血纤维蛋白D-二聚体片段特异性的、来源于DD-3B6/22的人源化抗体

摘要

本发明涉及人源化形式的小鼠单克隆抗体DD-3B6/22。该抗体对D-二聚体、交联血纤维蛋白多聚体的降解片段具有特异性。本发明还包括这些抗体在体内检测血块的应用。

说明书

本分案申请是基于申请号为02812875.3，申请日为2002年06月26日，发明名称为“血纤维蛋白D-二聚体片段特异性的、来源于DD-3B6/22的人源化抗体”的中国专利申请的分案申请。 

发明领域

本发明一般地涉及来源于动物或禽类物种或品系的载体分子，并且其在暴露于其他动物或禽类生物物种或品系的免疫系统时基本上是非免疫原性的。更特别地，本发明提供了脱敏的免疫交互式分子，并且甚至更特别地提供了用于诊断和治疗的脱敏抗体。

发明背景

本说明书参考的出版物的书目详细资料被收集在本说明书的末尾。

本说明书对任何现有技术的参考不是，也不应当被认为，是该现有技术在任何国家中都构成部分公知常识的认可或任何形式的暗示。

纤维蛋白原是一种大的蛋白分子，通常以溶解状态在血浆中循环。在凝血酶存在时，纤维蛋白原分子形成称之为血纤维蛋白的长线状聚合体，这是血块的主要成分。

用纤溶酶消化后，纤维蛋白原形成被命名为A-E的片段。片段D和E是占主导地位的片段，并且D大约为E的两倍。纤维蛋白原具有 三结节(trinodular)形状，其中片段E是中心组分，而片段D是末端组分。

血纤维蛋白和纤维蛋白原的纤溶酶消化产物可利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来彼此区分。血纤维蛋白和因子XIIIa的交联形成片段D的二聚体并称之为D-二聚体。因子XIIIa是一种在血纤维蛋白邻近单体之间引入共价键的酶(Budzynski等，Blood 54(4)：794-804，1979)。因子XIIIa是通过凝血酶催化切除血浆和血小板前体中的肽而被激活的。D-二聚体是大约为189,000道尔顿的分子，其在本质上是由来源于通过γ链上的纤维蛋白原残余物间的交联键共价结合的不同血纤维蛋白分子的两个片段D基元组成的。纤维蛋白原本身由6条链组成，具有两拷贝的α、β和γ链。

另一个复合体(DD)E通过纤溶酶降解交联的人血纤维蛋白而形成，并且包括两个D片段和片段E的组合。

其它的交联衍生物由Graeff和Halfer描述(Graeff和Halfer，″Detection and Relevance of Cross-linked Fibrin Derivatives inBlood″，Seminars in Thrombosis and Hemostatis 8(1)，1982)，并包括高分子量的交联衍生物如DY、YY、XD、XY、DXD和YXD。

正常的止血或血液凝固包括维持血管内成分的液态或悬浮状态，而同时使得固相血液组分在血管损伤区域进行局部沉积。在健康状态下，人们假定，但从未经实验方法证实，在低级血管内血纤维蛋白的沉积与纤维蛋白溶解或细胞噬菌作用对它的清除之间存在着平衡。

早期临床观察显示一些重病患者出现大出血和大块淤血的征兆，并且具有延长的凝血时间和血小板减少症。死后，在某些病例中，在微脉管系统中证明有血纤维蛋白血栓症。这些血栓症的扩散性质引起 弥散性血管内凝血(DIC)，因此也被称作消耗性凝血病。因此，凝血酶与疾病如深静脉血栓症(DVT)和肺栓塞(PE)有关。

疾病例如DIC、DVT和PE涉及凝血系统的激活，导致血小板消耗、血栓产生、血纤维蛋白沉积以及继发的纤维蛋白溶解。该过程的纯生物学效应反映了血纤维蛋白沉积和血纤维蛋白清除之间的平衡。所产生的临床表现为当凝血因子的损耗占主导地位时可能是大出血，或者由于在其它条件下血管闭塞的影响，为局部缺血性组织损伤。

DIC、IDVT和PE已被报道是多种紊乱的继发现象，特别是那些伴有并发的休克、酸毒症和血氧不足症的疾病。众所公认的临床联系有败血症、主要外伤、恶性瘤以及产科失调。最近，DVT被公认为是在延长的空中旅游或其它延长的不运动期间出现的特殊问题。在任何情况下，凝血程序的激活导致凝血蛋白和血小板的消耗，造成血纤维蛋白在微循环中的沉积。

理想地，疾病如DIC、DVT和PE的确诊需要扩散性血纤维蛋白沉积的直接证据。获取多种直接的活组织检查证据以区分局部性和全身性血纤维蛋白形成的实际困难，导致了取代为诊断终点的间接测试的发展。然而，这些测试对血管内血纤维蛋白沉积综合征不具有特异性。它们的特异性通过其它酶的作用被进一步降低，这些酶虽然不能够将纤维蛋白原转换为血纤维蛋白，但可以象凝血酶一样导致血栓症中所涉及的其它凝血因子发生类似的改变。所有这些间接测试都基于凝血酶是唯一(蛇毒液除外)能够在哺乳动物中将纤维蛋白原转换为血纤维蛋白的酶的原理。

而且，除了检测循环的可溶性血纤维蛋白单体复合体存在的副凝固实验之外，没有一种更特异的凝血酶特异性测试可容易地得到、或可用于诊断这些血纤维蛋白相关疾病的直接临床应用。这些测试包括 FPA(血纤维蛋白肽A)测试，其中FPA通过特异性的RIA操作检测，血纤维蛋白单体试验，纤维蛋白原凝胶排阻层析以及FPB(血纤维蛋白肽B)或凝血酶可增加的FPB测试。

生化非特异性的凝血酶作用测试包括凝血素时间(PT)、促凝血酶原激酶时间(A PTT)以及凝血酶凝结时间(TCT)测试。尽管经常可用于实践，必须认识到从这些测试获得的信息在本质上是非特异性的，起着不考虑病因学而测量凝结因子损耗的作用。

凝血因子试验也被发现是相对非特异性的，并且这包括辅因子V和VIII的分析以及纤维蛋白原水平的测试。

血纤维蛋白-纤维蛋白原降解产物的测试迄今还没有被证明对于纤溶酶对血纤维蛋白的作用是特异性的，并且当凝血酶没有在先对纤维蛋白原分子作用而出现纤维蛋白原溶解时可产生阳性结果。这些测试包括片断D和E的测试。

对凝血酶介导的血小板相互作用或释放进行测试发现在本质上是非特异性的。这包括血小板计数、血小板残存以及血小板释放测试。

还尝试使用了与鉴定凝结因子有关的放射性标记的纤维蛋白原，但发现费时并且难于操作。

因此，诊断试验的功效在于其能够预示疾病存在与否。对于诊断试验功效确定的研究，存在众所公认的基本设计原理，其使四项指数灵敏度、特异性、阳性预测值及阴性预测值能够得以确定。第一个必要条件是采用适当的诊断标准。理想地，该标准应当稍微超过临床精确度，并且应当对疾病实体尽可能是特异性的。特别与DVT和PE有关的固有难点是许多常规可用的实验室试验也缺乏诊断的特异性。低的 血小板计数支持这些疾病的可能性，但也可能作为感染继发的孤立发现而发生。相似的局限性适用于许多凝血试验。低纤维蛋白原血不能区分因纤溶酶或者弹性蛋白酶作用而产生的原发性纤维蛋白溶解和在凝血酶介导纤维蛋白原转换为血纤维蛋白之后继发的纤维蛋白溶解。或者，可以利用凝血酶作用的敏感性试验，但其临床应用具有明显的缺陷。一个例子是FPA试验，尽管其对凝血酶作用是特异性的，但异常灵敏，并可在非并发的静脉血栓症中检测到局部化的血管内凝血固而产生阳性结果。提高的FPA水平的临床重要性，即使伴有阳性的副凝固试验，仍有争议，特别是如果血小板计数、全局凝结试验及纤维蛋白原水平是正常的话。

鉴于这些理由，灵敏度、特异性以及预测值不能够以标准的方式予以确定。这些紊乱的临床表现是复杂和不可预知的。因此，可用诊断试验的应用，最好结合不同的血管内凝血临床综合病症加以考虑。

鼠单克隆抗体3B6被公开(美国专利No.4,758,524)。该抗体是D-二聚体特异性的，并代表了第一个凝结特异性的抗体。然而，利用这一抗体作为人类全身诊断制剂的能力由于该分子的免疫原性而受到限制。因此，需要修饰3B6抗体以降低其在非鼠动物和人类中的免疫原性。

发明概述

在整个说明书中，除非上下文另有要求，措辞“包括(comprise)”，或者变化形式例如″comprises″或″comprising″，将被理解为意味着包含规定的元件或整体或者元件或整体组，而不是排除任何其它的元件或整体或者元件或整体组。

冠词“一个(a)”或“一种(an)”在本文中用于指一个或多于一 个(也就是至少一个)合乎语法目的的物质。作为例子，“一个元件”是指一个元件或不止一个元件。

在本发明的先导工作中，利用脱敏技术降低3B6抗体的免疫原性。这使得用于人类的血栓症成像诊断方法得以发展。此外，脱敏形式的3B6抗体允许其作为凝块靶向制剂，将凝块溶解剂或者凝块成长预防剂例如抗凝固剂递送到凝块部位。因此，本发明的脱敏分子起着将诊断和治疗制剂递送到靶部位例如凝块的载体的作用。这些分子还可以具有它们自己的诊断和治疗特征。脱敏形式3B6抗体的发展可应用于一系列疾病例如DVT和PE中。此外，脱敏形式的3B6抗体可与计算机支持的断层摄影术核医学或平面成像技术例如CT、MRI或超声波联合使用。

