T细胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的应用

摘要

本发明公开了一种包含口蹄疫病毒VP1，VP4，3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原，命名为TI，其具有SEQID NO：1的核苷酸序列；同时表达了O和Asia 1两个血清型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码基因，表达产物命名为OA-VP1。TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用，是一种很好的免疫增效剂，可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成份，以提高疫苗的免疫效果。

说明书

技术领域

本发明涉及兽医药领域，尤其是一种T细胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病。主要侵染猪、牛、羊等偶蹄动物，被国际兽疫局列为必须通报的烈性传染病。该病传播途径多、传播速度快，曾多次在世界范围发生大流行。

FMDV是小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员该病毒有七个血清型，分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3，每个血清型又可产生很多基因亚型，血清型之间无交叉保护反应。FMDV的核酸为单股正链的RNA分子，基因组全长约8500个碱基，只含有一个大的开放阅读框，表达产生的聚蛋白逐级裂解产生病毒的结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，结构蛋白组装产生病毒的衣壳结构。病毒衣壳蛋白是诱导产生中和抗体的主要免疫原，而结构蛋白与非结构蛋白均含有诱导细胞免疫的T细胞抗原表位。

早期通过单抗与免疫逃逸突变株的序列分析研究表明，在O型FMDV(O1BFS)至少存在5个功能独立的中和性抗原表位，组成抗原位点的区段主要包括VP1的G-H环以及其C端氨基酸，VP2上的31，70～73，75和77位氨基酸，VP1的B-C环上的43和44位点氨基酸；VP3上的58位氨基酸，VP1149位氨基酸(Crowther et al.，1993)等参与构成五个中和表位。这5个中和表位除了位点1为线性表位外，其余均为构象表位。利用合成肽免疫实验动物和牛的试验似乎证明位点1是最优势的抗原表位，但是有的试验结果显示疫苗免疫后针对位点2的抗体应答水平高于位点1(Samuel，1997)；其中针对G-H环位点的免疫显然是最重要的，因为不同血清型病毒，在G-H环附近的变异幅度最大，而且G-H环是病毒结合细胞受体的部位(Grubman and Baxt，2004)。T细胞表位对于诱导产生更高水平的中和抗体、尽早的清除病毒具有重要的作用，Cooke and Westover(2008)综合分析了不同血清型病毒抗原位点区域的差异，结果显示B-细胞与T-细胞抗原位点区域显示出很明显的血清型特征，已经发现在FMDV的结构蛋白以及非结构蛋白3A与3D上均存在T-细胞表位，有些T-细胞表位在血清型间比较保守，有些在毒株之间差异较大；其中VP4，VP1，3A，3D蛋白中均含有保守的T细胞表位，这些表位可能更易被宿主细胞表达的MHC分子识别，因而在分子疫苗设计中受到更多的关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种T细胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中应用。

一种T细胞免疫原基因TI，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

进一步的，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

T细胞免疫原基因TI在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中应用。

结果显示，与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比，添加TI抗原后灭活疫苗或OA-VP1免疫组小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体(P＜0.5)；且CD4+T细胞数量显著增多(P＜0.01)，IFN-γ产生水平显著升高(P＜0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用，是一种很好的免疫增效剂，可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成份，以提高疫苗的免疫效果。

本发明设计并合成了包含两个通用T细胞表位与来自口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白的多个细胞表位的串联表达基因，以期这种表达产物能够作为一种T细胞免疫原，用于蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗，提高疫苗免疫后保护性中和抗体的水平和免疫持续期。

在本发明中，设计并串联表达了O和Asia 1两个型的VP1结构蛋白，用作蛋白亚单位疫苗的雏形来验证所表达T细胞免疫原的免疫增效作用。在小鼠体内的初步免疫试验结果表明，所表达的T细胞免疫原具有很好的免疫增效作用，有望用于发明口蹄疫蛋白亚单位疫苗或作为灭活疫苗中的免疫增效成份，来提高传统疫苗的免疫效果。本发明也为口蹄疫疫苗发明提供了一种新的思路。

