抗禽流感病毒剂及含有抗禽流感病毒剂的产品

摘要

一种抗禽流感病毒剂，含有作为活性成分的组分，所述组分使用主要由水和亲水性有机溶剂的至少一种的组成的萃取溶剂从番石榴中萃取的番石榴提取物经过高效液相色谱(HPLC)在特定条件下分离而获得。所述特定条件包括使用ODS柱，所述番石榴提取物施加至ODS柱后的15分钟内以甲醇的浓度为20％的水-甲醇混合物作为流动相洗脱，随后的15到30分钟期间使用甲醇浓度为40％的水-甲醇混合物作为流动相。供选地，特定条件还包括所述番石榴提取物施加至ODS柱后的第30到45分钟时间内使用甲醇浓度为60％的水-甲醇混合物作为流动相。包含在抗禽流感病毒剂中的组分在番石榴提取物施加到ODS柱后第20分钟内或在随后的第20到35分钟期间内从该柱洗脱。

说明书

技术领域

本发明涉及抗禽流感病毒剂和含有抗禽流感病毒剂的产品。

背景技术

禽流感病毒为流感病毒A的通用名，主要感染鸟类，野生水鸟为其天然的宿主。一些禽流感病毒感染家禽，例如鸡、鹌鹑和火鸡，导致高致病性感染。养鸡业正面临着来自这些高致病性禽流感病毒的全球性威胁。

尽管已经开展了对预防禽流感病毒感染的疫苗的开发和研究(见例如，专利文献1)，目前尚没有能完全预防禽流感病毒感染的疫苗。所以当禽流感病毒感染实际爆发时，实际采取的措施是立即消灭爆发点几公里半径内家禽。H5N1亚型病毒是一种禽流感病毒的亚型，已经有报导人在与大量病毒接触或由于宿主的易感染的体质而出现H5N1亚型病毒的感染。

现有技术文献

专利文献1：日本国家阶段专利特许公开号：2008-515906

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明的发明人进行了多项研究，结果发现：得自番石榴提取物的组分具有抗禽流感病毒作用。本发明基于该发现完成。本发明的目的是提供具有良好的抗禽流感病毒作用的抗禽流感病毒剂和含有该抗禽流感病毒剂的产品。

解决该技术问题的手段

为实现上述目的，本发明的一个方面提供了抗禽流感病毒剂，其含有作为活性成分的组分，所述组分使用主要由水和亲水性有机溶剂的至少一种的组成的萃取溶剂从番石榴中提取的番石榴提取物经过高效液相色谱(HPLC)在特定条件下分离而获得。特定条件包括使用内径20mm和长度250mm的ODS柱，在番石榴提取物施加至ODS柱后的15分钟内以甲醇浓度为20％的水-甲醇混合物作为流动相，随后的15到30分钟使用甲醇浓度为40％的水和甲醇混合物为流动相，流动相的流速为10mL/min。包含在抗禽流感病毒剂中的该组分在番石榴提取物施加至ODS柱后的第20分钟内从ODS柱中洗脱。

本发明的另一方面提供了抗禽流感病毒剂，其含有作为活性成分的组分，所述组分在番石榴提取物施加至ODS柱后的第20到35分钟时间内从ODS柱洗脱，其中特定条件还包括在番石榴提取物施加至ODS柱后的第30到45分钟使用含有甲醇浓度为60％的水-甲醇混合物作为流动相。

