具有降血糖作用的番石榴叶提取物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物及其制备方法与应用。一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物，其特征在于含有质量百分比为20-99％的总三萜酸；并由以下方法制备得到：番石榴叶经乙醇或甲醇加热回流或渗滤提取，减压浓缩得到浸膏，浸膏加水搅拌，离心，取沉淀，得到具有降血糖作用的番石榴叶提取物。本发明的番石榴叶提取物可用于制备预防和治疗II型糖尿病的药物和保健品，其效部位成分明确，毒性小，药理作用强，具有良好的药用前景；制备工艺简单、易于大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于植物天然药物领域，具体涉及一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物及其制备方法与应用。

背景技术

胰岛素抵抗是指机体组织或靶细胞对胰岛素作用缺乏正常反应，其敏感性或反应性降低的一种病理生理状态。已经有大量的研究表明胰岛素抵抗是II型糖尿病最重要的发病机制之一，并贯穿糖尿病的发生、发展全过程，同时也是导致糖尿病各种并发症的“动力”根据。胰岛素抵抗以及由此引起的代偿性高胰岛素血症与人群中II型糖尿病、高脂血症、高血压和冠心病的高发生率密切相关，这种代谢性心血管疾病症候群被称之为“X综合症”或“胰岛素抵抗综合症”，胰岛素抵抗是其发病基础。治疗胰岛素抵抗已经成为预防、控制糖尿病的关键，此外，糖耐量低减、中心性肥胖、高血压、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化、冠心病、微量白蛋白尿、高尿酸血症、多囊卵巢综合症、女性其他原因所致雄性激素增多、胆固醇浓度下降、低密度脂蛋白质量下降(颗粒致密变小)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)增高(纤溶性降低)、癌症恶性病质、慢性酒精中毒、低镁血症及细胞内钙离子增高、肥胖基因编码蛋白瘦素的增高、低体重儿以及生长激素缺乏等都伴有胰岛素抵抗。

II型糖尿病有很强的遗传性并受环境因素影响，发病机制多样而复杂，各病人间存在较大差异。总的来说可概括为胰岛素分泌的相对不足和/或胰岛素抵抗。对II型糖尿病人，尤其是肥胖型糖尿病患者的一系列研究证实，胰岛素抵抗是II型糖尿病发生、发展过程中的关键因素。在研究脂肪细胞和肌肉细胞内胰岛素信号传导途径的基础上，设计开发胰岛素增敏剂，以改善胰岛素抵抗状态，是目前II型糖尿病新药研究的重点，也是其主要方向之一。

已有文献报道番石榴叶总黄酮在糖尿病动物模型上被证明具有降血糖作用(黄海军，等.中药药理与临床，2007，23(5)：243-245)，但其作用机理不清楚；还有文献报道番石榴叶提取物的降糖作用在一定程度上是由于其对PTP1B的抑制作用所介导的(Oh WK，et a1.J Ethnopharmacol，2005；96(3)：411-415)，但未明确其活性成分。中国专利ZL 01806328.4介绍了“α-淀粉酶活性抑制剂”，但该专利仅涉及一种从番石榴叶中获得的含有多酚类物质作为活性成分的α-淀粉酶活性抑制剂用于II型糖尿病的防治。中国专利CN 200610041855.4介绍了“番石榴叶的黄酮类化合物制取方法”，但该专利仅涉及番石榴叶总黄酮的制取方法及其治疗II型糖尿病以及有关并发症的作用。而番石榴叶中总三萜酸部位预防与治疗II型糖尿病，未见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物，其主要成分是总三萜酸。

本发明的另一目的在于提供上述番石榴叶提取物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述番石榴叶提取物的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物，其中总三萜酸所占质量百分数为20-99％；

