一种温和条件下快速形成共价交联的水凝胶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种温和条件下快速形成共价交联的水凝胶及其制备方法。水凝胶包括PEG的NHS酯和含N-端基半胱氨酸的PEG两种组份。将两组分溶解、混合即可得到水凝胶。本发明的水凝胶，可在温和条件下，快速形成共价交联水凝胶，特别适合制作成外科封闭剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水凝胶及其制备方法，特别涉及一种可在温和条件下快速形成共价交联的水凝胶及其制备方法。

背景技术

水凝胶（Hydrogel）是亲水性的聚合物的网状结构，不溶于水，但可以吸收和保留大量的水分，在水溶液中高度膨胀，具有良好的生物相容性和相似性。它们在医药生物领域可应用于外科封闭剂和粘合剂、药物释放、组织修复和组织工程。

现存的水凝胶系统通常是通过化学、或物理的作用形成。化学交联形成水的凝胶往往涉及到使用有毒的交联剂和游离基，并且，形成的水凝胶通常不能生物降解。另一方面，物理水凝胶通过非共价键的作用，比如，氢键、离子作用、疏水作用和相变而形成。这样形成的物理水凝胶比较脆弱。所以，要满足临床需要，不使用有毒试剂、在温和条件下形成共价交链的水凝胶，仍然面临着挑战。

水凝胶作为外科封闭剂已经应用于临床。作为外科手术的辅助手段，外科封闭剂在外科手术中用于止血，防沾粘和堵漏，广泛地应用于脑外科，心脏外科，胸，腹外科，神经外科等手术中。

目前，使用水凝胶的外科封闭剂产品可以分为三类：一类是以从哺乳动物的血液（牛血、猪血、或人血）中提取的血纤维蛋白原为成份的血纤维蛋白外科封闭剂，或牛的明胶蛋白质为成分的封闭剂。从哺乳动物的血液中提取的血纤维蛋白原(fibrinogen)在从哺乳动物血中提取的凝血酶(thrombin)的催化下交链形成高分子血纤维蛋白(fibrin)凝胶，比如Tisseel?、安可胶、倍绣。FloSeal?使用牛的明胶蛋白和凝血酶。此类产品属于来自血液的制品，存在着被致病生物污染的风险，比如，可能存在导致艾滋病、乙型肝炎、疯牛病、猪流感等疾病的病毒和致病源。另外，从猪和牛来源的蛋白质和凝血酶是异种蛋白，用于人体内可能会进发后果严重的免疫反应。

另一类外科封闭剂产品是使用动物来源的蛋白质在小分子醛类交联剂的作用下交联形成水凝胶，比如，使用己二醛和牛来源的明胶蛋白交联形成水凝胶。美国专利US5385606描述了使用牛血来源的白蛋白和己二醛交联形成水凝胶的方法。这类水凝胶除了存在被动物体内的致病生物污染和异种蛋白过敏的风险，使用的小分子醛类交联剂也有一定的毒性。

第三类外科封闭剂产品全部是由人工合成的具有生物相容性的高分子生物材料为成分组成。这类产品没有被致病生物污染和异种蛋白过敏的风险。

US 5410016描述了使用聚乙二醇和聚乳酸制备线形的嵌段共聚物，然后在其分子的两端通过酯键联接可以在光的激发下聚合交联的丙烯酸部分。这种分子两端含有丙烯酸酯的嵌段共聚物的水溶液涂在使用部位后在催化剂和光照下迅速原位形成水凝胶（FocalSeal^?）。这个作为外科封闭剂的FocalSeal^?水凝胶系统的不足之处在于实际操作中有些难以掌控。

US 6566406公开了一种由两种溶液组成的水凝胶：由四分枝的聚乙二醇的活化酸衍生物的溶液和一个短肽三赖氨酸（Lys-Lys-Lys）的溶液混合后原位聚合形成的外科封闭剂。这个原位形成的水凝胶系统，需要溶液的酸碱度（pH值）在9.5左右，才能快速形成水凝胶。在这样碱性的条件下，容易产生对局部刺激的作用和炎症反应。