本发明的又一方面提供了包含抗禽流感病毒剂的产品，该产品含有上述抗禽流感病毒剂。

本发明的技术效果

本发明提供具有良好的抗禽流感病毒作用的抗禽流感病毒剂和含有抗禽流感病毒剂的产品。

附图说明

图1(a)显示用于分离番石榴提取物的高效液相色谱的流动相的梯度曲线图；

图1(b)为番石榴提取物的高效液相色谱分离获得的HPLC图谱；

图2(a)为用于样品A到F和样品Mx的高效液相色谱分析中的流动相的梯度曲线图；

图2(b)为样品Mx的高效液相色谱分析获得的HPLC图；

图2(c)为样品A的高效液相色谱分析获得的HPLC图；

图2(d)为样品B的高效液相色谱分析获得的HPLC图；

图3(a)为样品C的高效液相色谱分析获得的HPLC图；

图3(b)为样品D的高效液相色谱分析获得的HPLC图；

图3(c)为样品E的高效液相色谱分析获得的HPLC图；

图3(d)为样品F的高效液相色谱分析获得的HPLC图；和

图4(a)和4(b)为显示病毒样品混合物中番石榴提取物的组分浓度与测量的荧光强度之间的关系的图。

具体实施方式

将在下文中详细描述本发明的一个实施方式。

根据该实施方式的抗禽流感病毒剂含有作为活性成分的组分，使用特定的萃取溶剂从番石榴(Psidium Guajava Linn)提取的番石榴提取物在特定的条件下通过高效液相色谱分离时，经特定的洗脱时间而获得该组分。

番石榴，在日本也称banjiro或banzakuro，是一种原产于热带地区的桃金娘科的番石榴属常绿小乔木。番石榴自然生长在，例如，加勒比海沿岸、中美洲、南美洲北部和东南亚，种植在温暖的地方，例如日本的冲绳岛。

可使用番石榴的任何器官或任何器官的组分作为用于番石榴提取物的提取原料。提取原料可以是番石榴的单个器官或其组分或番石榴的两种或更多种器官或其组分的组合物。为获得具有良好的抗禽流感病毒作用的番石榴提取物，提取原料优选至少含有番石榴的叶或茎。

用于提取的原料在如下状态时进行提取操作：收获后状态，收获后破碎、粉碎、或研磨状态，收获后干燥状态，收获干燥后破碎、粉碎、或研磨状态，收获后破碎、粉碎、或研磨再干燥的状态。为有效进行萃取，用于提取的原料优选是破碎的。为获得具有良好的抗禽流感病毒作用的番石榴提取物，用于提取的原料优选为原叶。

用于从原材料中提取番石榴提取物的萃取溶剂主要由水和亲水性有机溶剂的至少一种组成。即萃取溶剂中的水和亲水性有机溶剂的至少一种以最高比例存在(体积％)。萃取溶剂中水或亲水性有机溶剂的含量优选为50体积％或更高，更优选为70体积％或更高。当萃取溶剂同时含有水和亲水性有机溶剂时，水和亲水性有机溶剂的总含量优选为50体积％或更高，更优选为70体积％或更高。

萃取溶剂中亲水性有机溶剂的实例包括低级醇(例如甲醇和乙醇)、丙酮和乙酸乙酯。萃取溶剂可仅含有一种亲水性有机溶剂或两种或更多种亲水性有机溶剂。萃取溶剂可包含少量的除了水和亲水性有机溶剂外的溶剂。可在萃取溶剂中溶解有，例如，有机盐、无机盐、缓冲剂或乳化剂。

通过将用于提取的原料浸入到萃取溶剂中预定的时间进行番石榴提取物的萃取。此时若有必要，可搅拌、加热或加压提取溶剂。总的说来，当提取温度升高，萃取需要的时间就减少。例如，当在室温、1到2个大气压下，萃取时间长达10天，在50到130℃下萃取仅需0.05到2小时或者0.1到0.3小时。萃取条件可根据用于提取的原料的状况或萃取溶剂的种类做适当改变。

