后差”组患者存活到随访结束，中位生存期为18.4个月，如图9所示。

10、结论

本发明提供了一种评估食管癌患者预后的新的检测试剂盒，同时本发明还可以评估食管癌患者术后化疗失败的可能性。

对于食管癌患者的预后评估来说一直是一个难题。目前主要采用手术后的一些临床和病理学方法来评估预后，例如淋巴结转移状态、肿瘤分期、TNM分期等。本研究发现TNM分期和肿瘤栓塞的出现确实在评估预后方面具有一定价值，而肿瘤细胞分化状态、淋巴结转移状态、组织学类型等同样在评估预后方面也有一定价值，但这些因素大部分均无统计学意义或只有很小的统计学意义。而我们发现的16个分子标记物与这些因素相比具有明显的优势（如图4-8所示）。统计学分析显示，两组和三组分类法在预后评估方面均具有明显的统计学意义，且16个分子标记物可以作为独立的预后因素。

实施例2试剂盒的使用方法

1 、反应体系：反应在96 low-profile PCR plate中进行，针对每个标记基因需要做三个平行反应，另外还需检测两个管家基因作为内参。每个反应（每孔）的反应体系如下：Hot-start Q-master mix (8μl)，上游引物(10pmol/μl，1μl)，下游引物(1pmol/μl，1μl)，FAM标记的通用Z探针(10pmol/μl，1μl)，PCR级H₂O 1μl，待测样本cDNA或管家基因4μl。

其中待测样本cDNA的提取为本领域技术人元公知技术，提取后的cDNA用PCR级H₂O溶解后取4μl加入到反应体系中。

2 、反应条件：反应在Bio-Rad Q-PCR thermo cycler中进行，具体反应条件如下：94℃ 12分钟，然后进行50个循环，在每个循环中94℃ 15秒，55℃ 40秒72℃ 秒。样本扩增的同时，根据内参对转录本进行定量。结果用两种方式表示：一种是根据平均总RNA量得出的转录本水平，另一种是目的基因与GAPDH基因或CK19基因量的相对比值。

序列表

 

<110>  张力建

       姜文国

<120>  用于食管癌治疗方案选择和/或预后评估的检测试剂盒

<130> 

<160>  36   

 

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gcctctatgt ggagactgag                                     20

 

<210>  2

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

actgaacctg accgtacaga agaaagtgac cacgaaag                         38

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gcaaatgtgg aaaaactgat                                      20

 

<210>  4

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

actgaacctg accgtacatt aaatagcttc ccagagaga                            39

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

cctgccttgg tgtctgtg                                            18

 

<210>  6

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

actgaacctg accgtacacc tgtgtgcatg tgtctttc                             38

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

atggatctga agaaattgga                                  20

 

<210>  8

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

ctgaacctga ccgtacaaga caatttttgc cactcat                              37

 

<210>  9

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

ttcctggacc acaacatc                                           18

 

<210>  10

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

actgaacctg accgtacacc gagtcgtaca ctttgc                               36

 

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

aaatgttgtc acaccaacaa                           20

 

<210>  12

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

actgaacctg accgtacaag ctgttgacat cagagaca                             38

<210>  13

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

ctgctgctgc tgctcttc                                       18

 

<210>  14

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

actgaacctg accgtacaca ttctttcccc atactgc                              37

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

actgagtacc actggaccac                                 20

 

<210>  16

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

actgaacctg accgtacaag taccccgacg actcag                           36

 

<210>  17

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

cattcgagac tacaacagca                                        20

 

<210>  18

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

actgaacctg accgtacatc cagttgtaga agctgacc                             38

 

<210>  19

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  19

agtacaacaa tgagccttca a                                 21

 

<210>  20

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  20

actgaacctg accgtacaca tcaaatgagg gcaatc                      36

 

<210>  21

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  21

ggagatgcaa aaccgatac                                    19

<210>  22

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  22

actgaacctg accgtacaca caggtgttct gcctgta                              37

 

<210>  23

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  23

tattcgaatg ggaattcaac                                           20

 

<210>  24

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  24

actgaacctg accgtacagt cgtcagagtc gctgtact                             38

 

<210>  25

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  25

gatgtcctcg aagtttaccc                                20

 

<210>  26

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  26

actgaacctg accgtacaca gtcacgagga ggacac                36

 

<210>  27

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  27

tggattcaca gaacatgaaa                                         20

 

<210>  28

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  28

actgaacctg accgtacaga tgggactcca actcataa                             38

 

<210>  29

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  29

agatgactga caggttcag                                            19

 

<210>  30

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  30

actgaacctg accgtacaga atcgatctca ctttggag                             38

<210>  31

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  31

ggtgcagggc tccagtaatg                                   20

 

<210>  32

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  32

actgaacctg accgtacatg ttcagatcgt tccaatgtgg                           40

 

<210>  33

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  33

aaggtcatcc atgacaactt                                           20

 

<210>  34

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  34

actgaacctg accgtacagc catccacagt cttctg                               36

 

<210>  35

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  35

caggtccgag gttactgac                                     19

 

<210>  36

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  36

actgaacctg accgtacaca ctttctgcca gtgtgtcttc                           40