含有络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用药物组合物与所述级分的制备方法

摘要

本发明涉及含有络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分作为有效成分的炎症性疾病治疗及预防用药物组合物及其制备方法，更详细，则涉及炎症性疾病预防及治疗用组合物与所述级分的制备方法，所述组合物含有络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分(partition)作为有效成分，所述级分是被纯化及浓缩至含有0.05～12重量％作为指标物质的牛蒡苷元的提取物。

说明书

【技术领域】

本发明涉及含有络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用药物组合物与所述级分的制备方法。

【背景技术】

一般，关节炎作为医学地总括由如细菌或外伤的任何的原因而在关节内发生的炎症性变化而指称的病名，这样的关节炎根据炎症的持续期间而大地被分为急性与慢性。

此时，急性关节炎如下分类(斗山百科辞典)。

浆液性关节炎一般由外伤而发生，然而也有原因不明的，且大概只在一个关节发生。

浆液纤维素性关节炎在急性类风湿性关节炎时发生，然而在关节腔内积浑浊的渗出液，并一般产生纤维素的伪膜而有炎症消也留下严重的运动障碍的特性。

化脓性关节炎在关节的开放创或如淋病，伤寒，猩红热，败血症的传染病呈现多发性，然而在出生后1～2个月的幼儿中引起骨严重地伤而不可治疗的脱臼，而在成人中，则多患骨膜骨髓炎而化脓部破裂而脓进入关节，将其称作2次化脓关节炎。

慢性关节炎如下分类。

特殊性炎症是指由于在结核性梅毒性或中年以后的男子中多的尿酸的代谢障碍的痛风性关节炎，而多发性关节炎多由慢性类风湿性关节炎，然而从急性浆液性关节炎移行，或在结核，梅毒，淋病的过程中也呈现为多发性，且也有作为败血症之一的。

此外，也包括被称为斯蒂尔病的关节炎。

变形性骨关节炎以骨或关节的老化或外伤作为原因而发病，而血友病性关节炎则因患血友病时关节内的出血。

以由如所述的关节炎为代表的炎症性变化的疾病的治疗作为目的而开发出多的药剂。

络石藤(Trachelospermi caulis)也称作白花藤，且是夹竹桃科的常绿藤木。长度生长至5米左右。花瓣是5个，深地分开而在5～6月开风车模样的白的花，且香气非常好。果实在9～11月结。2个长长的果实常常结的模样示人字，然而也间或成像镯一样圆的圆形而引起感叹。实际上，络石藤在韩国南部地区海岸或山麓与平野，荒地生长，并一般牵藤于岩石或墙壁，其他别的树或植物而延伸出，并生长。在络石藤多之处，则别的草完全不能生长，并也有到处以络石藤覆盖之处。在北朝鲜发行的′东医学词典′记作′络石藤′是将白花藤的茎与叶弄干之物。味苦，并性质略寒。作用于心经络，肝经络，肾经络。消除风湿，并使经络良好通。用于肥胖症，四肢痉挛，腰痛，关节痛，扁桃炎，疮等。一天将5～10g用水熬而食用′。

向作为风湿性来的四肢麻痹痛，肌肉痉挛，不能良好屈身的症状将络石藤加五加皮，牛膝而使用。由于使血凉，所以向咽喉炎，脓肿等加水，并熬而服用。络石藤的果实称作络石果而采集在7月份熟的成熟的水果而使用，然而对于筋骨痛，则一天将6～12g用水熬而服用。主要使用叶与茎，然而可无关季节地无论何时采集而在太阳下晒而细切而使用。

在中国的′湖南药物志′，则记录为对于筋骨痛，将′络石藤′37～74g浸泡于酒而服用′，而在′江西草药′，则记作对于关节炎′将白花藤，五加皮根皮各37g，海索草根18.5g用水熬而以白酒服用′。络石藤弄干而一次将8～12g左右在200的水熬至3分之2左右减少时而服用就成。或浸泡于酒而吃，或作为粉而用。外用时磨成粉而拌匀而涂抹，或以将生叶捣的汁贴于患部，或洗涤就成。络石藤是治疗腰痛，并使筋骨健壮，且使关节顺的对于我们身体好的藤木。作为至今被知的络石藤的成分，则络石苷(Tracheloside)，牛蒡苷(Arctiin)，罗汉松树脂酚苷(Matairesinoside)，牛蒡苷元(Arctigenin)，Notracheloside等最广泛地被知。