US 6312725公开了一种由两种溶液混合在原位形成的水凝胶外科封闭剂产品（CoSeal^?）。这两种溶液分别为端基为活化酸衍生物的四分枝聚乙二醇的溶液和端基为巯基的四分枝聚乙二醇的溶液，混合后通过形成硫脂而原位聚合形成水凝胶。这种水凝胶CoSeal^?的不足之处除了需要溶液的酸碱度（pH值）在9.6才能快速形成水凝胶也具有局部刺激作用和引发炎症反应外，由于硫脂键在水溶液中的易被水解而不稳定，通过硫脂键交联形成的水凝胶稳定性较差而发挥作用的时间较短。

硫酯类化合物和N-末端半光氨酸的化合物在温和条件下（磷酸盐缓冲溶液，pH 7-8）混合后一个新的酰胺键，这个化学反应称为自然化学连接。WO2008/131325描述了利用自然化学连接作为交联反应形成水凝胶。使用端基为硫脂的四分枝聚乙二醇的溶液和端基为半胱氨酸的四分枝聚乙二醇的溶液。这两种溶液混合后在温和条件下（pH 7-8）通过形成酰胺键而原位聚合形成水凝胶。作为水凝胶共价交联的方法，自然化学连接有几个明显的优点：①具有化学选择性，硫脂只与含半胱胺（cysteamine）结构的化合物、或N-末端半光氨酸的化合物反应形成新的酰胺键，不受其他硫醇和巯基存在的干扰；②在温和的条件下，不使用催化剂、引发剂等可能有毒的化合物而高效反应；③与其它使用巯基的化学连接反应形成的水凝胶不同，自然化学连接反应在形成新的酰胺键的同时，还在骨架上产生一个巯基基团，从而使形成的水凝胶具有更好的生物黏附性。然而，由于WO2008/131325中公开的这两种溶液混合后形成水凝胶较慢（3分钟左右），不宜作为外科封闭剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的水凝胶。

本发明所采取的技术方案是：

一种水凝胶，含有A、B两种组份，A组份的结构式如通式Ⅰ所示

B组份的结构式如通式Ⅱ所示

式中，Y为连接原子或连接基团，X为碳或分枝数不低于2的分子母核，n为0～200之间的整数，m为2～32之间的整数。

优选的，B组份的结构式如通式Ⅲ所示

式中，R = -H、-CH₂CH₂COOH或-(CH₂)₃NH(NH)CNH₂，Y为连接原子或连接基团，X为碳或分枝数不低于2的分子母核，n为0～200之间的整数，m为2～32之间的整数。

优选的，n为50～70之间的整数。特别的，n=57。

优选的，m为4～16之间的整数。特别的，m=4，X为C。

连接原子为O、N或C。

上述水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)    将A、B两组份分别溶解于pH为7～8的溶液中，分别得到A、B组份的混合溶液；

2)    将A、B组份的混合溶液混合，得到水凝胶。

优选的，A、B组份的混合溶液的质量体积浓度为5%～20%。

优选的，A、B组份按4：1～1：4的摩尔比混合。

优选的，pH为7～8的溶液为磷酸钠缓冲液。

本发明的水凝胶，A、B两组份的水溶液混合后，可以在温和条件下快速反应形成一个新的酰胺键，混合不到10秒即可得到共价交联的水凝胶。本发明的水凝胶，结构稳定，具有优良的粘弹性，可用作外科封闭剂。

