止泻木总生物碱提取物的有效单体制备方法及其用途

摘要

止泻木总生物碱提取物的有效单体制备方法及其用途，其方法的步骤为：(1)止泻木用90％乙醇回流提取得到乙醇提取物；(2)乙醇提取物用水溶解，然后用浓盐酸调pH值到1-2，过滤；(3)过滤的滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9-11，然后用有机溶剂萃取，得到上述止泻木的总生物碱提取物；(4)将总生物碱提取物通过MCI-geI柱层析，甲醇水溶液梯度洗脱，薄层色谱检测的步骤，得到有效单体成分是锥丝碱、异锥丝明、锥丝明、锥丝亚胺；止泻木总生物碱提取物在制备预防、治疗老年痴呆症药物或提高智力药物中的用途；止泻木总生物碱提取物中的有效单体成分在制备预防、治疗老年痴呆症药物或制备提高智力药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及涉及止泻木总生物碱提取物的医药技术。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，即老年性痴呆，简称AD)是一种慢性进行性脑变性疾病，临床上以认知功能减退为核心症状。AD的发病率与年龄呈正相关，是老年痴呆的主要类型。近年来，国内外临床研究表明，AD病人脑内乙酰胆碱的缺乏可能是导致痴呆的病因，而乙酰胆碱酯酶可水解脑内的乙酰胆碱致使脑内乙酰胆碱缺乏。因此对乙酰胆碱酯酶有抑制作用的药物，可显著提高AD病人脑内的乙酰胆碱水平，发挥预防和治疗老年痴呆作用(金有豫药理学(第五版)，2001；54-55)。

止泻木(Holarrhena antidysenterica)为夹竹桃科(Apocynaceae)止泻木属(Holarrhena)植物。止泻木为常用藏药毒毛妞的源植物之一，具有利胆，清火止咳，止泻之功效(中国科学院西北高原生物研究所，藏药志，1991，158)。但到目前为止，尚未见止泻木总生物碱提取物及其有效单体成分关于预防老年痴呆症和提高智力作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供止泻木总生物碱提取物及其有效单体化合物在制备预防老年痴呆症和提高智力药物中的用途。

本发明是止泻木总生物碱提取物的有效单体制备方法及其用途，其方法的步骤为：

(1)止泻木用90％乙醇回流提取得到乙醇提取物；

(2)乙醇提取物用水溶解，然后用浓盐酸调pH值到1-2，过滤；

(3)过滤的滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9-11，然后用有 机溶剂萃取，得到上述止泻木的总生物碱提取物。

(4)将总生物碱提取物通过MCI-gel柱层析，甲醇水溶液梯度洗脱，薄层色谱检测的步骤，得到有效单体成分是锥丝碱(conessine)、异锥丝明(isoconessimine)、锥丝明(conessimin)、conarrhimin、锥丝亚胺(conimin)。

止泻木总生物碱提取物的用途，是用作预防，治疗老年痴呆症药物，或提高智力的药物。

止泻木总生物碱提取物中的有效单体成分的用途，是用作预防，治疗老年痴呆症，或提高智力的药物。

本发明经过痴呆小鼠的学习记忆能力的改善实验，结果显示，止泻木总生物碱提取物及其单体成分可以用于制备预防老年痴呆症和提高智力的药物。

具体实施方式

止泻木总生物碱提取物的有效单体制备方法及其用途，其方法的步骤为：

(1)止泻木用90％乙醇回流提取得到乙醇提取物；

(2)乙醇提取物用水溶解，然后用浓盐酸调pH值到1-2，过滤；

(3)过滤的滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9-11，然后用有机溶剂萃取，得到上述止泻木的总生物碱提取物。

(4)将总生物碱提取物通过MCI-gel柱层析，甲醇水溶液梯度洗脱，薄层色谱检测的步骤，得到有效单体成分是锥丝碱(conessine)、异锥丝明(isoconessimine)、锥丝明(conessimin)、conarrhimin、锥丝亚胺(conimin)。