附图说明

图1为表达蛋白TI的SDS-PAGE检测.M为蛋白分子质量标准，1为未诱导TI对照，2为诱导后TI表达产物，3为TI诱导表达培养上清，4为TI诱导表达产物的沉淀，5和6为纯化后的TI表达产物；

图2为表达蛋白OA-VP1的SDS-PAGE检测.M为蛋白分子质量标准，1为未诱导OA-VP1对照，2为诱导后OA-VP1表达产物，3为OA-VP1诱导表达培养上清，4为OA-VP1诱导表达产物的沉淀，5为透析浓缩后的OA-VP1表达产物.；

图3为免疫小鼠血清O型FMDV中和抗体效价测定；

图4为免疫小鼠血清Asia1型FMDV中和抗体效价测定；

图5为各组小鼠脾CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群数量流式检测结果.A～F分别为1～6组，G为对照组.Q2区显示CD4+T细胞数，Q2-1区显示CD8+T细胞数。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1材料与方法

1.1试剂

Ni-NTA His·Resins购自Novagen公司；脂多糖(LPS)购自Sigma公司；RPMI1640培养液、胎牛血清购自GIBCO公司；青霉素、链霉素混合双抗购自晶美公司；小鼠淋巴细胞分离液(EZ-SepTM Mouse1X)购自达科为公司；IgG2a-FITC，IgG1-PerCP，CD4-PE，IgG2a-PE，CD3-PerCP，CD8-FITC购自美国BD公司；Moμse IFN-γELISA Kit II检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2T细胞免疫原的设计与表达

设计并合成了T细胞免疫原基因TI：其由口蹄疫病毒VP1、VP4、3A、3D蛋白共11个T细胞表位基因，麻疹病毒的泛T细胞表位基因以及来自耶尔森氏菌属的侵袭素基因组成的串联编码基因，各表位之间以两个甘氨酸相连，核苷酸序列为SEQ ID NO：1： CCATGGCCAAGTTCGTGGCTGCTTGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGCGGCTCCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGGGG G G CACACAGAACAACGATTGGTTCTCCAAGCTGGCCTCCAGCGCTTTCAGCGGACTGTTTGGAGGAGGAAGGACCCTGCCTACATCCTTCAACTACGG AG GA AGGAGGCAGCACACCGACGTGAGCTTTGGCGGAGCCGCCATCGAGTTCTTTGAAGGGATGGTGCACGATTCCATCAAAGGAGGAGTGGACGTGC TGC CAG TGGAGCACATCCTGTACACAAGGATGATGATCGGCAGATTCTGCGGAGGGGTGGTGGCCAGCGACTACGATCTGGACTTCGAAGCCCTGAAG

其蛋白序列为SEQ ID NO：2：

AKFVAAWTLKAAA(通用T细胞表位)-GG-VP4_(20-34)-GG-VP4_(62-81)-GG-VP1_(157-165)-GG-VP1_(26-34)-GG-3A_(21-35)-GG-3D_(182-201)-GG-3D_(342-371)-GG-TAKSKKFPSYTATYQF(Invasin)，即：

MAKFVAAWTLKAAAGGSIINNYYMQQYQNSMGGTQNNDWFSKLASSAFSGLFGGGRTLPTSFNYGGRRQHTDVSFGGAAIEFFEGMVHDSIKGGVDVLPVEHILYTRMMIGRFCGGVVASDYDLDFEALKPHFKSLGQTITPADKSGGTAKSKKFPSYTATYQF

各组成蛋白序列及功能见表1。

表1融合蛋白TI的序列及功能

合成上述TI抗原的编码基因，并将其插入到表达载体pET30a，将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将鉴定阳性的重组菌在卡拉霉素抗性的LB液体培养基中培养过夜，然后按1％转接到含0.05mg/mL卡拉霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD600＝0.6)，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃振荡培养5h后，取表达产物1mL进行SDS-PAGE分析。

1.3O型与Asia1型VP1基因的串联表达

分别扩增口蹄疫病毒O/HN/93和Asia 1/JS/05两个代表性毒株的VP1基因，并将两个血清型的VP1编码基因串联插入pET28a表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，参照1.2方法进行诱导表达，表达产物命名为OA-VP1。