历来，在东医宝鉴，乡药集成方及广济秘笈等的现成中药书或关联文献中将所述的络石藤作为单方生药开处方，但这样的处方不过是涉及络石藤的外形上的形态鉴别方法及中医学的药效与汤液的制备方法的简单的提及。即，未可得到涉及通过所述提示的方法而提取出的成分中表达药效的有效活性成分的意见。

对此，本发明人有以含有络石藤提取物的炎症性疾病预防及治疗用药剂的名称申请而以专利第0847439号登记的。

但是，一般地，在天然物质提取物的情况中，由于为示功效的有效用量偏高，并含有多样的成分，为制剂学地适用于药品，则有多种不便。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

从而，本发明旨在提供在络石藤提取物中以抗炎活性最优秀的组成纯化而浓缩的络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分的制备方法。

另外，另一目的在提供含有所述络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用药物组合物。

【解决课题的技术方案】

为解决如所述的问题而本发明以含有络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分(partition)作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用药物组合物作为其特征，所述级分是纯化及浓缩至含有0.05～12重量％作为指标物质的牛蒡苷元的提取物。

另外，为达成另一目的而本发明以包括下列阶段的络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分的制备方法作为再一特征：

(a)使络石藤干燥提取物溶解于水，并向所述裂解物加乙酸乙酯而混合而分离水层与乙酸乙酯层的阶段；

(b)将所述乙酸乙酯层分离及回收的阶段；及

(c)从所述回收的乙酸乙酯层中除去溶剂，并浓缩至含有0.05～12重量％作为指标物质的牛蒡苷元而收获抗炎活性级分的阶段；

以下，详细地说明本发明则如下。

此时，对于被使用的技术术语及科学术语，若无别的定义，则具有此发明所属的技术领域中普通技术人员常规地理解的含义。

另外，对于与以往相同的技术性的构成及作用的重复的说明就省略。

本发明开发使以往络石藤干燥提取物具有的抗炎症效果显著地改善的络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分(以下，络石藤乙酸乙酯级分)及其制备方法而可将其适用于药物组合物。

本发明中络石藤乙酸乙酯级分是指向络石藤干燥提取物加溶剂而分级分离(partition)而浓缩而收获的物质。此时，络石藤干燥提取物是指在分级分离前将络石藤用水或有机溶剂提取而干燥之物。

本发明中用于络石藤提取及分级分离的溶剂优选使用选自水或甲醇，乙醇，丁醇等的醇类。这是因为水与醇类符合于药典规定。

本发明中纯化络石藤乙酸乙酯级分时，优选施行层析(chromatography)。具体地，优选使用在极性移动相与非极性固定相或非极性移动相与极性固定相中分离的方法。更具体地，则优选反复地施行正相(normal phase)与逆相(reverse phase)层析而进一步提高纯化度。

本发明中正相层析是指基于硅胶的固定相，并逆相层析是指基于ODS(Octar-desil-silica)的固定相，具体地，则C-18ODS等，而此时，使用的移动相溶剂与用于固定相溶剂的溶剂作为对于本领于技术人员明晰的事项而省略具体的说明。

本发明中牛蒡苷元(Arctigenin)作为由分子式C21H24O6的分子量372组成的物质，是二苄基丁内酯配体(Dibenzylbutyroactone ligand)，且是在多种植物尤其菊花科中关于生理活性而活泼地被研究的物质之一，并牛蒡苷是指(Arctiin)作为由分子式C27H34O11的分子量534组成的物质，在多种植物中被发现，且带有牛蒡苷元的糖苷键合的形态的物质。

本发明作为络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分(partition)，应含有0.05～12重量％作为指标物质的牛蒡苷元，然而由于不足0.05重量％则药效的协同效果降低，而超过12重量％则追加步骤，并与生产单价增加相反，药效增加微小，优选使上述的指标物质的含量范围适用于制备步骤。常规地，则为制备单价及步骤的简单化而更优选为使作为指标物质的牛蒡苷元的含量以0.4～3.0重量％规格化而使用。另外，作为本发明的级分的再一指标物质，更优选为含有6～20重量％牛蒡苷。