因此，本发明提供了一种载体分子，一般地是一种免疫交互式分子的形式，而特别地是相对于亲本分子被嵌合和/或突变的单克隆抗体，从而它在靶宿主例如人类体内表现出低的免疫原性。嵌合或突变的过程在这里被称之为脱敏。在一个特别优选的实施方案中，免疫交互式分子例如单克隆抗体被人源化，已降低其在人体中的免疫原性。脱敏可以不同的方法进行，但在一个优选实施方案中，单克隆抗体可变(v)区的一个或多个氨基酸被突变(例如取代)以降低MHC II对来源于该区的肽的识别。换句话说，脱敏过程目的在于降低T-细胞表位介导的针对该抗体的免疫反应。本发明最优选的抗体是对D-二聚体表现出特异性的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6。脱敏形式3B6的产生允许发展主要用于人体内血块的全身凝块靶向制剂。这允许其被作为成像制剂以及作为将凝块溶解剂或者凝块成长预防剂例如抗凝剂递送到凝块部位的载体。

因此，该脱敏抗体可以单独或作为一系列诊断和/或治疗制剂的载体。

因此，本发明的一个方面提供了免疫交互式分子的变体，它包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分，并且该部分来源于可得自动物或禽类生物的免疫交互式分子，其中的变体在来自相同或不同种类的其它动物或禽类生物中表现出低的免疫原性。

优选地，免疫交互式分子是单克隆抗体变体，包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分。

更优选地，单克隆抗体是对人源D-二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体，其中的鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的。

优选地，抗体是对被单克隆抗体3B6所识别的表位具有特异性的脱敏抗体，并且包括来源于3B6单克隆抗体可变结构域的至少一个互补性决定区(CDRs)，而且该脱敏抗体分子的其余的免疫球蛋白源部分是来源于其中该抗体待脱敏的宿主的免疫球蛋白或其类似物。

因此，本发明提供了对被3B6单克隆抗体所识别的表位具有特异性的脱敏抗体分子，其中所述脱敏抗体可变结构域的至少一个互补性决定区(CDRs)是来源于3B6单克隆抗体，其中所述3B6抗体可变区的一个或多个氨基酸被突变，以降低MHC II类分子对来源于该区的肽的识别。

本发明进一步提供了用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，在该3B6抗体的v区包括被设计成用以消除或减少v区的与MHC II类分子结合的肽片段的一个或多个氨基酸突变。

脱敏的免疫交互式分子可单独使用，或者作为将诊断和/或治疗制剂递送到靶部位例如血块的载体。

因此，本发明考虑了在人类患者体中检测血块的方法，通过向患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中，然后对患者进行报道分子检测方法以鉴定该抗体在凝块中的位置。

在一个选择的实施方案中，未标记的脱敏形式的3B6，而标记了具有抗-免疫球蛋白特异性的第二抗体。该抗体与第一个提及的抗体形成标记复合体。

作为载体，脱敏载体可将任何凝块结合分子连同其它诊断或治疗制剂递送到凝块部位。

因此，本发明考虑对D-二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性的脱敏鼠单克隆抗体在制造凝块成像制剂中的应用。

而本发明的另一个方面考虑促进人体内血块溶解或清除的方法，所述方法包括向所述人施用凝块溶解或凝块生长预防有效量的对人源D-二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的。其中所述单克隆抗体进一步包括融合的、结合的或以其它方式连接在其上的凝块溶解或凝块生长预防制剂。

本发明还有另一个方面涉及对人源D-二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体在制造用 于溶解人体内的血块的药剂中的用途，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的，并且所述抗体进-步包括融合的、结合的或以其它方式联接在其上的凝块溶解或凝块生长预防制剂。

优选的分子是用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，并且包括含有选自于SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：9/SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：12以及SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链和轻链v-结构域的组合，或者由与上文列举的每对中的一个或两个核苷酸序列至少有70％相似性的核苷酸序列、或由在低严紧度条件下能够与上文列举的每对中的一个或两个核苷酸序列或者其互补形式杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的组合。

脱敏备用的3B6抗体变体优选包括含有选自SEQ ID NO：1/SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：2/SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3/SEQID NO：5、SEQID NO：3/SEQID NO：6以及SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链和轻链v-结构域的组合，或者与上文列举的每对中的一个或两个氨基酸序列至少有70％相似性的氨基酸序列的组合。

另一个优选的3B6变体包括选自VHv5/VKv1、VHv6/VKv1、VHv7/VKv1、VHv5/VKv7、VHv6/VKv7、VHv6/VKv4、VHv7/VKv4、VHv7/VKv7以及VHv5/VKv4的重链和轻链v-结构域的组合。

本发明的另一方面考虑了在人类患者体内检测血块的方法，通过向患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6或其 抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中，然后对患者进行计算机辅助的断层摄影术核医学扫描来观测凝块。

而本发明的另一个方面考虑了在人类患者体中检测血块的方法，通过向患者引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中散布，然后对患者进行平面凝块成像术来观测凝块。

本发明的脱敏免疫交互式分子还可用于将抗凝固剂锚定在特定的部位。因此，这方面提供了将诊断或治疗制剂组织特异性地锚定于例如凝块上。此外，免疫交互式分子可被设计为具有多重特异性。举例来说，设计了包括一个凝块特异性和另一个凝块部位(例如细胞受体)特异性的双特异性脱敏抗体。这使得抗体保留在凝块的部位上。

在一个选择方案中，设计了多步骤治疗法，其中，举例来说，向凝块靶向施用与抗凝固剂配位的脱敏3B6或其它交互式分子并形成复合体，然后给第一抗体和/或抗凝固剂定向施用第二抗体以促进或监测第一复合体。

脱敏的免疫交互式分子还可以被用于确定凝块消散或凝块消失的动力学。这可用于更早地预测凝块的出现或消失，因此，有助于确定何时开始第二治疗例如抗凝固剂治疗的动力学。

本发明进一步提供了包括脱敏的免疫交互式分子以及成像和/或治疗性标记物。成像标记物包括MRI、超声波以及CT标记物。治疗制剂标记物包括放射性同位素、抗凝结制剂以及细胞因子。

表1提供了整个主题说明书中所用的序列标识符概况。

表1序列标识符概况

  序列识别号   说明   1   3B6DIVHv5的氨基酸   2   3B6DIVHv6的氨基酸   3   3B6DIVHv7的氨基酸   4   3B6DIVKv1的氨基酸   5   3B6DIVKv4的氨基酸   6   氨基酸3B6DIVKv7   7   编码3B6DIVHv5的核苷酸序列   8   编码3B6DIVHv6的核苷酸序列   9   编码3B6DIVHv7的核苷酸序列   10   编码3B6DIVKv1的核苷酸序列   11   编码3B6DIVKv4的核苷酸序列   12   编码3B6DIVKv7的核苷酸序列

附图的简要说明

图1是显示(A)3B6单克隆抗体的图解图；(B)3B6结合于血块的照片(×4,2000放大倍数)。

图2图解描绘了用核标记物(^99mTc)标记的3B6抗体。

图3A图表描绘显示了给人类循环系统施用3B6 ^99mTc。

图3B照片描绘显示了当来自^99mTc的放射线集中在凝块部位时而对前腿中的血块进行的观测。

图4A、4B和4C绘画描绘显示了利用脱敏的3B6单克隆抗体进行D-二聚体捕获试验。

优选实施方案的详细描述

本发明部分建立在能够提供一种来源于一种动物或禽类生物的而在相同或不同物种的另一种动物或禽类生物中基本上呈非免疫原性的免疫交互式分子的生物化学技术的应用上。该生物化学方法被称之为“脱敏”。本文所指的“脱敏”包括诸如互补决定性区域(CDR)移植、有关免疫交互式分子构架区的“重塑”、以及可变(v)区的突变，都旨在降低免疫交互式分子在特定宿主中的免疫原性。在本案中，优选的免疫交互式分子是抗体例如多克隆或单克隆抗体。在一个最优选的实施方案中，免疫交互分子是单克隆抗体，来源于一种动物或禽类生物，并且在相同或不同物种的另一种动物或禽类生物中表现出低的免疫原性。

本发明一般地涉及来源于一种动物或禽类物种或品系的载体分子，并且当其暴露于其它动物或禽类物种或品系的免疫系统时基本上是非免疫原性的。载体分子可以本身表现出有益的诊断或治疗特征，或者可以被用于将活性化合物(例如抗凝血制剂、放射性同位素)递送到靶部位。一般地，载体分子是免疫交互式分子。更特别地，本发明涉及包括非鼠哺乳动物化形式的、基本上不能够在非鼠动物特别是人体中诱导针对其本身的免疫应答的脱敏鼠源单克隆抗体。更加特别地，本发明提供了脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6，从而在对人类施用后，其不能够、或者表现出降低的、诱导针对其本身或其衍生物的实质性免疫应答的能力。脱敏的免疫交互式分子特别是本发明的抗体具有广泛有益的诊断和治疗应用，例如检测人类循环系统中的血块，以及作为凝块靶向制剂递送凝块溶解制剂或凝块生长预防制剂如抗凝固剂。

包括人源化形式的脱敏主题单克隆抗体特别被用于诊断和治疗疾病如深静脉血栓症和肺栓塞。本发明的分子特别被用作将活性化合物 递送到靶部位的制剂。这样的活性化合物包括凝块结合分子。

从而，本发明一方面提供了免疫交互式分子变体，所述变体包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分，并且该部分得自从一种动物或禽类生物的免疫交互式分子，其中所述变体在相同或不同物种的其它动物或禽类中表现出降低的免疫原性。

所上所述，优选形式的免疫交互式分子是抗体，并且特别是单克隆抗体。

从而，本发明另一方面提供了单克隆抗体变体，包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分，并且该部分得自于从第一动物或禽类生物的单克隆抗体，其中所述变体在相同或不同物种的第二动物或禽类中表现出降低的免疫原性。