所述总三萜酸主要是乌苏酸(ursolic acid，PG-1)、2α-羟基乌苏酸(2α-hydroxyursolic acid，PG-2)、积雪草酸(asiatic acid，PG-3)、2α，3β-dihydroxy-taraxer-20-en-28-oic acid(psiguanin A，PG-4)、2α，3β，12α，13β-tetrahydroxy-urs-28-oic acid(psiguanin B，PG-5)和2α，3β，12β，13α-tetrahydroxy-urs-28-oic acid(psiguanin D，PG-6)的混合物；

上述6种三萜酸占总三萜酸质量的20-80％；

所述一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物中含有6-14％的PG-1、20-40％的PG-2、6-14％的PG-3、0.5-3％的PG-4、0.5-3％的PG-5、0.5-3％的PG-6；所述百分比为质量百分比；

化合物PG-1～PG-6的结构式如下所示：

上述一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

番石榴(Psidium guajava L.)叶经乙醇或甲醇加热回流或渗滤提取，减压浓缩(该步骤的作用是除醇和浓缩)得到浸膏，浸膏加水搅拌，离心，取沉淀，得到具有降血糖作用的番石榴叶提取物，其主要成分是总三萜酸；

所述乙醇的体积浓度是70-95％。

上述一种具有降血糖作用的番石榴叶提取物可用于制备预防和治疗II型糖尿病的药物和保健品；

采用高脂饮食+小剂量链脲佐菌素(STZ)建立大鼠II型糖尿病模型，发现本发明提供的番石榴叶提取物可显著降低糖尿病大鼠的空腹血糖水平、提高胰岛素水平和胰岛素敏感指数。动物急性毒性试验表明本发明提供的番石榴叶提取物无毒。以上结果表明，本发明的番石榴叶提取物可用于开发制备预防和治疗II型糖尿病的药物和保健品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、从番石榴叶中提取出总三萜酸用于预防和治疗糖尿病，有效部位成分明确，毒性小，药理作用强，具有良好的药用前景。

2、本发明的原料番石榴资源广泛、价廉，制备工艺简单、易于大规模生产，所得提取物中总三萜酸含量高达50％以上。

3、本发明中的含有乌苏酸、2α-羟基乌苏酸、积雪草酸，及新化合物2α，3β-dihydroxy-taraxer-20-en-28-oic acid、2α，3β，12α，13β-tetrahydroxy-urs-28-oicacid和2α，3β，12β，13α-tetrahydroxy-urs-28-oic acid等六种成分的、总含量为10-90％的有效部位可与药学上可接受的赋型剂一起，采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等。给药剂量为50-500mg/人/次，每天1-3次。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1、番石榴叶提取物的制备

干燥的番石榴(Psidium guajava L.)(产于广东从化)叶2.0kg，粉碎后过20m目筛，用95％乙醇25L渗滤提取，滤出提取液，减压浓缩至2L，然后加入2L的水，煮沸15-20分钟，冷却后，离心(转速4000转/min，10min)，得水不溶物(即沉淀物)103g，即为番石榴叶提取物。经测定，总三萜酸的质量含量为56％。

实施例2、番石榴叶提取物的制备

干燥的番石榴(Psidium guajava L.)(产于广东从化)叶1.0kg，粉碎后过20目筛，用甲醇5L加热回流提取3次，每次3小时。滤出提取液，减压浓缩至干称重155g，然后加入约4L的水，煮沸15-20分钟，冷却后，离心(转速4500转/min，10min)，得水不溶物(即沉淀物)60g。水不溶物以200mL的石油醚洗涤3次，抽滤，得石油醚不溶物39g，即为番石榴叶提取物。经测定，总三萜酸的质量含量为73％。

实施例3、番石榴叶提取物的制备

干燥的番石榴(Psidium guajava L.)(产于广东从化)叶2.0kg，粉碎后过20m目筛，用95％乙醇25L渗滤提取，滤出提取液，减压浓缩至干称重356g，然后加入约8L的水，煮沸15-20分钟，冷却后，离心(转速4500转/min，10min)，得水不溶物(即沉淀物)129g。水不溶物以300mL的石油醚洗涤3次，抽滤，得石油醚不溶物87g，在石油醚不溶物中加170ml的无水乙醇，再加1g的活性炭，回流脱色30分钟，乘热过滤，将滤液蒸干得淡黄色粉末65g，即为番石榴叶提取物。经测定，总三萜酸的质量含量为87％。