根据本发明而提取纯化的络石藤乙酸乙酯级分也可使用其本身，但可与药学容许的载质(carrier)，赋形剂(forming agent)，稀释剂(dilute)等混合而制成粉末，颗粒，胶囊，软膏剂，经皮剂或注射剂等。另外，根据本发明的络石藤级分历来被用作食用及药用，对于其施用用量无特别限制，并体内吸收也可根据体重，患者的年龄，性别，健康状态，食饵，施用时间，施用方法，排泄率，疾病的严重度等而变化。但是，在功效性的方面，络石藤的乙酸乙酯级分优选以成人基准(60kg基准)施用100～1000mg/天左右。根据本发明的络石藤乙酸乙酯级分由于一般与络石藤提取物的功效相比而示约20～300％左右的优秀的效果，所以可适用于此而设定用量而施用。

从而，致使包括本发明的有效成分的药物组合物考虑有效量范围而制备，且这样地被剂型化的单位施用型制剂根据必要而监视药剂的施用，或根据观察的专家的判断与个人的要求而使用专门的给药法，或可以一定时间间隔施用数次。

本发明中炎症性疾病有由急性，慢性炎症疾病，自身免疫反应的类风湿性炎症疾病，退行性炎症疾病等。

以下，依步骤说明本发明的络石藤提取物或级分的纯化方法则如下。

[第1步骤]乙酸乙酯级分收获步骤

本步骤使络石藤干燥提取物溶解于水，并向所述裂解物加乙酸乙酯而混合而分离水层与乙酸乙酯层。

以及，从所述分离出的乙酸乙酯层中除去溶剂，并浓缩至含有0.05～12重量％作为指标物质的牛蒡苷元而收获抗炎功效优秀的乙酸乙酯级分。

这是因为向络石藤提取物加具有相对的非极性的特性的乙酸乙酯而分级分离则提取效率变优秀。

另外，本发明中考虑与乙酸乙酯联系的提取效率与安全性而优选用醇类提取络石藤提取物，且具体地，则优选用乙醇，甲醇或丁醇提取而干燥而使用。这是因为用醇类提取则在与水反应中可溶性好，并在乙酸乙酯中分级分离时使活性成分从水中分离的效率优秀。更具体地，则使用20～99.9％(v/v)的乙醇，并更优选则使用30～95％(v/v)的乙醇。这是因为使用不足20％的乙醇则活性成分的提取效率低下，而使用99.9％以上纯度的乙醇则生产单价增加，并提取效率性与功效不变优秀。但是，本发明中络石藤提取物不局限于醇类，且只要是可多地收获活性成分的溶剂，并在药典中收录，或对于人体安全，就使用哪种溶剂而提取也无妨。

以下，第2步骤与第3步骤可根据药效的功效或有效浓度，提取物的物理性的特性等而选择性地施行。

[第2步骤]纯化步骤

本步骤将在所述第1步骤中分离的乙酸乙酯层用层析收获活性分级分离。此时，在本发明中，具体地优选收获施行正相(normal phase)，逆相(reverse phase)或正相与逆相层析而进一步被纯化的活性分级分离。在这里，用于正相或逆相层析的多样的移动相或固定相溶剂作为只要是本发明的领域中普通技术人员就明晰的事项，就省略具体的说明。