在一个特别优选的实施方案中，单克隆抗体获自鼠科动物，并且相对于另一个鼠科动物或不同物种的动物如人脱敏化。鼠科动物中的鼠单克隆抗体针对来源于血纤维蛋白原的非变性D-二聚体被募集。后者分子通过纤溶酶被消化，并产生一系列命名为片段A到E的片段。血纤维蛋白和因子XIIIa的交联形成片段D的二聚体称之为D-二聚体。该D-二聚体是大约为189,000道尔顿的分子，并且包含通过γ链上的纤维蛋白原残余物间的交联键结合的两个片段D基元。

因此，本发明的另一个方面涉及鼠源单克隆抗体变体，对人源D-二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的。

关于“基本上是非免疫原性”包括与亲本抗体，也就是暴露于脱 敏步骤之前的抗体相比，降低的免疫原性。术语“免疫原性”包括激起、诱发、或以其他方式促进宿主动物的体液和/或T-细胞介导的应答的能力。特别便利的免疫原性标准包括来源于抗体可变(v)区的氨基酸序列与MHC II类分子相互作用、从而刺激或促进T-细胞介导的应答，包括T-细胞辅助的体液应答的能力。本发明考虑的免疫交互式分子特别是单克隆抗体包括提及的凝块靶向制剂。

本文所提及的优选的鼠源单克隆抗体是单克隆抗体3B6，其在美国专利No.4,758,524中被描述。

因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了脱敏形式的单克隆抗体3B6，其中所述脱敏3B6在人体中基本上是非免疫原性的。

而且，上下文中的“基本上是非免疫原性”是指脱敏3B6单克隆抗体在人体中诱导或促进针对其本身的免疫应答(在最初或随后给药后)的能力与脱敏前的鼠单克隆抗体3B6相比降低了。

虽然优选的发明特别涉及与人类有关的脱敏形式的3B6，本发明扩展至对其它动物或禽类物种脱敏的、对D-二聚体和/或其它交联血纤维蛋白衍生物具有相似特异性的这种抗体或另一种抗体。

本文涉及的其它交联血纤维蛋白衍生物包括，举例来说，除了D-二聚体之外，还有D-二聚体衍生物以及包含D和E片段的复合体。后者包括(DD)E，并且是通过纤溶酶降解交联的人血纤维蛋白形成的，并且包含两个D片段和E片段的组合。其它的交联衍生物包括DY、YY、XD、XY、DXD和YXD，其中字母表示被纤溶酶降解后形成的纤维蛋白原片段，其中X和Y不同，并且选自片段A到C以及E。优选地，本主题发明的脱敏抗体是来源于对D-二聚体及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性的抗体，但其不与纤维蛋白原、包括片段D和片段E在 内的纤维蛋白原降解产物发生交叉反应。优选地，产生抗体的克隆是用液相D-二聚体分子而不是固定化的D-二聚体挑选的，虽然通过任何一种形式的D-二聚体筛选的克隆都被考虑在本发明之内。

优选地，脱敏抗体对它的靶抗原表现出亲和力，这与鼠单克隆抗体3B6表现出的亲和力相似。

与抗原结合分子上的个别抗原结合部位和该抗原上其相应部位之间的相互作用有关的“亲和力”包括这种相互作用的强度。

“抗体”是指能够与抗原结合、相互作用或以其它方式联合的免疫球蛋白家族的蛋白。因此，抗体是抗原结合的分子。“抗体”是免疫交互式分子的一个例子，并且包括多克隆或单克隆抗体。本发明优选的免疫交互式分子为单克隆抗体。抗体包括其部分，包括Fab部分和抗原结合决定簇。

术语“抗原”在本文是用来最广义地指能够在免疫应答中起反应和/或诱导免疫应答的物质。所指“抗原”包括抗原决定簇或表位。在该上下文中的抗原视为免疫交互式分子，并且更特别地，视为单克隆抗体。

任何对靶抗原具有结合亲和力的分子被称之为“抗原结合分子”。应当理解该术语延及免疫球蛋白(例如多克隆或单克隆抗体)、免疫球蛋白片段以及由免疫球蛋白衍生的表现出抗原结合活性的蛋白骨架。术语“抗体”和“抗原结合分子”包括这些分子的脱敏形式。

而针对其可定向发生特定的免疫应答的部分抗原分子被称之为“抗原决定簇”或“表位”，并且包括半抗原。典型地，在动物体中，抗原同时呈递几个甚至许多抗原决定簇。“半抗原”是能够与抗体特异 性结合的物质，但是不能或者仅能较差地诱导免疫应答，除非结合到载体上。半抗原典型地包括单个的抗原决定簇或表位。

如上所述，尽管本发明优选的抗体是用于人类的脱敏形式的鼠单克隆抗体，本发明延及任何来源的和脱敏用于任何宿主的抗体。动物和禽类来源以及宿主的实例包括人类、灵长类、家畜类动物(例如绵羊、奶牛、马、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、家兔、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如狗、猫)、家禽类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡)以及猎禽(例如雉)。脱敏抗体或其部分还可以在非动物组织例如植物中产生。植物特别被用作单链抗体的来源。

本发明的另一方面考虑生产对人D-二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物的抗原决定簇具有特异性的脱敏单克隆抗体的方法，所述方法包括：

(i)获取人交联血纤维蛋白衍生物或者含有相同成分的提取物；

(i i)在非人动物中产生对所述交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、但不与片段D发生交叉反应的抗体；以及

(iii)对所述非人源抗体进行脱敏。

交联血纤维蛋白衍生物可源自于任何合适的抗原提取，包括纤溶酶介导的血纤维蛋白血凝块降解，或者通过凝血酶、因子XIIIa以及纤溶酶对纤维蛋白原同时作用，使有瞬时的血凝块形成和随后的血凝块溶解。在后一种方法中，纤维蛋白原通过凝血酶和因子XIIIa的作用被转化为血纤维蛋白，并随后用纤溶酶消化。当然，应当理解血纤维蛋白衍生物或含有相同成分的提取物可获自于非人动物来源。抗原来源适宜地来自于生物样品。

可从动物中提取、不经处理、处理、稀释或浓缩的样品被包括在术语“生物样品”中。

上述获取粗制抗原片段的方法代表体外方法。合适的体内方法包括获取动物包括人的血清或者含有交联血纤维蛋白衍生物的其它体液，并使该体液经受PAGE步骤，其中基本上纯的交联血纤维蛋白衍生物被分离出来。

或者，交联血纤维蛋白衍生物可从获自患有严重血栓紊乱的患者的血清中纯化，以Willner等，Biochemistry 21：2687-2692，1982所描述的利用凝胶过滤联合离子交换层析的技术为基础。

抗原(也就是D-二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物)可通过任何合适的方法从生物样品中分离。举例来说，分离可利用任何一种或多种抗原表面电荷性质、大小、密度、生物活性及其对另一个实体的亲和力(例如它结合或以其它方式联合的另一个蛋白或化学化合物)。因而，举例来说，抗原从生物液中的分离可通过任何一种或多种超速离心、离子交换层析(例如阴离子交换层析、阳离子交换层析)、电泳(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦)、分子大小分离(例如凝胶过滤、超滤)以及亲和力介导的分离(例如免疫亲和分离，包括但不限于，磁珠分离例如Dynabea^TM分离、免疫层析、免疫沉淀)。所使用的分离技术的挑选可以取决于特定抗原的生物活性或物理性质。

优选地，从生物液中分离抗原保留了呈递在抗原表面的构象表位，从而适当地避免了导致抗原变性的技术的使用。本领域的熟练技术人员会意识到维持或者尽可能接近地模仿抗原特有的生理条件(例如它们所获自的生物液)的重要性，以确保与动物接触的抗原上的抗原决定簇或活性部位与天然抗原的是结构上完全相同的。这确保在免疫动 物中能识别天然抗原的合适抗体的产生。在这种类型的一个优选实施方案中，抗原用亲和分离、凝胶过滤及超滤的任何一种或多种从生物液中分离。

免疫及随后单克隆抗体的产生可利用例如 和Milstein(Nature 256：495-499，1975； 和Milstein，Eur.J；Immunol.6(7)：511-519，1976)、Coligan等(Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons，Inc.，1991-1997)或Toyama等(″Monoclonal Antibody，Experiment Manual″，published byKodansha Scientific，1987)所描述的标准方法进行。基本上，动物用含有抗原的生物液或其片段通过标准方法免疫，以产生抗体生产细胞，特别是抗体生产体细胞(例如B淋巴细胞)。然后这些细胞可从免疫动物中取出用于无限增殖。抗原可能需要首先与较大的分子结合。后者是典型的高分子量的任何物质，其上天然地或人工地交联有非免疫原性或弱免疫原性的物质(例如半抗原)以增强它的免疫原性。

抗体生产细胞的无限增殖可利用本领域众所周知的方法进行。举例来说，无限增殖可通过利用Epstein-Bart病毒(EBV)转化的方法(Kozbor等，Methods in Enzymology 121：140，1986)实现。在一个优选的实施方案中，抗体生产细胞利用细胞融合方法无限增殖(被记载在Coligan等，1991-1997中，同前)，这在单克隆抗体的生产中被广泛使用。在这种方法中，具有产生抗体潜能的抗体生产体细胞，特别是B细胞，与骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可以源自于致敏动物的淋巴结、脾和外周血，优选地是啮齿类动物例如小鼠和大鼠。在本发明的例示性实施方案中，利用了小鼠脾细胞。不过，可以利用大鼠、家兔、绵羊或山羊细胞，或者其它动物物种的细胞替代。