止泻木总生物碱提取物的用途，是用作预防，治疗老年痴呆症药物，或提高智力的药物。

止泻木总生物碱提取物中的有效单体成分的用途，是用作预防，治疗老年痴呆症，或提高智力的药物。

本发明提供的具体技术方案：

1、止泻木总生物碱的制备

通常提取止泻木总生物碱采用“酸提碱沉”法，但又有水提和醇提两种工艺。为了兼顾得率和纯度，本发明采用了醇提取的方法。具体的工艺路线如下：首 先将止泻木药材粉碎成粉末状。第一次采用药材质量5-8倍的比例加入90％乙醇热回流提取1-2h；第二次按照药材质量2-5倍的比例加入90％乙醇热回流提取1h。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用4M的浓盐酸调pH值到1-2，静置12-18h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9-11，然后用有机溶剂(氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚的一种或几种混合)萃取2-4次，萃取液合并浓缩至干，得到止泻木总生物碱提取物。

2、有效单体成分的分离及鉴定

有效单体成分具体包含化合物1(锥丝碱，conessine)，化合物2(异锥丝明，isoconessimine)，化合物3(锥丝明，conessimin)，化合物4(conarrhimin)和化合物5(锥丝亚胺，conimin)。上述步骤中制得的止泻木总生物碱提取物经过柱层析和重结晶，得到化合物1，化合物2，化合物3，化合物4和化合物5。具体来说，总生物碱提取物通过MCI-gel柱层析甲醇水溶液梯度洗脱(50％，60％，70％，80％，90％的甲醇水溶液)薄层色谱检测合并相同组分得到A，B，C三个流分。流分C经甲醇重结晶得到化合物1；流分B经反复柱层析得到化合物2，化合物3，化合物4和化合物5。化合物的结构式如下，其中化合物1-5的骨架编号顺序相同：

化合物1-5的结构鉴定如下：

化合物1：与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：357[M+H]⁺。 ¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：0.93(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J＝5.2Hz，H-21)，1.93(1H，m，H-18a)，2.21(3H，s，H-22)，2.33(6H，s，H-23，24)，2.98(1H，d，J＝10.7Hz，H-18b)，5.34(1H，Br s，H-6)；¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δppm：38.3(C₁)，25.1(C₂)，64.9(C₃)，35.1(C₄)，141.8(C₅)，120.8(C₆)，32.0(C₇)，33.4(C₈)，49.9(C₉)，36.9(C₁₀)，22.0(C₁₁)， 38.7(C₁₂)，50.4(C₁₃)，55.8(C₁₄)，24.6(C₁₅)，27.6(C₁₆)，53.5(C₁₇)，64.6(C₁₈)，19.4(C₁₉)，63.2(C₂₀)，14.6(C₂₁)，41.2(C₂₂)，41.6(C₂₃)，41.6(C₂₄)，以上光谱数据与文献(G.N.Zirihi et al，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，15(2005)：2637-2640)一致。所以该化合物鉴定为conessine。

化合物2：与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：343[M+H]⁺。 ¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：0.94(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J＝5.2Hz，H-21)，2.21(3H，s，H-22)，2.33(3H，s，H-23)，2.98(1H，d，J＝10.2Hz，H-18b)，5.36(1H，Br s，H-6)；¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δppm：38.7(C₁)，28.9(C₂)，59.8(C₃)，37.9(C₄)，141.4(C₅)，120.7(C₆)，32.0(C₇)，33.4(C₈)，49.9(C₉)，37.1(C₁₀)，22.0(C₁₁)，39.5(C₁₂)，50.3(C₁₃)，55.8(C₁₄)，24.5(C₁₅)，27.6(C₁₆)，53.5(C₁₇)，64.6(C₁₈)，19.4(C₁₉)，63.1(C₂₀)，14.8(C₂₁)，41.2(C₂₂)，33.4(C₂₃)，以上光谱数据与文献(G.N.Zirihi et al，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，15(2005)：2637-2640)一致；所以该化合物鉴定为isoconessimine。

化合物3：与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：343[M+H]⁺。 ¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：0.91(3H，s，H-19)，1.13(3H，d，J＝5.2Hz，H-21)，2.29(3H，s，H-22)，5.33(1H，Br s，，H-6)；¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δppm：37.2(C₁)，25.0(C₂)，64.7(C₃)，35.2(C₄)，141.9(C₅)，120.4(C₆)，32.0(C₇)，33.5(C₈)，49.8(C₉)，36.8(C₁₀)，22.0(C₁₁)，38.2(C₁₂)，52.8(C₁₃)，54.6(C₁₄)，22.9(C₁₅)，27.5(C₁₆)，53.4(C₁₇)，52.4(C₁₈)，19.4(C₁₉)，56.2(C₂₀)，16.0(C₂₁)，41.6(C₂₃)，41.6(C₂₄)。以上光谱数据与文献(H.T.Tran et al，Tap Chi Duoc Hoc，(2006)，46(6)：24-27)一致，所以该化合物鉴定为conessimin。