实施例4、新化合物的分离、以及理化和光谱数据

(1)番石榴叶20kg，粉碎成粗粉，95％乙醇渗漉提取，减压回收溶剂至无醇味，得浸膏约1.5kg。浸膏加少量水混悬，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，得到石油醚部位200g、氯仿部位300g和正丁醇部位300g。对氯仿部位进行硅胶柱层析分离，用氯仿-甲醇(100∶0→50∶50)梯度洗脱得到12个馏分(C1-C12)，馏分C5分别经过硅胶柱和Sephadex LH-20柱分离，得到化合物PG-4(3.0mg)PG-5(15.0mg)和PG-6(11.0mg)。

(2)2α，3β-dihydroxy-taraxer-20-en-28-oic acid(psiguanin A)的结构鉴定

白色粉末，mp 262-264℃；IR(KBr)，cm^-1：3404，2949，1767，1636，1133，930；HR-ESI-MS m/z：495.3427[M-H]^-(calcd for C₃₀H₄₈O₄，471.3474)；¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：0.94，0.98，0.99，1.00，1.03，1.60(each s，6×CH₃)，1.00(3H，d，J＝6.5Hz，CH₃)，2.89(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，3.63(1H，m，H-2)，5.24(1H，d，J＝6.8Hz，H-21)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：49.2(C-1)，69.8(C-2)，84.5(C-3)，40.4(C-4)，56.9(C-5)，19.5(C-6)，35.4(C-7)，42.2(C-8)，52.1(C-9)，39.5(C-10)，22.9(C-11)，34.1(C-12)，40.5(C-13)，43.1(C-14)，28.7(C-15)，30.2(C-16)，50.0(C-17)，50.2(C-18)，38.6(C-19)，144.1(C-20)，118.3(C-21)，39.0(C-22)，29.1(C-23)，17.2(C-24)，18.1(C-25)，16.7(C-26)，15.2(C-27)，180.0(C-28)，23.9(C-29)，22.1(C-30)。

(3)2α，3β，12α，13β-tetrahydroxy-urs-28-oic acid(psiguanin B)的结构鉴定

白色粉末，mp＞300℃；IR(KBr)，cm^-1：3376，2948，2879，1767，1647，1458，1392，1218，1050，930；HR-ESI-MS m/z：529.3036[M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₅₀O₆Na，529.3505)；¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：0.90，1.10，1.17，1.24，1.38(each s，5×CH₃)，0.87(3H，d，J＝6.4Hz，CH₃)，1.30(3H，d，J＝6.4Hz，CH₃)，3.41(1H，d，J＝9.4Hz，H-3)，4.16(1H，br s，H-2)，4.30(1H，d，J＝3.7Hz，H-12)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：47.5(C-1)，68.9(C-2)，83.9(C-3)，39.9(C-4)，56.0(C-5)，20.4(C-6)，32.4(C-7)，44.5(C-8)，48.8(C-9)，38.3(C-10)，31.7(C-11)，76.3(C-12)，91.7(C-13)，41.6(C-14)，24.4(C-15)，21.7(C-16)，48.2(C-17)，60.7(C-18)，39.9(C-19)，34.9(C-20)，29.0(C-21)，38.1(C-22)，28.8(C-23)，16.9(C-24)，19.3(C-25)，21.7(C-26)，20.2(C-27)，177.2(C-28)，19.9(C-29)，20.9(C-30)。