已经从淋巴细胞肿瘤建立了用于杂交瘤生产融合方法的特殊化骨髓瘤细胞系( 和Milstein，1976，同前；Shulman等，Nature 276.-269-270，1978；Volk等，J ViroL 42(1)：220-227，1982)。这些细胞系至少是由于三个原因而被建立。第一个是易化融合杂交瘤从未融合而相似地无限自我增生的骨髓瘤细胞中的挑选。通常，这通过利用具有酶缺陷、使其不能够在支持杂交瘤生长的选择培养基中生长的骨髓瘤来完成。第二个原因起因于淋巴细胞肿瘤细胞产生其自身抗体的固有能力。为消除杂交瘤产生肿瘤细胞抗体，利用了不能够产生内源性轻链胡重链免疫球蛋白链的骨髓瘤细胞系。选择这些细胞系的第三个原因在于它们用于融合的适当性和有效性。

许多骨髓瘤细胞系可用于产生融合细胞杂合子，包括，例如P3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-Ag14以及S194/5.XXO.Bu.1。P3X63-Ag8和NS-1细胞系已由 和Milstein(1976，同前)描述。Shulman等(1978，同前)建立了Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。S194/5.XXO.Bu.1系由Trowbridge(J Exp.Med.148(1)：313-323，1978)报道。

产生抗体生产脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞杂合子的方法通常包括将体细胞和骨髓瘤细胞分别按10∶1的比例(尽管该比例从大约20∶1到大约1∶1变化)，在存在促进细胞膜融合的一种制剂或数种制剂(化学、病毒或电)的条件下混合。融合方法已有描述( 和Milstein，1975，同前； 和Milstein，1976，同前；Gefter等，Somatic Cell Genet.3：231-236，1977；Volk等，1982，同前)。那些研究者所用的融合促进制剂为仙台病毒和聚乙二醇(PEG)。

由于融合操作以极低的频率产生有活力的杂合子(例如，当脾细胞用作为体细胞来源时，大概每1×10⁵个脾细胞才能获得一个杂合子)，优选具有一种方法将融合细胞杂合子从其余的未融合细胞、特别是未融合的骨髓瘤细胞中挑选出来。在其它所产生的融合的细胞杂合子中检测到所需的抗体生产杂交瘤的方法同样是必要的。一般地，融合的 细胞杂合子的挑选是通过在支持杂交瘤生长但是防止未融合的骨髓瘤细胞生长的培养基中培养细胞来实现，其通常会继续无限分裂。融合中所用的体细胞在体外培养中不能维持长期的生存力，所以不构成问题。在本发明的实施例中，利用了骨髓瘤细胞缺乏的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT-阴性)。这些细胞的挑选在黄嘌呤/氨基喋呤/胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基中进行，在该培养基中融合的细胞杂合子由于脾细胞的HPRT-阳性基因型而存活。

利用具有不同遗传缺陷(药物敏感性等)、能够在支持基因型感受态杂合子生长的培养基中被挑选出来的骨髓瘤细胞也是可能的。

需要数周选择性地培养融合细胞杂合子。在该阶段的早期，有必要鉴定那些产生所需抗体的杂合子，从而它们可以被随后克隆并增殖。一般而言，10％左右的获得的杂合子产生所需抗体，虽然从大约1到大约30％的范围是不常见的。抗体生产杂合子的检测可通过许多标准试验方法中的任何一种来实现，包括酶联免疫试验以及放射免疫试验技术，例如如Kennet等((编辑)Monoclonal Antibodies andHybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，pp.376-384，Plenum Press，New York，1980)中所描述的。在一个特别优选的实施方案中，利用液相D-二聚体进行酶联免疫吸附试验(ELISA)来挑选抗体-产生克隆。

所需融合细胞杂合子一经挑选并克隆进个体抗体生产细胞系中，每种细胞系就可以两种标准方法中的任何一种加以增殖。杂交瘤细胞悬液可被注射到组织相容性动物体中。被注射动物随之产生分泌由该融合的细胞杂合子所产生的特定单克隆抗体的肿瘤。该动物的体液，例如血清或腹水，可被穿刺放液以提供高浓度的单克隆抗体。或者，个别细胞系可在实验室培养容器中进行体外增殖。含有高浓度单个特定单克隆抗体的培养基可通过移注、过滤或离心收集，然后纯化。

细胞系通过任何合适的免疫检测方法测试其检测目的抗原的特异性。举例来说，细胞系可被等分到许多孔中并温育，而来自每个孔的上清液通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体技术等进行分析。鉴定产生能够识别靶抗原但是不识别非靶表位的单克隆抗体的细胞系，然后直接在体外培养或注射到组织相容性动物体中以形成肿瘤，并产生、收集和纯化所需的抗体。

因此，本发明在第一步中提供了特异性地与D-二聚体或其他交联血纤维蛋白衍生物相互作用的单克隆抗体。

如上文所指出的，非动物细胞例如植物、酵母和/或微生物细胞也可被用于产生典型的单链抗体。在这个实施方案中，这样的细胞被设计表达编码抗体的一个链的核酸分子。

然后单克隆抗体经受脱敏方法。这样的过程可采取多种形式，包括与根据本发明制备的单克隆抗体具有相同或相似特异性的嵌合抗体的制备。嵌合抗体是其轻链和重链基因是典型地通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建的抗体。因此，根据本发明，一旦获得产生所需单克隆抗体的杂交瘤，利用技术产生种间单克隆抗体，其中一个物种的结合区与另一个物种的抗体非结合区组合(Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443，1987)。举例来说，来自非人(例如鼠)单克隆抗体的CDRs可被移植到人类抗体上，从而“人源化”该鼠抗体(欧洲专利公开号No.0 239 400；Jones等，Nature 321：522-525，1986；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536，1988；Riechmann等，Nature 332：323-327，1988)。在本案中，脱敏步骤是人类特异性的。更特别地，CDRs可被移植到带有或不带有人恒定区的人类抗体可变区。提供CDRs的非人抗体典型地被称之为“供体”，而提供骨架的人类抗体典型地被称之为“受体”。 恒定区无需存在，但如果存在，他们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本上相同，也就是说，至少大约85-90％，优选大约95％或更大的相同性。因此，人源化抗体的所有部分，可能除了CDRs，与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分基本上是相同的。因此，“人源化抗体”是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。通过“人源化”步骤，供体抗体被表述为“人源化了的”，因为产生的人源化抗体预期可以结合与提供CDRs的供体抗体相同的抗原。本文指的“人源化”包括指对特定宿主，在本案中，人类宿主脱敏的抗体。

应当理解脱敏的抗体可以具有其它的对抗原结合或其它免疫球蛋白功能基本上没有影响的保守氨基酸取代。例示性的保守取代可根据表2进行。

表2

  原始残基   例示性的取代   Ala   Ser   Arg   Lys   Asn   Gln、His   Asp   Glu   Cys   Ser   Gln   Asn   Glu   Asp   Gly   Pro   His   Asn、Gln   Ile   Leu、Val   Leu   Ile、Val   Lys   Arg、Gln、Glu   Met   Leu、Ile   Phe   Met、Leu、Tyr   Ser   Thr   Thr   Ser   Trp   Tyr   Tyr   Trp、Phe   Val   Ile、Leu

可以采用的产生本发明的脱敏抗体的例示性方法，举例来说，被记载于Richmann等，1988，同前；美国专利Nos.6,056,957、6,180,370和6,180,377以及Chothia等，J：Mol.Bio1.196：901，1987中。

因此，在一个实施方案中，本发明考虑对由单克隆抗体3B6识别的表位具有特异性的脱敏抗体分子，其中所述脱敏抗体可变结构域的至少一个或至少两个或至少三个或至少四个或至少五个互补性决定区(CDRs)是源自于所述3B6单克隆抗体，并且该脱敏抗体分子的其余免疫球蛋白来源的部分是源自于其抗体待脱敏的宿主的免疫球蛋白或其类似物。

本发明的这个方面涉及非人抗体构架区的操作。

优选地，脱敏抗体是人源化的鼠3B6。

一个优选的脱敏过程在本文中被称为可变(v)-区移植法，并且产生嵌合抗体。所产生的抗体与现存(例如鼠)抗体相比，在v-结构域内包括一个或多个氨基酸取代。进行v-结构域改变的基本原理是增进在目的宿主(例如人)中诱导免疫应答的潜能。脱敏的基础部分地是依据对引入抗体的实质性免疫应答需要T-细胞介导的应答的假设。T-细胞应答的引发物是从被引入抗体产生的加工肽在抗原呈递细胞(APCs)表面的呈递。APCs联合表面MHC II类分子呈递这种肽。因此，脱敏途径是基于：

(i)预测能够与MHC II类分子结合的肽序列；以及

(ii)改变关键残基以消除肽与MHC II类分子的结合力。

因此，本发明的另一个方面提供了用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，所述变体在所述3B6抗体v-结构域包括一个或多个氨基酸突变，以消除或降低所述v-结构域肽片断与MHC II类分子的结合。

一个或多个氨基酸的取代、增加和/或缺失或者一个或多个核苷酸的取代、增加和/或缺失均涵盖在术语“突变”(″mutation″或″mutations″)中。

在一个特别优选的实施方案中，脱敏抗体通过共转染三个脱敏H-链基因和三个脱敏L-链基因的不同组合而产生。所产生的变体源自于H-链和L-链基因编码的不同组合。优选的H-链是Hv5、Hv6和Hv7。这些在本文被称之为3B6DIVHv5(SEQ ID NO：1)、3B6DIVHv6(SEQ IDNO：2)和3B6DIVHv7(SEQ ID NO：3)。优选的L-链是Kv1、Kv4和Kv7。这些在本文被称之为3B6DIVKv1(SEQ ID N0：4)、3B6DIVKv4(SEQID NO：5)和3B6DIVKv7(SEQ ID NO：6)。特别有用的组合包括VHv5/VKv1、VHv6/VKv1、VHv7/VKv1、VHv5/VKv7、VHv6/VKv7、VHv6/VKv4、VHv7/VKv4、VHv7/VKv7以及VHv5/VKv4。括号中的序列标识号(SEQ ID NOS：)表示该特定链的氨基酸序列。编码SEQ ID NOS：1-6中每一个的相应核苷酸序列被表示为SEQ ID NOS：7-12。