[第3步骤]提取纯化物收获步骤

本步骤是得到施行所述第2步骤而提高纯化度的活性分级分离之后，将其干燥，或浓缩而收获提取纯化物。

【发明效果】

如上所述，根据本发明的络石藤乙酸乙酯级分与用以往方法收获的络石藤提取物比较而示抗炎效果显著改善的效果而可使开发炎症性疾病预防及治疗用药物组合物或功能性食品。

【附图说明】

图1是示根据本发明的络石藤提取物及级分的TLC展开模式结果的照片[a：实施例2，b：实施例3，c：实施例1，d：实施例4]，

图2a与图2b是示根据本发明的络石藤提取物及级分(实施例1，4)的牛蒡苷及牛蒡苷元的层析谱的照片，并

图3是将根据本发明的乙酸乙酯级分的柱级分用正相层析分离，并将其用TLC分离而示的照片，并

图4是示根据本发明的络石藤乙酸乙酯级分的柱级分的IL-1β，TNF-α发生抑制效果的坐标图，并

图5是由根据本发明的实施例3的络石藤乙酸乙酯级分的在关节炎滑膜组织细胞(FLS)中被TNF-α刺激而表达出的MMP-1，MMP-3的表达减少出现的照片，并

图6是示利用关节炎诱发的小鼠模型的关节炎炎症浮肿评价试验而络石藤级分(实施例3)的关节炎抑制效果的照片，并

图7是示根据本发明的络石藤级分(实施例3)的CIA小鼠关节的H&E染色结果的照片，并

图8是示在关节炎诱导小鼠关节中络石藤级分(实施例3)的IL-1β，IL-6，RANTES，MMP-3mRNA表达抑制效果的照片，并

图9是示根据本发明的络石藤级分(实施例3)的在关节炎模型动物关节组织中MMP-1，3蛋白表达抑制效果的照片。

【实施方式】

以下，要由具体的实施例而更详细地说明本发明。但是，本发明不由下记实施例限定，且此领域中技术人员明晰可在本发明的思想与范围内进行多种修饰或修正。

【实施例1：络石藤95％乙醇提取物的制备】

用洁净的纯化水洗涤，并使良好干燥之后向络石藤20kg加所述生药重量的约5～10倍量的95％乙醇水溶液而良好搅拌，并在约80℃左右提取了5小时。将所述提取物缓慢地冷却到常温，并过滤而除去残渣后合并残液而在减压状态将乙醇溶剂蒸发浓缩而得到了络石藤乙醇提取物1kg(收率约5％)。

【实施例2：络石藤30％乙醇提取物的制备】

用洁净的纯化水洗涤，并使良好干燥之后向络石藤40kg加所述生药重量的5～8倍量的30％乙醇水溶液而良好搅拌，并以2小时单位热提取了2次。将所述提取物质缓慢地冷却到常温之后离心过滤而除去残渣后合并残液而于60～80℃减压浓缩了。

将通过所述乙醇分级分离而回收的乙醇加于所述浓缩水之后使浓缩水充分地悬浮之后将用1000rpm离心过滤的残液再次减压浓缩之后使以60℃，0.08pa条件真空干燥之后，经以80筛目粉碎过程，并使灭菌而得到了粉末状态的络石藤乙醇提取物1kg(收率2.5％)。

【实施例3：络石藤乙酸乙酯级分的制备】

将在所述实施例2中制备的30％乙醇提取物100g搅拌于水约0.8L而溶解，并混合等量～2倍的乙酸乙酯(330mL×5)之后分级分离而得到了乙酸乙酯可溶性级分。向乙酸乙酯可溶性级分添加适量(药125g)的硫代硫酸钠(Sodium thiosulfate)而使吸收级分的水分子而过滤(filter)而纯化了乙酸乙酯可溶性级分。被纯化的级分利用减压过滤装置而使浓缩而得到了络石藤乙酸乙酯级分约11g。

【实施例4：络石藤乙酸乙酯级分的制备】

将在所述实施例1中制备的95％乙醇提取物100g搅拌于水约0.8～2L而溶解，并混合等量～2倍的乙酸乙酯之后分级分离而得到了乙酸乙酯可溶性级分。向乙酸乙酯可溶性级分添加适量(药125g)的硫代硫酸钠(Sodium thiosulfate)而使吸收级分的水分子而过滤(filter)而纯化了乙酸乙酯可溶性级分。被纯化的级分利用减压过滤装置而使浓缩而得到了络石藤乙酸乙酯级分约16.7g。