(4)2α，3β，12β，13α-tetrahydroxy-urs-28-oic acid(psiguanin D)的结构鉴定

白色粉末，mp＞300C；IR(KBr)，cm^-1：3386，2950，1768，1462，1391，1050，930；HR-ESI-MS m/z：529.3036[M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₅₀O₆Na，529.3505)；¹HNMR(400MHz，C₅D₅N)δ：0.97，1.09，1.26，1.29，1.31(each s，5×CH₃)，0.90(3H，d，J＝6.5Hz，CH₃)，1.33(3H，d，J＝6.5Hz，CH₃)，3.43(1H，d，J＝9.4Hz，H-3)，4.06(1H，br s，H-2)，4.11(1H，br s，H-12)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：47.7(C-1)，68.7(C-2)，83.8(C-3)，39.9(C-4)，56.2(C-5)，18.3(C-6)，32.5(C-7)，43.2(C-8)，45.6(C-9)，38.3(C-10)，30.6(C-11)，63.0(C-12)，96.4(C-13)，44.2(C-14)，29.2(C-15)，23.7(C-16)，47.5(C-17)，61.8(C-18)，39.8(C-19)，40.4(C-20)，30.8(C-21)，35.9(C-22)，29.2(C-23)，17.5(C-24)，18.8(C-25)，19.9(C-26)，19.3(C-27)，178.0(C-28)，20.6(C-29)，20.7(C-30)。

实施例5、动物急性毒性试验

健康雄性ICR小鼠(7周龄，购自广东省医学实验动物中心(合格证号SCXK(粤)2003-2002))，体重18-22克，用0.3％羧甲基纤维素水溶液配制番石榴叶提取物(实施例1)悬液，用之前超声混匀，灌胃番石榴叶提取物每天5.0g/kg，连续一周，未见小鼠死亡。

实施例6、番石榴叶提取物对II型糖尿病大鼠的作用

试验方法：

将90只雄性SD大鼠(4周龄清洁级，体重150～180g，由广东省医学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(粤)2008-0002))随机分为正常对照组12只和糖尿病模型组78只，正常组给予基础饲料，模型组给予高脂饲料(猪油18％，蔗糖20％，蛋黄3％，基础饲料59％)。喂养4周后，禁食12h后，用0.1mmol·L^-1枸橼酸钠缓冲液(pH＝4.2)将STZ(链脲佐菌素)配成2％的溶液，按35mg·kg^-1腹腔注射，一周后测大鼠2h葡萄糖耐受量(禁食12h，灌胃给予2g·kg^-1的葡萄糖，测灌胃后2h的血糖)，筛选血糖值大于11.1mmol·L^-1的大鼠确定为DM大鼠。稳定一周后将成模的DM大鼠60随机分为5组，即番石榴叶提取物高剂量组(200mg·kg^-1)、中剂量组(100mg·kg^-1)、低剂量组(50mg·kg^-1)、正钒酸钠组(6mg·kg^-1)、模型组(生理盐水2ml·kg^-1)，每组各12只。每天灌胃给药1次，连续6周。每周末称量体重1次，根据体重调整给药剂量。于实验结束前1天，大鼠禁食12h，取血测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)，计算胰岛素敏感指数(ISI)。ISI为空腹血糖与空腹胰岛素乘积的倒数，分析时取自然对数。

试验结果：

表1.番石榴叶提取物对糖尿病大鼠FBG、FINS及ISI的影响(X±s，n＝9)

^#p＜005，^##p＜001，模型组vs正常对照组；^*p＜005，^**p＜001，给药组vs模型组。

与正常对照组比较，模型组空腹血糖水平显著升高(p＜0.01)，空腹胰岛素和胰岛素敏感指数显著降低(p＜0.05，或p＜0.01)。与模型组相比，番石榴叶提取物随着剂量增加，可显著降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高胰岛素水平和胰岛素敏感指数(p＜0.05，或p＜0.01)。

表2.番石榴叶提取物对糖尿病大鼠GSP的影响(X±s，n＝9)

^##p＜001，模型组vs正常对照组；^**p＜001，给药组vs模型组。

与正常对照组比较，模型组GSP显著升高(p＜0.01)；正钒酸钠组和番石榴叶提取物各剂量组的GSP与模型组相比均明显下降(p＜0.01)。

表3.番石榴叶提取物对糖尿病大鼠TG、TCH、FFA的影响(X±s，n＝9)