所有这样的H和L链组合也都涵盖在本发明中。

因此，本发明提供了用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，所述变体包括含有选自于SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：8/SEQID NO：10、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：10、SEQID NO：7/SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：12以及SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链和轻链v-结构域的组合，或者由与上文列举的每对中的一个或两个核 苷酸序列至少有70％相似性的核苷酸序列、或由在低严紧度下能够与上文列举的每对中的一个或两个核苷酸序列或者它们的互补形式杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的组合。

所有这样的H和L链组合也都涵盖在本发明中。

因此，本发明提供了用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，所述变体包括含有选自SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2/SEQID NO：4、SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：5、SEQID NO：3/SEQID NO：5、SEQID NO：3/SEQ ID NO：6以及SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链和轻链v-结构域的组合，或者与上文列举的每对中的一个或两个核苷酸序列至少有70％相似性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的组合。

更特别地，本发明提供了用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，所述变体包括选自VHv5/VKv1、VHv6/VKv1、VHv7/VKv1、VHv5/VKv7、VHv6/VKv7、VHv6/VKv4、VHv7/VKv4、VHv7/VKv7以及VHv 5/VKv4的重链和轻链v-结构域的组合。

本文使用的术语“相似性”包括比较序列间在核苷酸或氨基酸水平上的精确相同性。当在核苷酸水平不具有相同性时，“相似性”包括序列间的差别，其产生不同的、但在结构、功能、生物化学和/或构象水平上仍然彼此相关的氨基酸。当在氨基酸水平不具有相同性时，“相似性”包括在结构、功能、生物化学和/或构象水平上仍然彼此相关的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，核苷酸和序列比较是在相同性而不是相似性的水平上进行的。

用来描述两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括 “比较序列”、“比较窗口”、“序列相似性”、“序列相同性”、“序列相似性百分比”、“序列相同性百分比”、“基本上相似”以及“实质上相同性”。“比较序列”是包括核苷酸和氨基酸残基在内的、在长度上有至少12个、但通常是15到18个、并且经常至少25个或更多，例如30个单体单位。因为两个多核苷酸可以各自包括(1)在两个多核苷酸间相似的序列(也就是只有完整多核苷酸序列的一部分)和(2)在两个多核苷酸间的分歧序列，两个(或多个)多核苷酸间的序列比较典型地是通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸进行的，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。“比较窗口”是指与比较序列相比具有代表性的12个连续残基的概念上的节段。与比较序列(其不包括增加或缺失)相比，比较窗口可以包括大约20％或更少的增加或缺失(也就是缺口)用于两个序列的最佳列序比较。矫正比较窗口的序列最佳列序比较可通过计算机执行的运算法则进行(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或者通过检查由所选择的各种方法中的任何一种所产生的最好的列序排列(也就是在比较窗口上产生最高百分比的同源性)进行。还可以参照例如Altschul等公开的BLAST家族程序(Nucl.Xcids Res.25：3389-3402.1997)。序列分析的详细讨论可见于Ausubel等的(″Current Protocols in Molecular Biology″John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章)第19.3单元。

如本文所用的术语“序列相似性”和“序列相同性”是指在比较窗口上序列相同的程度，或者基于核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的功能上或结构上的相似程度。因此，“序列相同性百分比”，举例来说，是通过在比较窗口上比较两个最佳排列的序列计算的，确定双方序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)的位点数目，以得出匹 配位点的数目，用匹配位点的数目除以比较窗口位点的总数目(也就是窗口大小)，并将结果乘以100得出序列相同性的百分比。因本发明起见，“序列相同性”可以被理解为意味着由DNASIS计算机程序利用附随该软件的参考指南中所用的标准缺省值计算出的“匹配百分比”(Version 2.5 for windows；available from Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA)。相似的注释适用于有关的序列相似性。

本发明考虑的突变和衍生物包括核苷酸序列中不导致氨基酸序列改变的冗余突变。

本文所指的低严紧度条件包括并涵盖用于杂交的从大约0到至少大约15％v/v的甲酰胺和从至少大约1M到至少大约2M的盐，以及用于洗涤条件的从至少大约1M到至少大约2M的盐。一般而言，低严紧度条件是从大约25-30℃到大约42℃。可以改变温度并利用较高的温度代替甲酰胺和/或给出可选择的严紧度条件。可选择的严紧度条件在必要时可以被采用，例如中严紧度条件，其包括并涵盖用于杂交的从至少大约16％v/v到至少大约30％v/v的甲酰胺和从至少大约0.5M至少大约0.9M的盐，以及用于洗涤条件的从至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，或者高严紧度条件，其包括并涵盖用于杂交的从至少大约31％v/v到至少大约50％v/v的甲酰胺和从至少大约0.01M至少大约0.15M的盐，以及用于洗涤条件的从至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般而言，洗涤在T_m＝69.3+0.41(C+C)％条件下(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)进行。不过，错配碱基对数目每增加1％，双链体DNA的T_m就下降1℃(Bonner和Laskey，J.Mol.Biol.5：109，1962)。甲酰胺在这些杂交条件中是可选的。因此，特别优选的严紧度水平被定义如下：低严紧度条件为6×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS在25-42℃下；中严紧度条件为2×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS在20℃到65℃的温度范围内；高严紧度条件为0.1×SSC 缓冲液、0.1％w/v SDS在至少65℃的温度下。

如本文所用的，术语“CDR”包括涵盖抗体构架区可变部分的三条轻链和三个重链的CDR结构环，其桥接该分子结合部分的β链。这些环具有独特的规范结构(Chothia等，J.Mol.Biol.227：799，1992；Kabat等，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，U.S.Department of Health and Human Services，1983)。

免疫球蛋白的轻链或重链可变区，其断续地具有三个高变区，也称为CDRs，在本文称之为“构架区”。构架区及CDRs的范围已经被精确定义(参见如Krebber等，J.Immunol.Methods 201(1)：35-55，19)。不同轻链或重链构架区的序列在种内相对保守。如本文所用的，“人构架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的构架区基本上相同的构架区(大约85％或更多，通常90-95％或更多)。抗体的构架区，即组成型轻链和重链的组合构架区，起着对定位和排列CDRs的作用。CDRs主要地负责结合抗原的表位。

如本文所用的，术语“重链可变区”指长度为从大约110到125个氨基酸残基的多肽，其氨基酸序列对应于本发明的单克隆抗体的重链序列，起始于重链氨基末端(N-末端)的氨基酸残基。同样地，术语“轻链可变区”指长度为从大约95到130个氨基酸残基的多肽，其氨基酸序列对应于本发明的单克隆抗体的轻链序列，起始于轻链N-末端的氨基酸残基。类似地全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25Kd或214个氨基酸)由NH₂-末端的可变区基因(大约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码。类似地全长的免疫球蛋白“重链”(大约50Kd或446个氨基酸)由可变区基因(大约116个氨基酸)和上述其它恒定区基因之一，例如γ基因(编码大约330个氨基酸)所编码。

本文使用的术语“免疫原性”最广义地包括在生物体内激发免疫 应答的特性。免疫原性有代表性地部分依赖于待研究物质的大小、并且部分依赖于其与宿主分子是如何不同。一般认为高度保守的蛋白倾向于具有相当低的免疫原性。

术语“免疫球蛋白”在本文用来指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。被识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄)、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。一种形式的免疫球蛋白构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，并且由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一个轻链和一个重链。在每一对中，轻链和重链可变区共同负责结合抗原，而恒定区起着抗体效应子的作用。除抗体之外，免疫球蛋白可以许多种其它形式存在，包括例如Fv、Fab、Fab′和(Fab′)₂。

本文所指的“免疫交互”包括指任何相互作用、反应或其它形式的分子间结合，并且特别是当其中一个分子是或者模拟免疫系统的一个组份的时候。“免疫交互式分子”包括抗体、抗体片段、合成抗体或T-细胞联合的结合分子(TABM)。

“分离的”是指基本上或实质上不合天然状态下通常附带着的组份的物质。

分离自或源自于特定宿主来源的生物液样品被描述为被“获自”。

本发明还考虑了利用本发明的方法产生的单克隆抗体的片段的用途和制备，举例来说，Fv、Fv、Fab、Fab′和(Fab′)₂片段。这样的片段可以通过例如Coligan等描述的标准方法(1991-1997，同前)制备。

本发明还考虑与本发明的单克隆抗体具有相同或相似特异性的合成或重组抗原结合分子。这类的抗原结合分子可以包括合成的稳定的 Fv片段。这种例示性片段包括单链Fv片段(sFv，常被命名为scFv)，其中肽接头被用来分别桥接V_H结构域的N末端或C末端与V_L结构域的C末端或N末端。ScFv缺少完整抗体的所有恒定部分，并且不能激活补体。合适的连接V_H和V_L结构域的肽接头是那些允许V_H和V_L结构域折叠成具有与该Fv片段来源其中的完整抗体的抗原结合位点相似的三维结构的抗原结合位点的单多肽链的接头。具有所需性质的接头可通过美国专利No 4,946,778中公开的方法获得。不过，在一些情况下接头不存在。ScFvs可以，举例来说，根据Krebber等概述的方法制备(1997，同前)。或者，它们可通过美国专利No 5,091,513、欧洲专利No 239,400或者Winter和Milstein(Nature 349：293，1991)以及Plckthun等(In Antibody engineering：A practical approach203-252，1996)的文章中记载的方法制备。