1.4蛋白的纯化与鉴定

将正确表达目的蛋白的阳性重组菌进行大量培养并诱导表达目的蛋白。对表达TI蛋白应用镍离子亲和层析柱进行纯化，纯化方法按照Ni-NTAHis·Resins操作说明书进行。表达的OA-VP1形成包涵体，纯化包涵体用于后续试验，纯化产物进行SDS-PAGE分析。

1.5抗原制备与动物免疫

采用蛋白质定量试剂盒测定纯化蛋白的浓度，然后用PEG浓缩至终浓度为400μg/mL。加入等体积206油佐剂，用10mL注射器反复抽吸使之完全乳化而制成免疫抗原。

将6-8周龄的Balc/b小鼠共70只，随机分成7组(10只/组)，第1～7组分别为双价苗单独免疫组，双价苗/1×TI联合免疫组，双价苗/2×TI联合免疫组，OA-VP1单独免疫组，OA-VP1/1×TI联合免疫组，OA-VP1/2×TI联合免疫组和阴性对照组；分别注射O-Asia 1型FMDV灭活疫苗(中农威特生物科技公司生产)100μL，O-Asia 1型灭活疫苗100μL加TI免疫原100μg，O-Asia 1型灭活疫苗100μL加200μg TI免疫原，100μg纯化蛋白OA-VP1，100μg OA-VP1加100μg TI抗原，100μg OA-VP1加TI抗原200μg和100μLPBS，详见表2。灭活疫苗与OA-VP1乳化后进行后肢肌肉注射，而TI抗原乳化后进行腹腔注射，小鼠于洁净隔离环境中饲养。

表2.各小组小鼠免疫抗原的种类及剂量

1.6血清抗体动态监测和中和抗体效价测定。

在免疫后14d、28d、35d、45d对小鼠摘除眼球采血，分离血清，采用微量中和试验测定血清中的中和抗体水平。将待检血清56℃灭活30min后，取25μL样本2倍系列稀释于DMEM/High Glucose培养基中，每个稀释度重复4孔加入96孔细胞培养板中；每孔中加入50μL含有100TCID50的口蹄疫病毒液(O/HN/93或Asia1/JS/China/05)，37℃细胞培养箱中作用1h；然后每孔加入50μL浓度为1×105个/mL的BHK-21细胞悬液，置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。48h后在显微镜观察每孔的病变情况并记录，72h用4％多聚甲醛固定30min，用10％福尔马林溶液配制的0.05％亚甲基蓝染液染色30min后用水洗，未病变细胞孔呈蓝色，发生病变而细胞脱落者不着色。试验时设立阳性和阴性血清对照、病毒回归试验对照、血清毒性对照和正常细胞对照。按照Karber法计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的最高血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

1.7小鼠脾脏T细胞表面CD4，CD8，CD3的检测

初免45天后，将小鼠摘除眼球放血致死，浸泡于75％的酒精中，于超净台中取出小鼠脾脏，300目尼龙网研磨，加入淋巴细胞分离液5mL按操作说明书操作，分离小鼠脾淋巴细胞悬液，并用含3％FBS的PBS洗2遍后用PBS稀释至2×106/mL，加入用PE标记的大鼠抗小鼠CD4单抗、PerCP标记的仓鼠抗小鼠CD3单抗和FITC标记的大鼠抗小鼠CD8单抗，同时设相应标记物的同型对照检测管，室温避光孵育20min，用PBS洗两遍，最后用500L PBS重悬，4h内上机(FACSAria流式细胞仪)检测，用CellQuest软件分析总淋巴细胞、CD4+和CD8+细胞亚群的数量。

1.8小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的检测

免疫后45天，每组各取5只小鼠，取脾脏分离淋巴细胞，将新鲜分离的脾淋巴细胞置于96孔板中，37℃5％CO2恒温培养箱培养，24h后吸取100mL细胞培养液上清，按照Mouse IFN-γELISA Kit II检测试剂盒(购自美国BD公司)说明书检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的含量。标准曲线的绘制：将Mouse IFN-γELISA Kit II检测试剂盒提供的标准品进行倍比稀释，使其浓度为1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL和31.3pg/mL，按操作说明书进行操作后绘制标准曲线。