^#p＜0.05，^##p＜0.01，模型组vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01，给药组vs模型组。

与正常对照组比较，模型组TG、TCH及FFA显著升高(p＜0.01)；正钒酸钠组、番石榴叶提取物高、中、低剂量组与模型组比较，其TG、TCH及FFA均显著降低，具有统计学意义(p＜0.05，或p＜0.01)。

表4.番石榴叶提取物对糖尿病大鼠AST、ALT及肝指数的影响(X±s，n＝9)

^##p＜001，模型组vs正常对照组；^*p＜005，^**p＜001，给药组vs模型组。

与正常对照组比较，模型组AST、ALT及肝指数显著升高(p＜0.01)；正钒酸钠组、番石榴叶提取物高、中、低剂量组与模型组比较，其ALT及肝指数均显著降低，具有统计学意义(p＜0.05，或p＜0.01)，AST有降低趋势，但没有统计学意义。

表5.番石榴叶提取物对糖尿病大鼠AST、ALT及肝指数的影响(X±s，n＝9)

^#p＜0.05，^##p＜0.01，vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01，vs模型组。

与正常对照组比较，模型组和正钒酸钠组血清Cr、BUN及肾指数显著升高(p＜0.05，或p＜0.01)。FSL与模型组比较，其Cr有降低的趋势，但无统计学意义；番石榴叶提取物高剂量组可显著降低BUN及肾指数(p＜0.05)。

实施例7、番石榴叶提取物对I型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

试验方法：

取60只小鼠(7周龄雄性ICR小鼠，购自广东省医学实验动物中心(合格证号SCXK(粤)2003-2002))，体重22-25g，除10只作为正常对照组外，其余小鼠均腹腔注射100mg/kg链脲佐菌素溶液，72小时后测血糖值，11.1mmol/L以上者进行实验，随机分为5组，即：模型组(生理盐水10ml·kg^-1)、正钒酸钠组(50mg·kg^-1)和番石榴叶提取物低、中、高剂量组(200mg·kg^-1、400mg·kg^-1、800mg·kg^-1)。每组10只，每天灌胃(ig)1次，连续给药30d，每7d称体重1次，根据体重调整给药量；分别于第10，20，30d末次灌胃2h后(禁食12h)，小鼠尾部取血测血糖值。正常对照组及模型对照组灌胃给予等量生理盐水。

试验结果：

表6番石榴叶提取物对STZ诱发的糖尿病模型小鼠空腹血糖的影响

^##＜0.01，模型组vs正常对照组；^**P＜0.01，给药组vs模型组。

模型组小鼠与正常对照组相比，血糖水平明显升高，说明链脲佐菌素造成糖尿病小鼠模型成功。番石榴叶提取物低、中、高剂量(200mg·kg^-1、400mg·kg^-1、800mg·kg^-1)均有明显的降血糖作用，在第10d血糖已明显降低，第20d、30d血糖较第10d有所降低，与模型组具有显著性差异(P＜0.01)。以上实验结果表明，番石榴叶提取物对链脲佐菌素糖尿病小鼠的空腹血糖水平具有明显的改善作用。

实施例8、番石榴叶提取物对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖和脂肪酸代谢的影响

试验方法：

脂肪细胞葡萄糖消耗量的测定：

将3T3-L1前脂肪细胞(购自中国医学科学院细胞中心)转入96孔板中，调整细胞密度为5×10⁶mL^-1，诱导分化后，分为7组，即溶媒对照组(1‰DMSO)、番石榴叶提取物组(1、3、10、30、100μg·L^-1)、正钒酸钠组(10μM)，每组6个复孔，实验重复三次。培养12h后，更换培养基并加药物进行干预，药物作用于96孔板中的细胞24小时，葡萄糖试剂盒GOD-POD法(葡萄糖氧化酶法)检测上清液中葡萄糖的浓度，用对照组的葡萄糖浓度减去不同给药组葡萄糖的浓度计算出葡萄糖的消耗量。