化合物4：与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：315[M+H]⁺。 ¹H-NMR(400MHz，CDCl₃∶CD₃OH＝1∶4)δppm：0.96(3H，s，H-19)，1.17(3H，d，J＝6.3Hz，H-21)，5.34(1H，br s，H-6)；¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δppm： 42.3(C₁)，31.9(C₂)，57.3(C₃)，37.9(C₄)，142.0(C₅)，121.7(C₆)，32.7(C₇)，34.7(C₈)，50.9(C₉)，37.5(C₁₀)，22.9(C₁₁)，39.0(C₁₂)，52.7(C₁₃)，54.5(C₁₄)，23.3(C₁₅)，27.8(C₁₆)，52.5(C₁₇)，52.2(C₁₈)，19.8(C₁₉)，56.4(C₂₀)，15.6(C₂₁)。以上光谱数据与文献(H.T.Tran et al，Tap Chi Duoc Hoc，(2006)，46(6)：24-27)一致，所以该化合物鉴定为conarrhimin。

化合物5：与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：329[M+H]⁺。 ¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：0.92(3H，s，H-19)，1.13(3H，d，J＝6.3Hz，H-21)，2.44(3H，s，H-23)，5.34(1H，Br s，H-6)；¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δppm：37.9(C₁)，28.9(C₂)，59.8(C₃)，37.2(C₄)，141.5(C₅)，120.4(C₆)，31.9(C₇)，33.5(C₈)，49.8(C₉)，37.0(C₁₀)，21.9(C₁₁)，39.5(C₁₂)，52.3(C₁₃)，55.6(C₁₄)，22.9(C₁₅)，27.4(C₁₆)，53.4(C₁₇)，52.3(C₁₈)，19.4(C₁₉)，56.3(C₂₀)，15.9(C₂₁)，33.5(C₂₃)。以上光谱数据与文献(H.T.Tran et al，Tap Chi Duoc Hoc.(2006)，46(6)：24-27，31.)一致，所以该化合物鉴定为conimin。

3.止泻木总生物碱提取物和有效单体化合物的抗老年痴呆体、内外药理学试验

近年来的研究表明，对乙酰胆碱酯酶有抑制作用的药物，可显著提高老年痴呆病人脑内的乙酰胆碱水平，发挥预防和治疗老年痴呆作用。因此，本发明首先采用经典的Ellman方法(Ellman G.L，Biochemical Pharmacology，1961；7：88-95)研究了止泻木总生物碱提取物及其单体成分在体外对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，结果表明，止泻木总生物碱提取物和其单体成分化合物1(锥丝碱，conessine)，化合物2(异锥丝明，isoconessimine)、化合物3(锥丝明，conessimin)、化合物4(conarrhimin)、化合物5(锥丝亚胺，conimin)，均具有良好乙酰胆碱酯酶抑制活性。为了进一步证实止泻木总生物碱提取物和有效单体化合物的抗老年痴呆作用，本发明研究了止泻木总生物碱提取物和有效单体化合物1、2、3、4和5对Aβ_25-35(淀粉样蛋白片段)致痴呆小鼠的学 习记忆能力的影响(杨楠等.中国康复理论与实践，2010；16(4)：308-310)。结果显示，止泻木总生物碱提取物和化合物1、2、3、4和5均能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力。以上结果提示，止泻木总生物碱提取物及其单体成分可以用于制备预防老年痴呆症和提高智力的药物。

下面结合具体实例进一步对本发明进行描述，但不限制本发明。

实施例1  止泻木总生物碱提取物的制备

称取止泻木粉末2.5kg置于圆底烧瓶中，加入90％乙醇15L热回流提取2h，抽滤得滤液；再加入90％乙醇15L热回流提取1h，再抽滤，得滤液。两次的滤液合并浓缩至干，加3L蒸馏水溶解，用浓盐酸调pH值到1-2，静置15h后抽滤。滤液用2M氢氧化钠水溶液或浓氨水调pH值到9-11。每次加入3L氯仿萃取，共萃取2次，萃取液合并浓缩至干，得到止泻木总生物碱19g。