或者，合成的稳定的Fv片段包括由二硫键稳定的Fv(dsFv)，其中半胱氨酸残基被引入到V_H和V_L结构域中，从而在完全折叠的Fv分子中这两个残基彼此之间会形成二硫键。制备dsFv的合适方法被记载于，例如(Glockshuber等，Biochem.29：1363-1367，1990；Reiter等，J.Biol.Chem.269.18327-18331，1994；Reiter等，Biochem.33：5451-5459，1994；Reiter等，Cancer Res.54：2714-2718，1994；Webber等，Mol.InimunoL 32：249-258，1995)中。

同样考虑作为合成或重组抗原结合分子的是，举例来说如(Ward等，Nature 341：544-546，1989；Hamers-Castennan等，Nature 363：446-448，1993；Davies & Riechmann，FEBS Lett.339：285-290，1994)中所公开的单可变区结构域(命名为dAbs)。

或者，合成或重组抗原结合分子可以包括“小体”。就这点而言，小体是小版本的完整抗体，其在一个单链中编码完整抗体的必需部分。适当地，小体是由天然抗体的V_H和V_L结构域与例如如美国专利No 5,837,821中所公开的免疫球蛋白分子的铰链区和CH3结构域融合组成的。

在一个作为选择的实施方案中，合成或重组抗原结合分子可以含有非免疫球蛋白来源的蛋白构架。举例来说，可参考Ku & Schutz(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6552-6556，1995)，其公开了四螺旋束蛋白细胞色素b562，任意排列它的两个环以创建互补决定性区域(CDRs)，其已被选择用于抗原结合。

合成或重组抗原结合分子可以是多价的(也就是具有一个以上的抗原结合部位)。这样的多价分子可以对一个或多个抗原具有特异性。这类的多价分子可通过，举例来说，如(Adams等，Cancer Res.53：4026-4034，1993；Cumber等，J.Immunol.149：120-126，1992)所公开的通过含有半胱氨酰的肽、由两个抗体片段的二聚反应制备。或者，二聚反应可通过将该抗体片段与天然二聚化的两亲性螺旋融合(Plunckthun，Biochem.31：15791584，1992)或者利用优先异二聚化的结构域(例如亮氨酸拉链jun和fos)(Kostelny等J.Immunol.148：1547-1553，1992)来得到促进。在另一个的实施方案中，使用多步骤的处理例如首先施用脱敏的抗体，然后施用，举例来说，带有报道分子的抗-抗体。

本发明进一步涵盖变体抗体中的氨基酸化学类似物。在向患者施用时采用氨基酸的化学类似物特别适用于稳定该分子。本文考虑的氨基酸化学类似物包括，但不限于，侧链修饰、在肽、多肽或蛋白合成期间掺入非天然氨基酸和/或其衍生物、以及利用交联剂和其它方法对蛋白质分子或其类似物施加构象约束。

本发明考虑的侧链修饰的例子包括氨基修饰，修饰方法是例如通过与乙醛反应的还原性烷基化，接着用NaBH₄还原；利用甲基亚氨基 乙酸酯(methylacetimidate)的脒基化(amidination)；用乙酸酐的酰化；用氰酸盐的氨基甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulphonic acid)(TNBS)三硝基苯甲基化(trinitrobenzylation)氨基；用琥珀酐和四氢邻苯二甲酸酐(tetrahydrophthalic anhydride)酰化氨基；以及用吡哆醛-5-磷酸酯吡哆醛化(pyridoxylation)赖氨酸，接着用NaBH₄还原。

精氨酸残基的胍基可通过与试剂例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。

羧基可通过形成O-acylisourea进行碳化二亚胺活化，接着进行后来的衍生，例如形成相应的酰胺来修饰。

巯基可通过以下方法来修饰，例如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺反应；利用氯汞苯甲酸酯(chloromercuribenzoate)、4-氯汞苯磺酸(4-chloromercuriphenylsulphonic acid)、苯汞氯化物(phenylmercury chloride)、氯汞基-4-硝基酚(chloromercuri-4-nitrophenol)以及其它汞制剂形成汞衍生物；用氰酸盐在碱性pH下甲氨酰化方法。

色氨酸残基可通过，举例来说，用N-溴琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide)氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或硫苯氯化物(sulphenyl halides)烷基化吲哚环来进行修饰。在另一方面，酪氨酸残基，可通过四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物加以改变。

组氨酸残基咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用 焦磷酸二乙酯进行N-乙酯基化完成。

在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括，但不限于，利用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基戊酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文考虑的非天然氨基酸列表显示于表3。

表3

交联剂可被用来，例如，稳定三维构象，利用同源双官能交联剂如具有(CH₂)_n间隔基团，其中n＝1到n＝6的双官能酰亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，以及异源双官能试剂该试剂通常具有氨基反应基元如N-羟基琥珀酰亚胺和其它基团特异性反应基元如马来酰亚胺或二硫基基元(SH)或碳化二亚胺(COOH)。此外，肽可以从构象上被束缚，例如，通过掺入C_a和N_a-甲基氨基酸，在氨基酸的C_a和C_g原子之间引入双键以及通过引入共价键如在N和C末段之间、在两个侧链之间、或者在侧链和N或C末段之间形成酰胺键形成环肽或类似物。

在脱敏前获得的单克隆抗体可通过许多方法进行鉴定，所述方法包括步骤：

(a)用从交联的血纤维蛋白衍生物或含有相同物质的提取物或纤 维蛋白原降解产物中选择的抗原包封表面；

(b)使步骤(a)中的抗原与源自按上所述制备的血纤维蛋白交联衍生物的单克隆抗体接触；以及

(c)使步骤(b)中形成的复合体经受信号放大步骤。

适当地，在步骤(a)中，可使用孔板，其中交联的血纤维蛋白衍生物如D-二聚体和/或纤维蛋白原降解产物(优选获自由凝血酶适当地消化纤维蛋白原以获取片段D、片段E以及任选地片段X和Y的过程)被加到单个的孔中。

随后，源自于交联的血纤维蛋白衍生物的单克隆抗体接着被加到每个孔中。可以应用的合适的信号放大步骤是EIA步骤，其中合适的酶缀合物可以被偶联到随后加入的复合体和底物。或者，RIA、FIA、凝集、粘附或化学发光可被用作合适的信号放大步骤。

上文提及的筛选试验方法的目的是确保测试细胞产生的抗体对相关的交联血纤维蛋白衍生物具有特异性，而对片段D不具有特异性。

应当与纤维蛋白原或纤维蛋白原降解产物具有最小限度的反应，而与衍生物具有阳性反应。术语“最小限度的”包括没有反应性，但是可延及到如相对于抗体定向的纤维蛋白原本身的基底水平。因此，最小限度的反应包括与纤维蛋白原特异性抗体相比的亚最佳反应性。

本发明在其范围之内还包括检测交联血纤维蛋白衍生物的试验，包括步骤：

(1)使对交联血纤维蛋白衍生物而不是片段D具有特异性的单克 隆抗体与怀疑含有源自于交联血纤维蛋白衍生物的抗原或含有交联血纤维蛋白衍生物本身的生物样品进行接触；以及

(2)使步骤(1)中形成的复合体经受信号放大步骤。

在上述试验中，交联血纤维蛋白衍生物适当地是D-二聚体、D₂E或任何其它如上所述的具有高分子量的衍生物。与测试特定交联血纤维蛋白衍生物相关的单克隆抗体如先前所述加以制备。

交联血纤维蛋白衍生物的存在可用作前血栓、血栓或其它涉及血纤维蛋白形成和溶解的疾病的合适的诊断辅助物。

本发明的脱敏单克隆抗体特别适用于血块成像以及靶向血块，以便使血块与能够全部或部分溶解该凝块的酶或其它化学制剂进行接触。

关于凝块成像，报道分子被连附到该脱敏单克隆抗体或对该脱敏抗体具有特异性的抗体或其部分或其上的缀合物上，然后其被引入到宿主例如人体中。通过检测该报道分子，血块得以观测。报道分子的一种特别有用的形式是核标记物。考虑用于本发明的核标记物包括但不限于双官能金属离子螯合物。该螯合物可被连附到抗体本身，或者多个螯合物可通过dendrimers被连附到蛋白质上。特别优选的核标记物是^99mTc、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁷Br、⁹⁷Ru、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I以及¹⁸⁸Re。最优选的核标记物是^99mTc。优选地，宿主是人类，因而，3B6鼠单克隆抗体有必要脱敏。

作为选择形式的免疫闪烁扫描法可利用同位素例如⁶⁸Ga或¹²⁴I或其它PET同位素获得。这种技术可被记载为“免疫-PET”。该技术比γ照相闪烁扫描法具有优势，并且可以提供高分辨率的血块影像，特别 是在不太容易由常规诊断方法诊断的身体部位，例如肺部或者腓肠或骨盘中的小凝块。

因此，本发明提供了缀合分子，该分子含有脱敏免疫交互式分子如脱敏抗体和成像标记物或治疗制剂中的一种或两种。

优选的成像标记物是MRI-、超声波-和/或CT-类型的标记物，例如但不限于^99mTc、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁷Br、⁹⁷Ru、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、 ¹³¹I以及¹⁸⁸Re。

优选的治疗标记物包括细胞因子、抗凝血制剂、伤口修复制剂以及抗感染制剂。

本发明的另一方面考虑检测人类患者体内血块的方法，所述方法包括向所述患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6或其抗原结合片段，使得该被标记抗体散布在整个循环系统中，然后使所述患者经受报道分子检测方法以鉴定该抗体在凝块中的定位。

优选地，报道分子是核标记物。

优选地，核标记物是^99mTc、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁷Br、⁹⁷Ru、¹¹¹In、 ¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I以及¹⁸⁸Re。

优选地，核标记物是^99mTc。

本发明进一步考虑利用对D-二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性的脱敏鼠单克隆抗体制造凝块成像制剂。