脂肪细胞游离脂肪酸的测定：

将3T3-L1前脂肪细胞(购自中国医学科学院细胞中心)转入96孔板中，调整细胞密度为5×106mL^-1，诱导分化后，分为6组，即溶媒对照组(1‰DMSO)、番石榴叶总三萜酸组(3、10、30、100μg·L^-1)、正钒酸钠组(10μM)，每组6个复孔。每组均加20nmol·L^-1胰岛素，药物作用于3T3-L1脂肪细胞24小时，酶联免疫吸附法测培养上清液中游离脂肪酸(FFA)的浓度。

试验结果：

表7番石榴叶提取物对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响(X±s，n＝6)

与溶媒对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与不含胰岛素组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01。

与溶媒对照组相比，番石榴叶提取物和正钒酸钠均能显著增加3T3-L1脂肪细胞24h葡萄糖消耗。在3-100μg·L^-1剂量范围，FSL随着浓度增加，葡萄糖消耗量逐渐增加，呈一定的剂量依赖性。胰岛素能刺激脂肪细胞对葡萄糖的利用，与不含胰岛素各组相比，胰岛素刺激组的葡萄糖消耗量显著增加(P＜0.05或P＜0.01)。番石榴叶提取物在3-100μg·L^-1剂量时均显著增加胰岛素刺激下脂肪细胞葡萄糖的消耗量。

表8番石榴叶提取物对3T3-L1脂肪细胞游离脂肪酸产生的影响(X±s，n＝6)

与溶媒对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

番石榴叶提取物在10-100μg·L^-1剂量范围干预24小时，能显著减少脂肪细胞游离脂肪酸(FFA)的产生，与溶媒对照组相比有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；其中番石榴叶提取物100μg·L^-1时其游离脂肪酸的含量仅为溶媒对照组47.2％。正钒酸钠亦能显著减少脂肪细胞游离脂肪酸的产生(P＜0.01)。

实施例9、番石榴叶提取物的胶囊剂的制备

把本发明番石榴叶提取物(实施例1)100g和微粉硅胶200g充分混合均匀，过筛，加入适量的硬脂酸镁，混匀，用干法造粒机制粒，过筛，筛取40-80目之间的颗粒，装入胶囊，每粒装0.3g。

实施例10、番石榴叶提取物的片剂的制备

把本发明番石榴叶提取物(实施例1)200g和微粉硅胶30g、羟丙纤维素120g混合均匀，用10％预胶化淀粉浆作为粘合剂，湿法造粒，烘干，加入适量的硬脂酸镁混合，压制成2000片片剂。

实施例11、番石榴叶提取物中三萜酸的HPLC检测方法

乌苏酸、2α-羟基乌苏酸、积雪草酸、2α，3β-dihydroxy-taraxer-20-en-28-oicacid、2α，3β，12α，13β-tetrahydroxy-urs-28-oic acid及2α，3β，12β，13α-tetrahydroxy-urs-28-oic acid等6个三萜酸为本发明番石榴叶总三萜酸的主要有效成分，可以作为质量控制的指标成分。按重量百分比计，番石榴叶总三萜酸的含量应大于50％。采用高效液相色谱法(HPLC-ELSD)进行分析，色谱柱为Agilent EclipseXDB-C18柱(4.6x250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1％甲酸水溶液(80∶20)，流速1.0ml/min，柱温30℃，采用Agilent 1200Series HPLC泵，Agilent 1200Series自动进样器，紫外光检测器，检测器漂移管和LTA温度设置为100℃，氮气流速为3.0L/min，喷雾器体压力为0.4MPa。乌苏酸、2α-羟基乌苏酸、2α，3β-dihydroxy-taraxer-20-en-28-oic acid、积雪草酸、2α，3β，12α，13β-tetrahydroxy-urs-28-oic acid及2α，3β，12β，13α-tetrahydroxy-urs-28-oic acid的保留时间分别为34.8、16.8、15.7、5.9、4.9和4.7min。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。