实施例2  有效单体成分的分离

取19g止泻木总生物碱提取物，用甲醇溶解后用200g MCI-gel(CHP 20P75-150μm)柱层析，甲醇水溶液(50％，60％，70％，80％，90％甲醇)梯度洗脱薄层色谱检测合并相同组分得到流分A(3g)，B(8g)，C(4g)。流分C  用甲醇重结晶得到化合物1(3300mg)；流分B用200g硅胶柱层析氯仿-甲醇溶液梯度洗脱(40∶1--5∶1)(其中梯度洗脱溶液中含0.1％的氨水)薄层色谱检测合并相同组分得到流分B-1(3g)，B-2(1.5g)，B-3(1g)，B-4(1g)，流分B-1经甲醇重结晶得到化合物5(2800mg)，流分B-2经甲醇重结晶得到化合物2(1000mg)，流分B-3用50g硅胶柱层析氯仿-甲醇溶液梯度洗脱(20∶1--3∶1)(其中梯度洗脱溶液中含0.1％的氨水)薄层色谱检测合并相同组分得到流分B-3-a(100mg)，B-3-b(600mg)，B-3-c(200mg)，B-3-b经甲醇重结晶得到化合物3(500mg)，B-3-c经甲醇重结晶得到化合物4(89mg)。

实施例3  Ellman法测定止泻木总生物碱提取物和有效单体成分的抗乙酰胆碱酯酶活性

利用经典的Ellman方法(Ellman G.L，Biochemical Pharmacology，1961；7：88-95)分别测定了止泻木总生物碱提取物和化合物1-5(浓度均为 100μg/mL)的抑制率，石杉碱甲作为阳性对照药。具体实验过程如下：

运用96孔酶标板测定样品对酶的抑制活性，样品组中每孔加入140μL0.1M的磷酸缓冲液(pH＝8.0)，然后加入20μL的样品，空白孔中加入160μL磷酸缓冲液不加任何样品，阳性对照控制组中加入20μL 0.1mg/mL的石杉碱甲和140μL的磷酸缓冲液，样品本底孔中20μL的样品和155μL的磷酸缓冲液，除了样品本底以外的其它孔中均加15μL的乙酰胆碱酯酶，混匀在4℃下培养20min，然后每孔加10μL 0.01mM的DTNB(5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸))和10μL 0.075mM的ATCI(碘化硫代乙酰胆碱)，混匀在37℃下培养20min，立即在405nm下测定各孔OD值。每组实验重复三次。并以下面公式计算样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

根据量效关系和直线回归法可以计算出样品对酶的半数抑制浓度值(IC₅₀)。结果表明六个样品均对乙酰胆碱酯酶均有不同程度的抑制。又测定了活性较好的总生碱提取物和化合物1、3、4和5的半数抑制浓度(IC₅₀)，发现其IC₅₀较低，说明具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性。实验数据见表1。

表1 Ellman法测试结果

实施例4  Morris水迷宫实验

健康昆明种雄性小鼠150只，随机分成15组：正常对照组、模型对照组、止泻木总生物碱高剂量组(100mg/kg)、止泻木总生物碱低剂量组(50mg/kg)、 化合物1、2、3、4和5高剂量组(2mg/kg)、化合物1、2、3、4和5低剂量组(1mg/kg)和多奈哌齐对照组(1.4mg/kg)。小鼠用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，75％酒精局部消毒，以微量注射器于单侧侧脑室(AP 1.0mm，L 4.5mm，H3.0mm)缓慢注入2.5μL凝聚态Aβ_25-35，注射时间为30s，留针30S，缓慢起针。局部消毒后缝合皮肤。造模手术后3d开始灌胃给药，正常组和模型组给同体积蒸馏水，连续给药14d后开始Morris水迷宫行为学评价，测试120s内达到终点平台的潜伏期。结果表明，止泻木总生物碱和化合物1、3、4和5都可明显缩短Aβ_25-35致痴呆小鼠120s内达到终点平台的潜伏期，即都能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力。而化合物2能在一定程度上改善痴呆小鼠的学习记忆能力，但作用较弱。实验数据见表2。

表2 止泻木总生物碱提取物和有效单体成分对Aβ_25-35致痴呆小鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力的影响

*：与模型对照组比较P＜0.01