从原料萃取的番石榴提取物经过固-液分离以分离和除去提取用的原料的残余物。例如，可通过已知的方法例如过滤或离心进行固-液分离。

通过固-液分离除去固体，随后番石榴提取物经过高效液相色谱在特定条件下分离。在高效液相色谱分离中使用内径为20mm和长度为250mm的ODS柱。ODS柱用固相填充，例如，表面用含有18个碳原子的十八烷基硅烷基团修饰的化学键合多孔球形硅胶。ODS柱可为，例如，YMC Co.，Ltd.生产的SH-343-5(硅胶颗粒大小为5μm，缝直径为12nm)。使用水和甲醇的混合溶剂作为流动相。当番石榴提取物施加至ODS柱后，混合溶剂中的甲醇浓度随着预定时间按照图1(a)所示的梯度曲线分步改变。具体地，在番石榴提取物施加至ODS柱后15分钟时间内(0到15分钟)混合溶剂的甲醇浓度为20％，接下来的15到30分钟时间内为40％，再接下来的30到45分钟时间内为60％。流动相的流速设定为10mL/min，柱温优选为室温(25℃)。

本实施方式的抗禽流感病毒剂含有作为活性成分的组分，该组分在番石榴提取物施加至ODS柱后20分钟(0到20分钟)的第一个时间段内从ODS柱洗脱的组分，或在接下来的20到35分钟的第二个时间段内从ODS柱洗脱的组分。抗禽流感病毒剂可以是在第一个时间段或第二个时间段从ODS柱洗脱的洗脱液，或是通过已知的干燥处理例如冷冻干燥将洗脱液粉末化获得的产物。粉末化第一个时间段的洗脱液获得的产物为棕红色，微粘，而粉末化第二个时间段的洗脱液获得的产物为棕红色，粉末状。

抗禽流感病毒剂可施加到用于抗禽流感病毒作用的产品中。这种包含抗禽流感病毒剂的产品的实例包括医疗剂(包括药品)、清洁剂、化妆品、医疗器械、卫生材料、卫生用品、食品和饮料。医药剂的示例包括药品。清洁剂的实例包括衣物软化剂、衣物漂白剂、香皂、沐浴剂、洗涤剂、洗发水和牙膏。化妆品的实例包括洗脸香皂，洗手香皂、手霜、香水、洗剂、乳状洗剂、美容精华液(beauty essence)、美容霜、唇膏、唇油、和粉饼。医疗器械的示例包括口罩、绷带、纱布、手套、胶布、棉签、诊断仪器及器械、手术仪器及器械、治疗仪器及器械、医院仪器及器械、牙科仪器及器械、辅助医疗器械、和矫形器。卫生材料的实例包括纱布、脱脂棉、无纺布面料、棉签棒。卫生用品的实例包括加湿器、空调、空气清洁器。食品和饮料的实例包括健康医疗和健康食品。医药剂和化妆品也包括类似药物例如漱口水、润喉糖、润喉喷剂、医疗肥皂和防腐剂。

含有抗禽流感病毒剂的药物和类药物可以任何方法给药，例如口服给药、血管内给药、经皮给药。药物和类药物的剂型可以是，但不限于例如，粉末、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、溶液、注射或搽剂。在不妨碍实现本发明的目的的前提下，药物和类药物可含有添加剂例如辅料、基质、乳化剂、溶剂和稳定剂。

含有抗禽流感病毒剂的食物和饮料通过将抗禽流感病毒剂加入到任意食品原料或饮料原料制备。食品和饮料的制备形式，例如，粉末、片剂、颗粒、液体(饮用制剂等)、胶囊、糖浆、棒棒糖可用于健康食品和饮食补充食品。食品和饮料的具体实例包括运动饮料、从茶叶、草药、及类似物中提取的茶饮料、饮食产品例如牛奶和酸奶、含有胶凝剂的食品例如果胶和卡拉胶、棒棒糖例如硬棒棒糖、软棒棒糖和橡皮糖、口香糖，含有糖的食品和饮料例如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、和糊精、调味剂、甜味剂例如甜菊、阿司帕坦、和糖醇、和油脂例如植物油和脂肪和动物油和脂肪。在不妨碍实现本发明的目的的前提下，食品和饮料可含有添加剂例如基质、赋形剂、添加剂、子材料(sub material)和膨胀剂。