1.9数据统计分析

使用Microsoft Excel软件进行不同组别数据的两样本均数差异显著性检验。分析TI免疫原的免疫增强效应。

2结果

2.1目的蛋白的表达和纯化

应用SDS-PAGE检测重组菌中目的蛋白的表达情况。电泳图谱显示，重组菌在1mmol/L的IPTG诱导条件下高效表达产生了约21kDa TI蛋白和55kDa的OA-VP1蛋白，大小与预期目的蛋白大小相符。应用镍柱亲和层析技术纯化表达产生的TI蛋白，对OA-VP1蛋白则通过纯化包涵体进行了初步纯化(图1，2)。通过薄层扫描分析，纯化后的TI蛋白与OA-VP1包涵体的纯度分别达到了90％和60％以上。

2.2血清中和抗体效价的测定

FMDV中和抗体是产生保护性免疫的最重要的评价指标，通过测定免疫小鼠血清在细胞上中和FMDV的能力，可以间接的来反应不同疫苗抗原诱导产生保护性免疫的效果。结果表明，采用双价苗或者双血清型的VP1抗原免疫小鼠，从免疫后14d开始就可以检测到中和抗体，且中和抗体的水平不断升高；添加1倍和2倍TI抗原免疫组的中和抗体水平显著高于未添加TI抗原组(p＜0.05)，添加2倍TI抗原组中和抗体高于添加1倍TI抗原组，但差异不显著(p＞0.05)，说明添加TI免疫原后可以明显的提高灭活疫苗和蛋白亚单位疫苗所诱导的中和抗体水平。单独OA-VP1免疫组可以检测到针对O型和Asia1两个血清型FMDV的中和抗体(表3与表4)，且其水平略低于单独双价苗免疫组，但差异不显著，说明用OA-VP1作为蛋白亚单位疫苗的雏形有较好的免疫效果(图3与图4)。

表3免疫小鼠血清FMDV中和抗体效价测定(O型)

表4免疫小鼠血清FMDV中和抗体效价测定(Asia 1型)

2.3小鼠脾脏T细胞表面CD4，CD8，CD3的检测

对分离的小鼠脾淋巴细胞用抗CD4，CD8与CD3的荧光抗体进行染色，利用FACSAria流式细胞仪检测增殖结果，用CellQuest软件获取数据。在前散射光(FSC)与对侧散射光(SSC)的二维散点图中划出淋巴细胞区P1，在P1区内计数1×104个细胞。利用多参数流式细胞术分析淋巴细胞的种类。通过不同的荧光通道采集CD3，CD4与CD8阳性标记细胞的荧光信号并计数(图5)，用CellQuest软件分析CD4+T细胞和CD8+T细胞占所选定P1细胞区内细胞总数的百分比。各组细胞数及百分比见表5。由表5可知，6个免疫组小鼠CD4+T与CD8+T细胞数均有明显的升高，与阴性对照组相比有非常明显的差异；无论是灭活疫苗或者OA-VP1蛋白亚单位疫苗，添加TI抗原免疫后小鼠CD4+T细胞所占比例有明显的升高，对TI抗原加OA-VP1蛋白亚单位疫苗免疫组CD8+T细胞的比例也有所升高，说明添加TI抗原对于细胞免疫有明显的促进作用。

表5.各实验小组小鼠脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞数及百分比

2.4小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的检测

根据建立的标准曲线来计算各组小鼠脾淋巴细胞培养物样本中的γ干扰素浓度，结果见表6。由表6可见，无论是灭活苗免疫组或者是OA-VP1蛋白亚单位疫苗免疫组，其γ于扰素的产生水平都显著高于阴性对照组(P＜0.01)；在加入TI抗原免疫后，灭活疫苗与OA-VP1免疫组小鼠的脾淋巴细胞在接受ConA刺激后，分泌γ干扰素的量都显著高于未加TI抗原的免疫组，差异显著(P＜0.05)；加入2倍剂量的TI抗原后γ干扰素的分泌水平更高，与灭活苗或者OA-VP1单独免疫组相比差异极显著(P＜0.01)。通过测定不同免疫组γ干扰素的产生水平，进一步说明了添加TI抗原可以显著的提高细胞免疫的水平。