【实施例5：络石藤乙酸乙酯级分的TLC确认】

将在所述实施例1～4中制备的络石藤提取物，级分各自少量(药1mg/5mL甲醇)溶解而准备成TLC展开用之后，向Silica TLC(正相)将用甲醇溶解的络石藤乙酸乙酯级分利用毛细管而点样而装载，并完全地弄干之后，使用各自不同的移动相溶剂而在密闭的TLC箱中展开，并将其利用发色试剂而示结果而示于了图1。此时，移动相作为了(A)乙酸乙酯66％，乙醇19％，水15％，(B)氯仿80％，甲醇15％，水5％。

由所述结果，则将络石藤乙醇提取物(a，c)与络石藤乙酸乙酯级分(b，d)比较看，则可知从TLC展开出发点不同。即，可明确地观察作为乙酸乙酯级分被进一步纯化了，且这确认了从出发点展开的构成成分的差异被乙酸乙酯分级分离，并减小了相当的量，并只特定部分被纯化为乙酸乙酯级分。

【实施例6：络石藤指标成分高效液相层析(HPLC)分析】

利用高效液相层析装置而分析了所述实施例2的络石藤提取物与实施例3的络石藤级分的指标成分牛蒡苷(Arctiin)的含量。

[牛蒡苷分析条件]

1)使用机器：Waters HPLC system

2)移动相：50％甲醇

3)分析时间：30分钟

3)流速：1ml/min

4)柱：YMC-pack Pro C18RS(250×4.6mm ID.5particles)

5)检测器：UV 280nm

6)标准品牛蒡苷：由Hunan Guohua Pharmaceutical Co.，Ltd，China供应

在所述实施例2中牛蒡苷的含量被确认为了含有约3重量％，且在所述实施例3中的牛蒡苷含量在每次分级分离都发生了含量的变化。即，1次乙酸乙酯分级分离检测出了最多的约19％含量，且分级分离次数从2次至5次各自的牛蒡苷含量渐渐减少而示了约6％的含量。在被分级分离5次的乙酸乙酯级分中，则分析出了平均约12～15％的含量。

另外，对于实施例1的络石藤提取物与实施例4的络石藤级分的牛蒡苷与牛蒡苷元(Arctigenin)的含量通过高效液相层析(HPLC)而进行了含量分析。牛蒡苷的分析方法如所述实施例2，3的分析法，而牛蒡苷元的分析方法如下。

[牛蒡苷元分析条件]

1)使用机器：Waters HPLC system

2)移动相：40％乙腈(CH3CN)

3)分析时间：30分钟

3)流速：1ml/min

4)柱：YMC-pack Pro C18RS(250×4.6mm ID.5particles)

5)检测器：UV 280nm

6)标准品：Sigma-Aldrich产品编号A1854.(Lot.074K4701，Germany)

在实施例1中确认了含有牛蒡苷的含量约2重量％，牛蒡苷元0.5重量％，且测定出了在实施例4中的牛蒡苷含量在分级分离3次时，约6重量％，牛蒡苷元约1.2重量％的含量。

牛蒡苷与牛蒡苷元的层析谱被图示于了图2。

【实施例7：从络石藤乙酸乙酯级分正相柱分级分离】

将在所述实施例3中得到的络石藤乙酸乙酯级分利用由二氯甲烷∶甲醇(1000∶5～95∶5)构成的阶段浓度梯度(Step gradient)溶剂系统而使用硅胶柱层析而分离了活性分级分离。

即，使络石藤乙酸乙酯级分约12倍的硅胶悬浮于的二氯甲烷1000∶甲醇5比率的移动相而精致地堆积到玻璃柱而制造之后，将络石藤乙酸乙酯级分约10g悬浮于约0.5～1倍的硅胶而使以减压浓缩吸附而注入到了积累而制造的柱。以硅胶用量的约5倍单位使浓度梯度阶段性地变化至二氯甲烷95∶甲醇5的比率而以硅胶柱的容量(药100mL单位)受级分之后，得到的各自的级分像所述实施例5的方法一样通过硅胶TLC而确认了分离度(参照图3)。此时，移动相使用了二氯甲烷95％，甲醇5％或氯仿80％，甲醇15％，水5％。

试验例

本试验例为确认根据本发明的级分的抗炎效果而比较分析了对于提取物及级分的细胞内氧化氮(Nitric oxide)与细胞因子(Cytokine)的反应效果。另外，利用诱发关节炎的小鼠而通过动物实验分析了提取物的浮肿，炎症抑制反应，并通过动物模型的关节活体样品而分析了组织染色，关节炎因子的mRNA，蛋白的抑制效果。