附图说明

图1和图2为本发明水凝胶的流变行为图。

具体实施方式

一种水凝胶，含有A、B两种组份，A组份的结构式如通式Ⅰ所示

B组份的结构式如通式Ⅱ所示

式中，Y为连接原子或连接基团，X为碳或分枝数不低于2的分子母核，n为0～200之间的整数，m为2～32之间的整数。

优选的，B组份的结构式如通式Ⅲ所示

式中，R = -H、-CH₂CH₂COOH或-(CH₂)₃NH(NH)CNH₂，Y为连接原子或连接基团，X为碳或分枝数不低于2的分子母核，n为0～200之间的整数，m为2～32之间的整数。当然，根据本领域技术人员的基本常识可知，为满足不同的需求，PEG的重复单元数n可以不尽相同。多分枝分子母核的分枝数至少为2，优选至少为3，这样A、B组份之间就可以发生活交联反应形成立体网络。达到形成水凝胶的目的。这些多分枝分子母核可以是本领域常用的分子母核。当本发明的水凝胶用于人体时，分子母核优选那些可在体内降解的，对人体无毒害作用的。

优选的，n为50～70之间的整数。特别的，n=57。

优选的，m为4～16之间的整数。特别的，m=4，X为C。在这种情况下，各分枝可以更为均匀地形成水凝胶。

连接原子为O、N或C。当然，也可以是其他可在体内降解的，对人体无毒害作用的二价连接基团。这些基团的选择是本领域技术人员的常规选择。

上述水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)    将A、B两组份分别溶解于pH为7～8的溶液中，分别得到A、B组份的混合溶液；

2)    将A、B组份的混合溶液混合，得到水凝胶。

优选的，A、B组份的混合溶液的质量体积浓度为5%～20%。

优选的，A、B组份按4：1～1：4的摩尔比混合。

优选的，pH为7～8的溶液为磷酸钠缓冲液。当然，也可以使用其他的缓冲液。

下面结合实施例，进一步说明本发明。

组份A的合成

反应方程式如下：

PEG4A-SA的合成：

取丁二酸酐80毫克（分子量100，0.8mmol）、端基为氨基的四分支聚乙二醇PEG4A 1克（平均分子量10k，氨基0.4mmol），加二氯甲烷2毫升溶解，搅拌过夜，检测反应溶液，茚三酮反应呈阴性（黄色）；

用氮气吹干溶剂，加甲醇50毫升溶解所有固体，冷冻溶液过夜（-20℃），取出离心（-9℃，6000rpm，20分钟），除去上清液。对沉淀重复以上溶于甲醇、冷冻、离心、除上清液纯化过程3次后，加入乙醚50毫升，振摇10分钟，离心（20℃，6000rpm，20分钟，除去上清液，重复以上纯化过程2次后，真空干燥两天，得PEG4A-SA。

¹HNMR (CDCl₃, 500MHz) δ 3.2-3.8 (m, -O-CH₂-CH₂-O-), 2.61 (2H, t, J = 7 Hz, -NH-CO-CH₂-), 2.48 (2H, t, J = 7 Hz, -CH₂-COOH)。

组分A（PEG4A-SA-Osu）的合成：

取PEG4A-SA (0.4mmol), N-羟基丁二酰亚胺(HOSu) 0.115 克（1mmol），溶于乙腈1ml，加入 DCC 206 毫克（1mmol）/二氯甲烷1毫升，振摇过夜，过滤除去固体沉淀，减压蒸干滤液，加异丙醇50毫升溶解残留物，冷冻溶液过夜（-20℃），取出离心（-9℃，6000rpm，20分钟），除去上清液；

对沉淀重复以上溶于异丙醇、冷冻、离心、除上清液纯化过程3次后，加入乙醚50毫升，振摇10分钟，离心（20℃，6000rpm，20分钟，除去上清液，重复以上纯化过程2次后，真空干燥两天。

¹HNMR (CDCl₃, 500MHz) δ 3.3-3.8 (m, -O-CH₂-CH₂-O-), 2.95 (2H, t, J = 7 Hz, -NH-CO-CH₂-), 2.80 (4H, s, -N-CO-CH₂-CH₂-CO-N-), 2.57 (2H, t, J = 7 Hz, -CH₂-CO-O-N-)。