禽流感病毒根据血凝素和神经氨酸酶的类型分为亚型例如H5N3、H5N1、H5N7、H5N2、和H7N3，本实施方式的抗禽流感病毒剂可用于抗任何禽流感病毒。

根据本实施方式，可获得以下优点：

本实施方式的抗禽流感病毒剂具有良好的抗禽流感病毒作用。因此抗禽流感病毒剂可用于治疗感染禽流感病毒的家畜(包括家禽)，以及感染了禽流感病毒的人，还可用于预防健康家畜(包括家禽)以及人被禽流感病毒感染。即，抗禽流感病毒剂用作预防和治疗禽流感病毒的制剂。

由于本实施方式的抗禽流感病毒剂提取自天然植物番石榴，本实施方式的抗禽流感病毒剂具有高度的安全性。

上述实施方式可如下改变。

抗禽流感病毒剂可以是用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理在第一个时间段内(番石榴提取物施加到ODS柱后20分钟内)洗脱自ODS柱的洗脱液而获得产品，或用聚乙烯聚吡咯烷酮处理在第二个时间段内(接下来的20到35分钟的时间段内)洗脱自ODS柱的洗脱液而获得的产品。在这种情况下，可除去吸附到聚乙烯聚吡咯烷酮的组分。

在下文中，将参照实施例更加具体地说明本发明。

实施例

<抗禽流感病毒剂的制备>

1kg番石榴原叶(raw leaves)切成大约1平方厘米的片，在室温下浸入到10L含有乙醇和水比例为3∶7乙醇水溶液中10天。然后，将通过过滤该溶液得到的滤液浓缩和干燥以得到65.1g粉末状番石榴提取物。将6.5g该番石榴提取物溶解到50mL含有乙醇和水的比例为2∶1的乙醇水溶液中。获得的溶液在3000rpm离心15分钟。然后，上清液通过Advantec MFS Inc.生产的孔径为0.80μm的醋酸纤维素过滤器(DISMIC-25CS080AN)过滤，收集滤液作为分离用的样品。然后，该分离用样品用高效液相色谱在以下条件下分离：

(高效液相色谱分离条件)

柱：YMC Co.，Ltd.生产的SH-343-5(柱的内径和长度分别为20mm和250mm，硅胶颗粒大小为5μm，缝直径为12nm)。

流动相：水-甲醇混合物为流动相，其中在番石榴提取物施加到该色谱柱后的15分钟内(0到15分钟)使用甲醇的浓度为20％的水和甲醇混合物为流动相，然后在接下来的15到30分钟使用甲醇浓度为40％的水和甲醇混合物为流动相，接下来的30到45分钟时间内使用甲醇浓度为60％的水和甲醇混合物为流动相，再接下来的45到50分钟内甲醇浓度为100％的水和甲醇混合物为流动相(见图1(a))。

流动相流速：10mL/min

柱温：室温(25℃)

检测波长：255nm

在该时间内获得的HPLC图如图1(b)所示。分离用的样品施加至色谱柱后在不同的时间，即不同的洗脱时间，得到了6个级分。更具体地，洗脱液在分离用的样品施加至色谱柱后的20分钟的时间内(0到20分钟)、在接下来的20到35分钟时间内、在接下来的35到39分钟时间内、在接下来的39到41分钟时间内、在接下来的41到43分钟时间内、在接下来的43到50分钟时间内分别收集，并将获得的该6个级分浓缩和干燥以得到如表1所示的6个粉末A到F。

表1

  粉末  洗脱时间(min)  收率(mg)  A  0-20  2796  B  20-35  780  C  35-39  11  D  39-41  135  E  41-43  157  F  43-50  33

粉末A到F溶解在乙醇水溶液(10到90％)中，浓度为0.5％w/v，以制备样品A到F。类似地，前述得到的粉末状番石榴提取物溶解到乙醇水溶液(10到90％)中，浓度为0.5％w/v，以制备样品Mx。样品A到F和样品Mx用高效液相色谱在以下条件下分析：