【1.细胞培养及提取纯化物处理】

于5％CO2，37℃使用DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)，10％FBS(fetal bovine serum)，青霉素(100单位/ml)与链霉素硫酸盐(100g/ml)而培养了作为小鼠来源的巨噬细胞的RAW 264.7(ATCC，#TIB-71)细胞。为各自的分析而将RAW 264.7细胞在96-孔平板中以2×10⁴细胞/孔接种(seeding)，并24小时后依浓度处理了LPS 300ng/ml与级分。

【2.细胞毒性(Cell cytotoxicity)测定】

使用TACS XTT Cell Proliferation/Viability Assay kit(R&D systems，Cat.4891～025-K)而培养(incubation)4小时，并在OD490nm处测定了细胞毒性。

【3.统计处理】

用如下的方法施行了对于各实验组的统计学的显著性检验。对于在各实验组中得到的数据而施行Levene′s test而确认分散同质性(variance homogeneity)与否，并在分散具有同质性的情况中，施行单因素ANOVA而在p＝0.05的水平确认显著性的情况中，以Dunnett′s t-检验比较了实验组间的差异。

【试验例1：氧化氮测定(NO assay)】

向各培养上清液等量(100μl)放入40mg/ml Griess试剂(Sigma，G4410)而混合，并使于室温反应30分钟之后在OD540nm处测定了吸光度。分析结果，将只给LPS刺激的处理组(对照组)作为基准用相对的％标记(LPS处理的对照的％)或以示50％抑制效果的浓度的单位IC50或抑制率示于了表1，表2。

[表1]

 区分  IC₅₀(NO生成抑制) 实施例2  1180μg/ml 实施例3  379.7μg/ml

所述表1是将络石藤30％乙醇提取物(实施例2)与络石藤乙酸乙酯提取物(实施例3)的NO生成抑制效果变换为IC50而比较的结果。抑制50％的浓度的范围从在实施例2中1180μg/ml，用实施例3纯化成为379μg/ml而可知效果更变好。

另外，用如所述的方法比较分析了络石藤提取物及级分(实施例1，实施例4)的NO生成抑制率。在实施例1与4的不呈现细胞毒性的最高浓度320μg/ml，实施例1的乙醇提取物的NO生成抑制率呈现了68％的比较高的效果。另外，与此比较而作为乙酸乙酯提取物的实施例4呈现作为相比更高的抑制率的80％的抑制率而可知示高的效果[表2]。

[表2]

 区分  NO生成抑制(％) 实施例1  68.1±4.89 实施例4  80.3±2.51

【试验例2：细胞因子分析】

存在于培养液的IL-1β，TNF-α的水平利用IL-1β分析试剂盒(R&D systems，Cat.MLB00B)，TNF-αassay kit(R&D systems，Cat.MTA00)而用ELISA方法测定了，且在OD450nm UV下利用酶标仪(microplate reader)而测定了吸光度。以只给LPS刺激的处理组作为基准以相对的％求出了分析结果。

此时，在细胞因子分析中，以细胞毒性实验结果，不示细胞毒性的浓度范围作为根据实施了样品的处理浓度。

将30％乙醇络石藤提取物(实施例2)与络石藤乙酸乙酯级分(实施例3)的比较分析试验结果示于了下表3。在IL-1β与TNF-α的情况中，在实施例3中呈现各自38％，42％的抑制率而相比实施例2呈现了更高的抑制功效[表3]。这是将细胞毒性在完全不示影响的最高毒性范围(实施例2：640μg/ml，实施例3：160μg/ml，)分析出的值。

[表3]

所述结果，在比较络石藤乙醇提取物与络石藤乙酸乙酯级分时，相对地在乙酸乙酯级分示了被分类为炎症性细胞因子的TNF-α，IL-β的优秀的抑制效果。有效成分与乙醇提取物比较时，间接地可知与非极性溶剂相比更亲和性，且可知被纯化为了有效物质的乙酸乙酯可溶性级分。