优选地，鼠单克隆抗体是3B6或其同系物。

优选地，该凝块成像标记物是用于人的。

同样的抗体还可以携带多个标记物如多种抗凝固剂制剂和/或报道分子。或者，或者另外，可施用分别携带不同标记物的多个抗-抗体。

本凝块靶向抗体可单独被使用或者与其它成像方案联合使用。一种这样的方案是平面成像例如但不限于CT、MRI或超声波。

从而，本发明的另一个方面考虑检测人类患者体中血块的方法，所述方法包括向所述患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中，然后使所述患者经受平面凝块成像术。

优选地，平面成像术是MRI或CT扫描。超声波也可用于该成像过程。

从而，本发明的另一个方面考虑检测人类患者体中的血块的方法，所述方法包括向所述患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中，然后对所述患者进行计算机辅助断层摄影核医学扫描以观测该凝块。

优选地，报道分子是核标记物。

优选地，核标记物是^99mTc、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁷Br、⁹⁷Ru、¹¹¹In、 ¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I以及¹⁸⁸Re。

优选地，核标记物是^99mTc。

本发明的凝块成像制剂还可被用作治疗制剂。特别地，该凝块制剂与凝块溶解或凝块生长预防制剂如抗凝固剂分子融合、连接或以其它方式结合。

因此，本发明的另一个方面涉及促进人体内血块溶解或清除的方法，所述方法包括向所述人施用凝块溶解或凝块生长预防有效量的、对人源D-二聚体和其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且与纤维蛋白原或包括片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物不具反应性的鼠源单克隆抗体变体，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的，其中所述单克隆抗体进一步包括融合、连接或以其它方式结合在其上的凝块溶解或凝块生长预防制剂。

而本发明的另一个方面涉及对人源D-二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体在制造用于溶解人体内血块的药剂中的应用，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的，并且所述抗体进一步包括融合、连接或以其它方式结合在其上的凝块溶解或凝块生长预防制剂。

在一个选择的实施方案中，可以利用多个脱敏抗体。在一个实施例中，脱敏3B6抗体被单独给药，然后是脱敏的抗免疫球蛋白抗体，分别携带有制剂，例如可靶向凝块-3B6复合体的诊断或治疗制剂。而另一个选择是设计具有多(例如双)特异性的抗体。在这种情况下，一个特异性是针对凝块的而另一个是针对凝块位点的(例如针对细胞受体)。这可以利用复合抗体完成。

本发明进一步涉及含有本发明的凝块靶向制剂和一种或多种药学 可接受的载体和/或稀释剂的组合物。

适于注射用的药物形式包括含有稳定制剂如糖、蛋白或其它促进放射性标记过程的化合物或分子的无菌水溶液以及冻干形式的抗体制剂。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用加以保存。载体可以是溶剂或稀释介质，包括例如水、乙醇、聚醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。合适的流动性可通过，例如利用superfactants加以维持。微生物作用的预防可通过各种抗菌或抗真菌制剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等等来实现。在许多情况下，优选包括等渗制剂，例如糖或氯化钠。延长可注射化合物的吸收可通过在该组合物中使用延迟吸收的制剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射溶液通过将需要量的活性化合物掺入到具有活性成分及可选的其它所需活性成分的适当的溶剂中来制备，继之以过滤灭菌或其它适当的灭菌方法。

药学可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂、分散介质、包封剂、抗细菌和抗真菌制剂、等渗和吸收延迟制剂等。这样的介质和制剂被用作药学活性物质是本领域众所周知的，并且除了任何常规介质或制剂与活性成分不相容的范围之外，它们在治疗组合物中的用途均可考虑。补充性活性成分也可以被掺入到该组合物中。

本发明的凝块靶向制剂可用于凝血酶相关疾病例如DVT、PE和DIC的诊断和/或治疗。

而本发明的另一个方面涉及治疗具有血纤维蛋白相关肿瘤的患者的方法。在这个实施方案中，针对D-二聚体表位的抗体可被用以递送 细胞毒性制剂，例如发射β或γ射线的同位素或其组合。这样的同位素包括但不限于¹³¹I、钇-90、铼-186、铼-188、镥-117以及铜-67。血纤维蛋白相关肿瘤包括血纤维蛋白囊性肿瘤。

因此，本发明的脱敏免疫交互式分子是任何凝块结合制剂或凝块溶解制剂或任何具有有益的诊断或治疗性质的制剂的载体。本发明的脱敏免疫交互式分子还可用于测定凝块溶解、消散和/或消失的动力学。一旦获得该信息，凝块溶解或成像制剂可非常迅速地被施用。

本发明进一步通过以下非限制性的实施例加以描述。

实施例1

细胞融合及杂合子的选择

从注射D-二聚体后3天通过断颈杀死的2只被免疫的小鼠体内无菌取出脾脏。在此之前，小鼠已经用如前述的Graeff和Hafter参考文献中所报道的由蛋白水解酶凝血酶和纤溶酶消化的血纤维蛋白溶解产物3次注射免疫。两个脾脏被放置在含有5ml完全培养基(85％RPMI1640、15％w/v胎牛血清、100I.U./ml青霉素、100μg/ml链霉素和2×10^-3M谷氨酰胺；Gibco，Grand Island，N.Y.)的60mm有盖培养皿中(Falcon，3001，Oxnard，Calif.)。细胞悬液通过用连接在顶端最后1cm被弯曲成60°角的3ml一次性注射器上的2×18标准针头膜剥取脾脏来制备。然后细胞悬液被吸入到配备有22号标准针头的10ml注射器中，并以中度压力喷射。该操作进行两次，之后通过细网眼不锈钢筛子将细胞过滤到Falcon 2001试管中，以除去较大的细胞块和碎片。

将细胞悬液在室温下静置5分钟，以使较小的块和膜片段沉淀，之后将该细胞悬液转移到一个新鲜的Falcon 2001试管中。细胞以 350G在室温下离心5分钟，并且将上清从该第一次的细胞沉淀中倾倒至一个新鲜的试管中并以700G旋转5分钟得到第二次沉淀，并且合并两次沉淀并重悬于5ml完全培养基中。然后计数脾白细胞(SWBC)，并分别用Turks和锥虫蓝染色估计它们的存活力，并且将100×10⁶存活的SWBC放置在总体积为5ml的完全培养基的分开的Falcon 2001试管中。采用了用于融合的NS-1骨髓瘤细胞，通过以380G在室温下离心15分钟洗涤一次，并调整至5×10⁶存活细胞/ml完全培养基。

混合25×10⁶NS-1和100×10⁵免疫SWBC并以350G在室温下旋转5分钟。倾出上清，余下的培养基小心地用巴斯德移液管和2ml 42％w/v的聚乙二醇溶液(PEG，MW1540)(Baker Chemical Co.，New Jersey)取出。用5ml玻璃的一次性移液管(Corning Glass，Coming，NY)添加37℃的含有15％v/v二甲亚砜(DMSO)的RPMI 1640，并且借助电子移液管控制器(Pipet-aidDrummond Scientific Co.，Broomall，PA)，细胞用同一个5ml移液管重悬30秒。将PEG-细胞悬液在室温下再静置30秒，之后在90秒的时间内，用巴斯德移液管、滴加5ml完全培养基，并持续敲打试管，足以确保与粘性PEG溶液完全混合。立即加入另外5ml完全培养基，并倒置混合，并将细胞悬液在室温下再静置150秒，之后以350G在室温下离心5分钟。倾出上清，细胞沉淀由配有电子移液管控制器的5ml移液管轻轻地重悬于5ml完全培养基中；特别小心不要打碎所有的细胞块。利用Tridak stepper(BellcoGlassInc.，Vineland，NJ)将0.05ml细胞悬液添加到4个Costar 24孔板(Costar 3524，Cambridge，Mass.)的每个孔中，每孔含1×10⁶正常BALB/c小鼠SWBC作为饲养细胞，所述饲养细胞溶于含有10^-4M次黄嘌呤(Sigma)、4×10^-7M氨基喋呤(Sigma)、1.6×10^-5M胸腺嘧啶核苷(Sigma)以及4×10^-5M 2-巯基乙醇的1ml完全培养基中(HAT培养基)，在下文中称之为1°融合板。

然后将1°融合板于37℃放置在潮湿的5％CO₂、95％的空气当中。 细胞首先在第5天或第7天、以及之后必要时，用0.5ml新鲜HAT培养基饲养。一般来说，在第10天，从每个表现出杂交瘤生长的孔中取出0.5ml培养基用于筛选试验，并用0.5ml新鲜HAT培养基替换。许多生长最强的孔被选择用于基于筛选试验的维持。使所选择的孔在原始孔中生长至汇合(1°孔)，然后各自一分为二并转移到24孔Costar板(2°板)的新鲜孔(2°孔)中。每日检查孔并且在必要时扩增至该2°Costar板的第二、第三或第四孔。从第14-28天起，细胞用HT培养基饲养。当该2°板中至少两个孔中出现强烈生长时，从每种克隆型的一个孔中选择上清用于重筛，并且从第二次筛选试验的结果中选择多个特异性抗体产生克隆型以便通过有限稀释产生单克隆抗体分泌细胞系。

实施例2

杂交瘤的克隆

重悬所选择的每种克隆型的一个2°孔，并通过锥虫蓝排除法估测每孔中存活的细胞数目。就在涂布每种克隆型之前，在HT培养基或完全培养基(如果融合后细胞天龄大于28天)中进行相关的系列稀释以提供0.5细胞/0.05ml的频率。然后用Tridak stepper将这一体积加到含有溶于0.1ml HT或完全培养基中的1×10⁵正常小鼠脾饲养细胞的96孔平底组织培养板(Flow Laboratories，Mississauga，Ontario，Canada)(LD板)的每个孔中。然后将LD板于37℃放置在潮湿的5％CO₂、95％的空气中，并且7-10天后筛选克隆生长。从每个阳性生长孔中，取出0.1ml上清用于筛选，并且这些孔第一次用0.1-0.15ml HT或完全培养基饲养。以LD筛选试验为基础，最终挑选最低限度两个“较好的”特异性抗体生产克隆用于扩增大量培养。