(高效液相色谱分析条件)

柱：Imtakt公司生产的Cadenza CD-C18(CD006：内径4.6mm，长度250mm，粒径3μm)。

流动相：当样品施加到该色谱柱后10分钟(0到10分钟)流动相为甲醇浓度10％及乙酸浓度为5％的水-乙酸-甲醇混合物，在接下来的10到20分钟时间内水-乙酸-甲醇混合物中甲醇浓度从10％线性逐渐增加到35％，在接下来的20到40分钟内为甲醇浓度35％和乙酸浓度5％的水-乙酸-甲醇混合物，在接下来的40到50分钟时间内水-乙酸-甲醇混合物中甲醇浓度从35％线性逐渐增加到100％，且在接下来的50到60分钟为100％甲醇(见图2(a))。

流动相流速：0.6mL/min

柱温：40℃

检测波长：MaxPlot(190to 800nm)，250nm，280nm

本分析中获得的HPLC图如图2(b)到2(d)和3(a)到3(d)所示。更具体地，图2(b)显示样品Mx的HPLC图，图2(c)显示样品A的HPLC图，图2(d)显示样品B的HPLC图，图3(a)显示样品C的HPLC图，图3(b)显示样品D的HPLC图，图3(c)显示样品E的HPLC图，图3(d)显示样品F的HPLC图。

<抗禽流感病毒作用测试>

上述样品A到F和样品Mx的抗禽流感病毒作用通过下述过程评价。

首先，MDCK细胞(犬肾上皮细胞)在96-孔培养皿中用含有7％FBS的MEM培养液在CO₂培养箱中培养，温度为37℃，培养2天以形成单层MDCK细胞。禽流感病毒(H5N3：A/鸭/313/4/78病毒)的病毒原液用无血清培养液(SF-MEM)稀释以制备0.7HAU的病毒液。病毒液与等体积的各稀释液混合，该稀释液由无血清培养液(SF-MEM)将每个样品A～F和样品Mx稀释25倍、100倍、400倍、1600倍、6400倍、和25600倍(接种浓度成倍)获得，并将混合液在4℃下静置1小时以制备病毒样品混合物。将各个病毒样品混合物100μL接种到在96孔培养板中生长的单层MDCK细胞中，在34℃下CO₂培养箱中进行感染处理。1小时后移去病毒样品混合物，用无血清培养液(SF-MEM)洗涤培养板中的培养细胞。

然后，各个样品A到F和样品Mx用含有2.5μL的乙酰胰蛋白酶的无血清培养液(SF-MEM)稀释50倍、200倍、800倍、3200倍、12800倍和51200倍。将各个获得的稀释液100μL加入到用含有与上述浓度相同的番石榴提取物组分的病毒样品混合物接种后的MDCK细胞中，培养板置于为34℃的CO₂培养箱中。在18小时，加入50μL甲醇到每个孔中，并将培养皿置于室温1分钟以固定化(immobilize)MDCK细胞。然后，用无血清培养液(SF-MEM)洗涤该细胞。然后，加入抗-核蛋白-单克隆抗体(4E6)到每个孔中，培养板在室温下静置45分钟，再用无血清培养液(SF-MEM)洗涤该细胞。然后，加入抗-鼠IgG抗体标记的β-半乳糖苷酶(0.1％Block Ace)到每个孔中，并将培养板在室温下静置45分钟。

然后，加入40μM-甲基-7-羟基重豆素(MU)-Gal(4-methyumbelliferone (MU)-Gal)(含有50μM MgCl₂)到每个孔中，培养板在37℃下保持45分钟。在这个时间内，抗-鼠IgG抗体标记的β-半乳糖苷酶使用MU-Gal作为底物产生荧光4-甲基-7-羟基重豆素(MU)。然后，将100mM碳酸钠缓冲液(pH 10.6)加入到各个孔中以终止反应，感染病毒的细胞的数量通过测定产生的MU数量间接测定。产生的MU的量使用荧光检测器在355nm激发波长和460nm荧光波长(检测波长)下测定。图4(a)和4(b)显示病毒样品混合物中得自番石榴提取物的组分的浓度与基于该测量获得的荧光强度之间的关系。计算每个样品的半有效浓度(EC₅₀)。结果见表2。