此外，参考性地将追加纯化试验在所述实施例7中被纯化的级分2，5，6号的细胞因子分析结果示于了图4。IL-1β，TNF-α抑制效果在更低的浓度呈现高的抑制功效而示了是更被纯化的形态。

从而，根据本发明的提取纯化物被判断为与以往提取物相比而药学地抗炎效果非常优秀。

【试验例3：从滑膜组织分离及培养滑膜细胞(FLS：Fibroblast like synoviocyte)】

将源于关节炎患者的滑膜组织(synovium tissue)用剪刀切为1×1×1mm左右之后，在溶解1mg/ml的胶原酶的HBSS缓冲液中于37℃培养了2小时。将只上清液利用70μm nylon cell strainer(BD，NJ，USA)而分离了细胞。分离出的细胞1500rpm离心10分钟2次左右而进行了洗涤。除去上清液之后，向沉淀添加α-MEM培养基(10％FBS，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素)而移到T75-瓶而于37℃，在CO₂培养箱中培养2～3小时后，2次洗涤之后，进行了培养。进行3～6次传代时，可得到95％以上的FLS(＞95％成纤维细胞的表面标记物(CD90+)，＜1％CD3+，＜1％CD11b，＜1％Fcγ受体II阳性)，并将其用于了实验。

【试验例4：免疫杂交分析】

将在所述试验例3中得到的FLS以2×10⁵/孔各分注于了6孔平板。培养3天后，用不完全α-MEM(1％L-谷氨酰胺，1％抗生素)更换培养液之后，将络石藤级分(实施例3)用10，25，50μg/ml浓度处理后，在30分钟后处理TNF-α20ng/ml而各自24小时后只分离提取了培养液。对分离提取出的培养液10％利用SDS-PAGE凝胶而施行了免疫杂交分析法(immunoblotting analysis)。利用抗体MMP-1，MMP-3而确认波及到从FLS分泌出的MMP的影响而示于了图5表。如图示于图5，确认了实施例3的络石藤级分的10，25，50μg/ml的浓度依赖性地MMP-1，MMP-3的显著的减小。

【试验例5：CIA(胶原酶诱导的关节炎)小鼠模型】

实验动物是购买5周龄雄性DBA/1J小鼠而驯化2周之后，在7周龄时实施了实验。向100μg牛的II型胶原(in 0.05M acetic acid)用等量的弗氏完全佐剂(Chondrex Inc.，Redmond，Washington)良好混合而注入到尾肌肉(初次免疫)。21天后，再次以腹腔注射法(i.p)注入了50μl(2mg/ml)牛的II型胶原(第二次免疫)。如第二次免疫法，将蒸馏水(媒质)，IND(吲哚美辛)，络石藤级分(实施例3)在5％阿拉伯胶中制成悬浮液而每天经口注入。

每3天以肉眼评价了关节炎分值(Arthritis score)，且各自评价人(6人)进行了盲试。

前后足均进行了测定，且以0＝正常，1＝轻度，限于个别指/趾的明显肿胀，2＝中度，踝部发红及肿胀，3＝包括指/趾的掌部发红及肿胀，以及4＝波及多个关节的肢最大发炎的评价基准评价了关节炎分值。评价测定至第二次免疫后18天。图6示了CIA试验肉眼评价结果。

图7图示了组织评价照片(H&E染色)的评价结果。摘出初次免疫法(免疫)后第38天处死的CIA动物模型后足而使在固定液(PBS中的4％多聚甲醛)中CIA固定之后在脱灰液(PBS中的10％EDTA，4％多聚甲醛)中施行了4周脱灰过程。然后，石蜡处理而以5μm厚度切片而实施H&E(苏木素及伊红)染色而测定了软骨损伤(Carilage destruction)，骨腐蚀(erosion)，免疫细胞的浸润(Infiltration)，血管翳(Pannus)形成程度等。