或者，如果希望获得大量的Mab，在注射2×10⁶存活杂交瘤细胞之前14天，雌性BALB/e小鼠腹膜内注射0.5ml 2，5，10，14，四甲基 十五烷(Pristane，Aldrich Chemical Corp.，Milwaukee，Wisonsin)，并在注射细胞后12-14天从小鼠中收集腹水。腹水通过离心澄清，并通过用45％硫酸铵沉淀回收MAb，并在含有0.01％叠氮钠的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中于4℃或-70℃贮存。

实施例3

单克隆抗体筛选试验

96孔U型底精密试验板(Disposable Products Pty.Ltd.，Adelaide，South Australia)的孔通过加入50μl的D-二聚体(5μg/ml)或者纤维蛋白原降解产物(5μg/ml在PBS中室温下(25℃)1小时)包被。过量抗原通过倒置并轻敲板除去，然后板用含有0.05％w/v吐温20(Sigma Chemical Corp.，St Louis，Missouri)的PBS洗涤3次。然后，通过向每个孔中添加50μl组织培养上清并在室温下温育1小时，检测将MAb分泌到D-二聚体或纤维蛋白原降解产物的克隆。未结合的MAb通过倒置并轻敲除去，并且板用PBS/吐温洗涤3次。加入100μl溶于PBS/吐温中的稀释度为1/1000的偶联了过氧化物酶的羊抗鼠免疫球蛋白稀释液(Dakopatts，Copenhagen，Denmark)并将其在室温下再温育1小时。板被再次倒置并用PBS/吐温洗涤3次，然后向每孔中加入100μl活化的底物(现用现配，将10μl 3％过氧化氢溶液添加到含有50mM柠檬酸盐、2.5mM 0-联甲苯胺二氢氯化物(0-联甲苯胺，Sigma Chemical Co.，自稀HC1中再结晶)、0.025mM EDTA pH 4.5的10ml底物溶液中)。10分钟后通过加入50μl 3M HCl终止颜色反应，其产生从蓝色到黄色的颜色变化，并且在Titertek multiskan上记录了450nm下的吸光值。

实施例4

3B6可变区序列的鉴定

鼠杂交瘤3B6在补充有15％w/v胎牛血清的RPMI 1640培养基中增殖。从10⁷杂交瘤细胞中制备总RNA。利用反转录酶以及小鼠κ恒定区和小鼠IgG恒定区引物制备V_H和V_κcDNA。利用多种小鼠信号序列引物(6套用于V_H并且7套用于V_κ)通过PCR扩增第一链cDNA。被扩增的DNA经凝胶纯化后被克隆到载体pGemT Easy(Promega)中。通过PCR从所得的V_H和V_κ克隆中筛选预期大小的插入物，并且通过双脱氧链终止法测定筛到的克隆的DNA序列。

通过序列分析鉴定生产性V_H和V_κ基因。参照其它抗体序列确定互补性决定区的位置(CDR)(43)。3B6V_H可被归类为小鼠重链亚组IA。3B6V_κ可被归类为小鼠κ链亚组I。

实施例5

具有潜在T细胞表位的3B6可变(v)区序列的分析

3B6V_H和V_κ序列利用以前记载的方法分析潜在T细胞表位的存在(Carr等，国际专利公开号No.WO98/52976)。被鉴定为潜在T细胞表位的肽(MHC II类结合肽)被in silico修饰，并且对修饰序列进行再分析，以确保MHC II类结合肽的丢失，并证实在周围序列中没有产生其它的MHC II类结合基元。或者，修饰该序列以使MHC II类结合基元转换成人类生殖系中发现的一个基元。测试单个的、通常是保守的、氨基酸取代，并且考虑进行总体抗体结构上的取代。许多突变序列汇集于V_H和V_κ，各自含有不同数目的取代。

实施例6

设计具有减少数目的潜在T细胞表位的3B6变体可变(v)区序列

根据实施例5的方案设计的重链和轻链(v)区在体外通过所记载的重叠PCR重组法构建(Daugherty等，Nucleic Acids Research 19： 2471-2476，1991)。克隆的鼠V_H和V_κ基因作为模板用于将构架区突变为所需的人源化序列。合成了几套突变引物对，所述引物对含有待改变的区域。邻近的引物包括15bp的同源序列。第一轮PCR利用这些引物产生5到8个涵盖所设计的(v)区基因的重叠DNA片段。利用载体V_H-PCR1和V_κ-PCR1(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833-3837，1989)作为模板，将包括前导信号肽、前导内含子和鼠免疫球蛋白启动子的5′侧翼序列，以及包括剪接位点和内含子序列的3′侧翼序列引入到另外的两个重叠片段中。所产生的DNA片段在第二轮PCR中通过利用外侧翼引物结合在一起，从而获得所需的全长PCR产物。这些PCR产物被克隆到载体pUC19中用于DNA序列测定。挑选含有预期序列改变的克隆，并且确认完整的DNA序列对于每个所需的V_H和V_κ是正确的。按照所记载的将重链和轻链基因转移到具有人IgG1或κ恒定区的表达载体pSVgpt和pSVhyg中(Tempest等，Biotechnology 9：266-271，1991)。利用载体V_H-PCR1和V_κ-PCR1(Orlandi等，1989，同前)作为模板引入包括前导信号肽、前导内含子和鼠免疫球蛋白启动子的5′侧翼序列，以及包括剪接位点和内含子序列的3′侧翼序列。

实施例7

3B6抗体变体的表达和纯化

3B6变体重链和轻链表达载体以不同的组合通过电穿孔被共转染到NS0中，一种非免疫球蛋白产生小鼠骨髓瘤，获自于欧洲动物细胞培养物保藏中心，Porton，U.K.(ECACC No 85110505)。表达gpt基因的克隆在补充有0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)中进行选择。由转染的细胞克隆产生的人抗体是通过用于人的人IgG的ELISA试验检测(48)的。挑选并扩增分泌抗体的细胞系。3B6抗体变体利用 -A(Bioprocessing Ltd，Conset，U.K.)进行纯化。

实施例8

3B6抗体变体的功能测试

利用基于大体上如实施例3中所述的ELISA试验检测抗体变体与D-二聚体的结合。结合特异性利用人纤维蛋白原结合试验证实。不过，在一个优选的实施方案中，利用液相的D-二聚体。在这个试验中，3B6抗体以0.5μg/孔被包被到ELISA板上，以捕获溶液中的D-二聚体。D-二聚体以10μg/ml(500ng/孔)及双倍稀释液应用。已示抗体是HRPO偶合的鼠单克隆抗-D(Dimertest EIA Tag；Agen)，且结果由OPD底物显色，并在492nm处读数。脱敏3B6抗体与鼠和嵌合3B6抗体以及先前的先导脱敏抗体3B6DIVH1/DIVK1进行比较。结果显示于图4A、4B和4C中。利用液相D-二聚体证明比固相D-二聚体能更好地挑选克隆，因而是本发明一个优选的方面。

实施例9

利用3B6-99mTc的血栓检视

来自小鼠并且对人是脱敏形式的3B6单克隆抗体表示在图1A中，并表现出对血块中的主要部分血纤维蛋白的特异性(图1B)。凝块成像概念通过用核标记物，在本案中，^99mTc标记3B6单克隆抗体来形成(图2)。向人施用标记的3B6脱敏单克隆抗体(图3A)。循环系统中凝块，例如前腿中血块(图3B)的观测通过单克隆抗体与血纤维蛋白的结合从而导致放射线集中在凝块部位来进行。

实施例10

利用3B6^-99mTc的血栓检视

通过置于股静脉的球形导液管灌输凝血酶和人纤维蛋白原预先形 成的血栓的栓塞术在被麻醉的狗体中产生肺栓子(0.1-0.5g)。纯化了的血纤维蛋白特异性单克隆抗体的嵌合(人/鼠)衍生物的Fab′片段(0.35mg)用15mCi^99mTc标记。栓塞术后1小时，放射性标记的抗体制备物通过末梢静脉内导管进行注射。抗体注射后8小时，进行成像扫描来观测栓子。

^99mTc标记的抗体片段在两个受试对象中均以1小时的t_1/2从循环系统中清除。在受试对象1中，右下叶可见两个小栓子(质量和0.187g)。凝块/血液放射性比率为38∶1。在受试对象2中，右下叶可见一个栓子(质量0.449g)。凝块/血液放射性比率为27∶2。在受试对象1的右心室发现一小栓子(0.091g)。凝块/血液放射性比率为45∶1。不管是抗体给药还是扫描方法学都没有注意到负效应。

灌输放射性标记的抗-血纤维蛋白抗体片段继之通过成像操作产生栓子的影像，甚至是肺边缘相对小的栓子。影像可信并且需要极少的训练加以阐释。该技术可在相同的背景下用于成像深静脉血栓。这种制剂很好地被受试对象耐受。无需屏气或心脏门控。它没有利用肾毒的静脉内差别染色。辐射剂量与用于换气/灌注扫描的剂量相似。这个技术可利用在大多数医疗中心都可用的技术简化并阐明PE和DVT的诊断。

本领域熟练技术人员会理解本文记载的发明容许进行不同于那些具体描述的变更和修饰。应当理解本发明包括所有这样的变更和修饰。本发明还个别地或全体地包括在该说明书中谈及或指出的所有步骤、特征、组合物及化合物，以及任何两个或更多所述步骤或特征的任何和所有的组合。

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