表2

  样品  EC₅₀(％w/v)  A  3.28×10^-5  B  3.52×10^-5  C  26.22×10^-5  D  33.52×10^-5

  E  22.31×10^-5  F  29.64×10^-5  Mx  5.37×10^-5

如表2所示，证实含有番石榴提取物的样品Mx具有高抗流感病毒作用。进一步地，在样品A到F中，样品A和B显示了特别高的抗流感病毒作用，证实粉末A和B在显示番石榴提取物的抗流感病毒作用中起到了关键作用。

<用聚乙烯聚吡咯烷酮处理的测试>

检测了聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理后的样品A和B的抗禽流感病毒作用的变化。PVPP具有吸附聚合多酚例如鞣酸的作用，样品A和B中含有的大多数多酚通过PVPP处理后除去。

首先，5.0g/L的PVPP加入到1mL每个样品A和B中，搅拌该混合物。混合物在10000rpm下离心5分钟，上清液经过Advantec MFS Inc.生产的孔径为0.80μm的醋酸纤维素过滤器(DISMIC-25CS080AN)过滤以收集滤液。上述获得的PVPP处理后的样品A和B和未经PVPP处理的样品A和B通过如下方法比较抗流感病毒作用。

首先，MDCK细胞(犬肾上皮细胞)在24-孔培养板中用含有7％FBS的MEM在CO₂培养箱中培养，温度为37℃，培养2天以形成单层MDCK细胞。禽流感病毒(H5N3：A/鸭/313/4/78病毒)的病毒原液用无血清培养液(SF-MEM)稀释以制备0.7HAU的病毒液。然后，经过PVPP处理的样品A和B和未经PVPP处理的样品A和B用无血清培养液(SF-MEM)稀释200倍，获得的每个稀释样品进一步用无血清培养液(SF-MEM)稀释25倍、100倍、400倍、1600倍、6400倍、和25600倍(接种浓度成倍)并与等体积的病毒液混合。获得的病毒样品混合物置于冰中1小时。然后，200μL各病毒样品混合物接种到生长在24孔培养板中的单层MDCK细胞中，感染的处理在34℃下的CO₂培养箱中进行。

1小时时，移除病毒样品混合物，用无血清培养液(SF-MEM)洗涤培养板中的培养细胞。然后，含有0.75％琼脂糖的MEM培养液覆盖在细胞上，然后将该细胞在34℃下的CO₂培养箱中培养3天。然后，将含有乙醇和乙酸比例为5∶1的乙醇-乙酸溶液加入到各个孔中，培养板放置过夜，终止感染，固定化MDCK细胞。然后，移除覆盖的培养液，用纯水和0.1％的TritonPBS溶液洗涤细胞，然后与原发抗体和二级抗体作用。然后，细胞用鞣酸溶液(DEPDA，4CN柠檬酸缓冲液，H₂O₂)处理，计数染成蓝色的斑(plaque)的数量以评估对禽流感病毒感染的抑制率。结果见表3。

表3

  样品  病毒抑制率(％)  未经PVPP处理的样品A  92.1  经过PVPP处理的样品A  95.1

  未经PVPP处理的样品B  99.7  经过PVPP处理的样品B  100

如表3所示，用PVPP处理的样品A和B的病毒抑制率并没有减少。结果表明样品A和B中含有的显示的抗禽流感病毒作用的组分不是聚合多酚，例如鞣酸。因此，用PVPP处理起到去除不显示抗禽流感病毒作用的组分的作用，从而增加了显示抗病毒作用组分的含量。