测定基准测定了0＝正常，1＝免疫细胞的浸润，2＝滑膜的过形成，血管翳形成，3＝骨腐蚀，崩溃，且3人以上实施了盲试。

【试验例6：从实验动物组织提取分离mRNA】

将从CIA实验动物(试验例5)采集的前足(paw)，后足(hind leg)组织在液氮中冷冻而利用研钵而以一次粉碎后利用RNA分离试剂盒(Intron，Korea)而分离提取了总RNA。添力RNA分离裂解缓冲液后，30分钟涡旋(vortex)，并添加氯仿200μl而以13,000rpm，4℃，离心30分钟后得到上清液而利用RNA分离滤器而提取了总RNA。利用分光光度计(Eppendorf，German)而定量了分离提取出的总RNA。

【试验例7：RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)】

对从试验例6提取的总RNA 1μg利用Superscript第一链合成系统(Invitrogen，CA，USA)而施行了RT-PCR。使1μg总RNA与OligodT 18mer(invitrogen，CA，USA)一起于72℃反应5分钟后，添加反应缓冲液混合剂(3mM MgCl₂，各0.5mM dNTP，5×反应缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，1μl反转录酶)之后，以25℃-5分钟，42℃-1小时，72℃-5分钟进行了反应。将这样生产的模板用于了PCR反应。在PCR反应中IL-1β以94℃-2分钟，94℃-20秒钟，60℃-10秒钟(RANTES，MMP-3，GAPDH：50℃)，72℃-40秒钟施行了33个循环(IL-6：35个循环，RANTES，MMP-3：35个循环)，且在最后于72℃反应5分钟而施行了实验。将这样得到的产物在2％琼脂糖凝胶中电泳而用溴化乙锭(ethidium bromide)染色之后在UV-系统中确认而图示于了图8。各PCR引物序列表示于了下表4。

[表4]

RT-PCR引物序列

^＊Molecular Pharmacology.1997，52：30～37。

【试验例8：实验动物组织从蛋白提取分离】

将从CIA实验动物(试验例5)采集的前足(paw)，后足(hindleg)组织在液氮中冷冻而利用研钵而以一次粉碎后添加裂解缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet p-40，10％甘油，60mM辛基β-葡萄糖苷，10mM NaF，1mM Na3VO4，1mM苯甲磺酰基氟化物，2.5mM硝基磷酸苯酯，0.7μg/ml胃酶抑素，及蛋白酶-抑制剂混合剂片剂)而分离提取了总蛋白。将分离提取出的蛋白用Brad-ford assay方法定量而施行了免疫杂交分析法。

在蛋白水平在从CIA实验动物采集的前足，后足组织内MMP-1与MMP-3的表达确认了络石藤级分(实施例3)中的抑制效果，且图示于了图9。

【制备例1：片剂的制备】

利用本发明的络石藤乙酸乙酯级分而利用湿式颗粒法及干式颗粒法而以如下的组成制备了经口施用用片剂。

[组成]

络石藤乙酸乙酯级分200mg，硬质无水硅酸10mg，硬脂酸镁2mg，微晶纤维素50mg，淀粉甘醇酸钠25mg，乳糖101mg，聚维酮12mg，无水乙醇适量。

【制备例2：软膏剂的制备】

利用本发明的络石藤乙酸乙酯级分而以如下的组成制备了软膏剂。

[组成]

络石藤乙酸乙酯级分5g，鲸蜡基棕榈酸酯20g，鲸蜡醇40g，硬脂基醇40g，肉豆蔻酸异丙酯80g，单硬脂酸山梨糖醇酐20g，聚山梨酸酯60g，对氧基安息香酸丙酯1g，对氧基安息香酸甲酯1g，磷酸及纯化水适量。

【制备例3：注射剂的制备】

利用本发明的络石藤乙酸乙酯级分而以如下的组成制备了注射剂。

[组成]

络石藤乙酸乙酯级分100mg，甘露糖醇180mg，磷酸一氢钠25mg，注射用纯化水2974mg

【制备例4：经皮剂的制备】

利用本发明的络石藤乙酸乙酯级分而以如下的组成制备了经皮剂。

[组成]

络石藤乙酸乙酯级分0.4g，聚丙烯酸钠1.3g，甘油3.6g，氧化铝0.004g，甲基对羟基苯甲酸酯0.2g，丙烯基系粘着溶液14ml。

【序列表自由正文】

以app文件随附于了电子申请书PCT-SAFE-FM。