当然，也可以使用其他的公知方法，如，制得A组份。

组份B的合成：

组分B可以通过将保护的半胱氨酸，比如Boc-Cys(Trt)-OH、或L-硫代脯氨酸，与含有氨基、羟基、或可以转化为这些官能团的聚合物反应，除去保护基反应得到。

如在使用端基为氨基的4分支的聚乙二醇 (PEG4A)作为聚合物分子母核时，与Boc-Cys(Trt)-OH直接反应，然后除去保护基，即可得到组份B。其反应方程式如下所示：

组分B还可以通过全保护的含有半胱氨酸的二肽，比如Boc-Cys(Trt)-Gly-OH、Boc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-OH，与含有氨基、羟基、或可以转化为这些官能团的聚合物反应，除去保护基反应得到。

全保护的含有半胱氨酸的二肽可通过Fmoc多肽固相合成得到。其反应方程式如下：

如在使用端基为氨基的4分支的聚乙二醇 (PEG4A) 作为聚合物分子母核时，与全保护的含有半胱氨酸的二肽直接反应，除去保护基，即可得到组份B。其反应方程式如下。

B1（Cys-PEG4A）的合成

取Boc-Cys(Trt)-OH(0.25 mmol)，PEG4A (0.5g, 氨基0.2 mmol), BOP (0.11g, 0.25 mmol)溶于二氯甲烷(2ml)，然后，加入 DIEA （44微升，0.25 mmol），振摇2小时，用氮气吹干溶剂；

加甲醇50毫升溶解所有固体，冷冻溶液过夜（-20℃），取出离心（-9℃，6000rpm，20分钟），除去上清液；

对沉淀重复以上溶于甲醇、冷冻、离心、除上清液纯化过程3次后，加入乙醚50毫升，振摇10分钟，离心（20℃，6000rpm，20分钟，除去上清液，重复以上纯化过程2次后，真空干燥两天，得Boc-Cys(Trt)-PEG4A。

硅胶薄层色谱（溶剂系统 DCM-MeOH-HOAC = 100:3:1）检测无Boc-Cys(Trt)-OH存在。茚三酮试验显淡黄色。¹HNMR (CDCl₃, 500MHz) δ 7.40-7.26 (15H, m, -CPh₃), 3.8-3.4 (m, -O-CH₂-CH₂-O-), 1.41 (9H, s, t-Bu )。

把干燥后的Boc-Cys(Trt)-PEG4A样品中加入含三异丙基硅烷(TIS) 1毫升和1，2-二巯基乙烷（EDT）1毫升的三氟乙酸（30毫升），室温搅拌2小时后，减压除去溶剂；

用甲醇（50ml）溶解残留物，甲醇溶液冷冻过夜（-20℃），取出离心（-9℃，6000rpm，20分钟），除去上清液；

对沉淀重复以上溶于甲醇、冷冻、离心、除上清液纯化过程3次后，加入乙醚50毫升，振摇10分钟，离心（20℃，6000rpm，20分钟，除去上清液，重复以上纯化过程2次后，真空干燥两天，得组分B1（Cys-PEG4A）的三氟乙酸盐。

茚三酮试验显深蓝色。Ellman试剂反应显鲜黄色。说明保护基已除去。把的三氟乙酸盐溶于碳酸氢铵溶液（0.1M， 25毫升），冷冻干燥后得到组分B1（Cys-PEG4A）。

保护的半胱氨酸二肽的合成

Boc-Cys(Trt)-Gly-OH、或Boc-Cys(Trt)-Glu(OBu)-OH、或Boc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-OH的合成采用多肽固相合成法，Fmoc化学和三（2-氯苯）氯甲烷树脂（2-chlorotrityl chloride resin）。步骤如下：