表6.各实验小组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量

3讨论

疫苗接种是特异性预防FMD的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、病毒逃逸出疫苗生产厂等不安全因素，促使人们寻求一种更加安全有效的FMD疫苗。

利用各种表达系统表达FMDV的主要免疫原蛋白，研制基因工程亚单位疫苗是目前研究的热点。由于亚单位疫苗只含有病原体的一部分，不会引起动物发病，在生物安全性方面优于传统疫苗。研究表明，结构蛋白VP1第141～160氨基酸和200～213氨基酸区段是FMDV的两个优势中和表位，很多FMDV表位疫苗的研究都包含了以上两个主要的抗原表位，并取得了较好的免疫效果[7-9]。其中，VP1141-160位氨基酸所形成的G-H环暴露在病毒粒子的表面，是最为重要的抗原决定簇，该区段在不同血清型和同一血清型的不同谱系毒株之间差异很大，是造成不同疫苗毒株缺乏交叉免疫保护性的主要因素。在口蹄疫基因工程亚单位疫苗的研究方面，如何高效表达抗原谱广、免疫原性强的病毒抗原蛋白是一个需要解决的关键难题。

本研究中设计表达了O型与Asia1型双血清型的融合VP1蛋白，并设计表达了一种包含FMDV结构蛋白与非结构蛋白中多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原，期望将双血清型的VP1蛋白与该T细胞免疫原组合，研制一种新型的口蹄疫蛋白亚单位疫苗。通过在小鼠的免疫试验，初步证明，双血清型的VP1蛋白能够刺激小鼠产生针对两个血清型的中和抗体，而且添加表达的T细胞免疫原后能够进一步刺激免疫小鼠产生更高水平的体液与细胞免疫应答，说明细胞免疫与体液免疫具有协同性，也说明采用T细胞免疫原与主要抗原蛋白组合免疫具有很好的免疫效果，应当是口蹄疫蛋白亚单位疫苗研究的努力方向。

本研究中所用的T细胞表位包括了结构蛋白VP4与非结构蛋白3A和3D上的保守的T细胞表位，以及来自麻疹病毒和耶尔森氏菌属的侵袭素(invasin)中的两个泛T细胞表位，目的是能够诱导大多数的动物均能够产生较强的细胞免疫应答，对T细胞表位的识别受宿主表达MHC分子的多样性限制，因而在设计T细胞免疫原时选择使用了通用性的T细胞表位。除此之外，在该T细胞免疫原中还引入两个位于VP1蛋白中的细胞毒性T细胞(Tc)表位，Tc表位与记忆性免疫有关，因而，期望所设计的T细胞免疫原能够诱导宿主产生强而持久的保护性免疫，流式检测结果也证明，所设计的T细胞免疫原对诱导CD8+T细胞增殖具有一定的作用。所用两个泛T细胞表位包括来自细菌侵袭素的一段16个氨基酸的T细胞表位，该区段已被证明是一种强免疫刺激剂[10]。泛T细胞表位(PADRE)属于Th细胞表位家族，已被证实可以诱导多种动物如大鼠，豚鼠，猪等产生较强的细胞免疫应答[11-13]。通过诱导产生强的细胞免疫应答，以促进针对FMDV特异性中和抗体的产生。FMDV的免疫是典型的细胞依赖性体液免疫应答，单纯的B细胞表位抗原诱导机体产生的免疫保护作用非常有限，因而通用性T细胞表位的引入对提高细胞免疫应答的水平具有重要的作用[13]。

本研究结果表明，所设计的T细胞免疫原可以进一步促进口蹄疫常规疫苗与蛋白亚单位疫苗免疫小鼠产生更高水平的中和抗体，这种效应与其诱导产生的高水平细胞免疫呈正相关，说明添加T细胞免疫原可以有效的提高口蹄疫疫苗的免疫效果，有望用于口蹄疫亚单位疫苗与高效灭活疫苗的研究，提高基因工程疫苗与灭活疫苗的免疫效果。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

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