取树脂（1g，1.55mmol/g），加Fmoc保护氨基酸，Fmoc-Gly-OH,，或Fmoc-Glu(OBu)-OH,，或Fmoc-Arg(Pbf)-OH的二氯甲烷溶液（1mmol，10ml），再加二异丙基乙基胺（DIEA）（1ml），振摇30分钟后，用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂三次；

加DCM-MeOH-DIEA (8:1:1) 20ml，振摇20分钟，用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂三次。加20毫升20%六氢吡啶的二甲基甲酰胺溶液，振摇20分钟，除去溶剂，用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂四次，茚三酮试验显深蓝色；

取Boc-Cys(Trt)-OH (0.92 g, 2 mmol), BOP (0.88 g, 2 mmol), 溶于二氯甲烷8ml，再加入DIEA 522微升(3mmol)，放置10分钟后加到树脂中，振摇2小时；

分别用二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇洗涤树脂三次，真空干燥树脂，茚三酮试验显淡黄色；

取上述得到的多肽树脂，分别加1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液30ml，振摇20分钟，收集溶液；

重复加入1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液30ml，振摇20分钟，收集溶液步骤4次，合并溶液，加吡啶2ml，减压除去溶剂，加水使产品沉淀。

用水洗涤沉淀直到洗出液为中性，真空干燥，得到保护的半胱氨酸二肽。

B2的合成

取Boc-Cys(Trt)-Gly-OH、或Boc-Cys(Trt)-Glu(OBu)-OH、或Boc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-OH (0.25 mmol)，PEG4A (0.5g, 氨基0.2 mmol), BOP (0.11g, 0.25 mmol)溶于二氯甲烷(2ml)，然后，加入 DIEA （44微升，0.25 mmol），振摇2小时，用氮气吹干溶剂，加甲醇50毫升溶解所有固体，冷冻溶液过夜（-20℃），取出离心（-9℃，6000rpm，20分钟），除去上清液。对沉淀重复以上溶于甲醇、冷冻、离心、除上清液纯化过程3次后，加入乙醚50毫升，振摇10分钟，离心（20℃，6000rpm，20分钟，除去上清液，重复以上纯化过程2次后，真空干燥两天，得Boc-Cys(Trt)-Gly-PEG4A、或Boc-Cys(Trt)-Glu-PEG4A、或Boc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-PEG4A，硅胶薄层色谱（溶剂系统 DCM-MeOH-HOAC = 100:3:1）检测无保护的二肽存在，茚三酮试验显淡黄色，核磁共振氢谱确认其结构；

把干燥后的Boc-Cys(Trt)-Gly-PEG4A、或Boc-Cys(Trt)-Glu-PEG4A、或Boc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-PEG4A样品中分别加入三氟乙酸（30毫升），其中含三异丙基硅烷 (TIS) 1毫升和1，2-二巯基乙烷（EDT）1毫升，室温搅拌2小时后，减压除去溶剂；

用甲醇（50ml）溶解残留物，甲醇溶液冷冻过夜（-20℃），取出离心（-9℃，6000rpm，20分钟），除去上清液；

对沉淀重复以上溶于甲醇、冷冻、离心、除上清液纯化过程3次后，加入乙醚50毫升，振摇10分钟，离心（20℃，6000rpm，20分钟，除去上清液，重复以上纯化过程2次后，真空干燥两天，得组分B2（B-Gly、B-Glu或B-Arg）的三氟乙酸盐。

茚三酮试验显深蓝色。Ellman试剂反应显鲜黄色。说明保护基已除去。

把组分B2的三氟乙酸盐溶于碳酸氢铵溶液（0.1M，25毫升），冷冻干燥后得到产物B2。

水凝胶形成和制备

取一个试管（100 mm长度×13 mm 直径），放一个搅拌子(10 mm长度 ×3 mm 直径) 到试管中，控温37℃，调接搅拌速度为2000 rpm, 加入250 微升的组分B1、或组分B2的磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）（20% w/v），继续搅拌，然后，加入250 微升的组分A的磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）(20% w/v)，。

取比较例1、比较例2、比较例3（分别为US6566406、US6312725和WO2008/131325公开的水凝胶产品），以同样的浓度在相同的条件下进行试验。

混合后开始用计时表计时，当溶液中的搅拌子停止转动时，停止计时，记录下时间，即水凝胶的形成时间，结果如下表所示。

本发明的组份B1可通过巯基形成二硫键交联形成的水凝胶，但是速度非常慢。

上述水凝胶形成时间的判断方法虽然比较粗燥，可能会由于搅拌子的转动而破坏形成的网状结构，使记录的时间大于真实的水凝胶的形成时间。但是，只要在相同的控制的条件下进行测试，测得的时间应该是具有相对的参考价值。

水凝胶溶解实验：①混合等摩尔等体积的组分A的磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）（10%）和组分B的磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）（10%），量取两份100 微升分别到两个塑料小管，10 分钟后检查，为水凝胶，分别在两个小管内加入100 微升0.1M 羟胺水溶液、100 微升200 mM 2-巯基乙醇溶液，振摇，水凝胶都不溶解；

②量取两份100 微升10%的组分B磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）分别到两个塑料小管，5个小时后都仍然是溶液，过夜，为水凝胶，分别用以上两种溶液处理，水凝胶全部溶液。

结果表明，本发明提供的水凝胶不是由硫脂键交联，也不是通过二硫键交联形成。

水凝胶的流变学行为

水凝胶形成实验：

说明：由于组分A和组分B在上述凝胶形成条件下（20%，37℃）迅速形成水凝胶。在这样的条件下，在流变仪上无法也没有足够的操作时间测出凝胶形成时间，因此，在流变学实验中，采用较低的聚合物浓度和反应温度（5%，20℃）以减慢水凝胶的形成速度延长凝胶形成时间，从而进行流变学行为研究。

混合等摩尔等体积的组分A的磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）（5% w/v）和组分B1的磷酸钠缓冲溶液（0.1 M，pH 7.2）（5% w/v），量取500 微升的溶液，快速把溶液加到控温的样品板上（20℃），调接平板（直径25 毫米）的位置使溶液充满1 毫米的板间狭缝。

安装好湿度控制设备，在应变（strain）1%和频率(frequency)1 Hz 恒定的条件下，振荡模式(oscillatory mode)，测量储能模量(G’)和损耗模量(G”)。每15秒采一个数据点。最长测量时间至300 分钟。

频率扫描实验：在G’达到稳定的平台值后，在应变恒定下（1%），进行频率扫描（0.01 Hz 到10 Hz）。

张力扫描实验：在频率恒定下（1Hz），进行应变扫描（1%到100%）。

试验结果如图1和2所示。

数据分析

在水凝胶形成实验中，G’和G”交叉点称为水凝胶形成点，相应的时间点是水凝胶形成时间。在张力和频率扫描实验中，稳定的G’值表明形成的水凝胶为共价交链的水凝胶。从图中可以看出，本发明的水凝胶形成时间极短，是一种共价交联的水凝胶，具有优良的粘弹性。

本发明水凝胶的交联机理如下：

通过这一反应，本发明的A、B组份的水溶液混合之后，可以快速地形成水凝胶。根据这一发应，本领域的技术可以轻易地知道，组份A、B最好以1：1的摩尔比混合，当然，也可以根据具体的需要，使用其他的摩尔比，如A：B=4：1～1：4，如0.25:1、 0.5:1、 0.75:1、 1:1、 1.25:1、 1.5:1、 1.75:1、 2:1。

根据组份的不同，可以分别得到如下结构式所示的水凝胶。

当然，如果使用的其他的分子母核，其结构会稍有不同，但是同样可以发生活共价交联，得到相应的水凝胶。对本领域技术人员而言，其结构是非常容易得到的。