一株木霉K9301菌株及其在制备木霉蛋白酶中的应用

摘要

本发明涉及一株木霉K9301菌株及其在制备木霉蛋白酶中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开了一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，2010年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2010223；及该菌株在制备木霉蛋白酶中的应用。本发明公开的木霉K9301可以高产木霉蛋白酶，该酶对于由植物病原真菌Pyrenophoratritici-repentis，Sclerotium cepivorum和Sclerotinia sclerotiorum引起的疾病有显著的防治效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株及其在制备木霉蛋白酶中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

木霉是一类典型的生物防治菌株。木霉属中许多种类比如哈茨木霉、绿色木霉、康宁木霉都已被开发成为生防制剂。木霉对于病原真菌的拮抗作用是通过分泌细胞壁降解酶，产生抗生肽，诱导植物抗性，争夺营养与空间以及重寄生作用等机制协同实现的。木霉产的蛋白酶是一种细胞壁降解酶，它可以降解病原真菌细胞壁中的蛋白成分，并且失活病原真菌分泌的重要酶类，从而在木霉抗真菌过程中发挥作用。有报道从哈茨木霉中分离的蛋白酶抑制Botrystiscinerea的菌丝生长及孢子萌发，另外许多高产蛋白酶的木霉突变体的拮抗效果明显提高。

蛋白酶是一大类可以降解蛋白质的水解酶类，根据催化结构域中功能基团的不同，它可以分为丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶四大类。根据作用最适pH值的不同可以分成酸性蛋白酶，中性蛋白酶和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶在洗涤等工业领域得到了广泛应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株及采用该菌株并利用浅层固体发酵技术制备具有抑制植物病原真菌功能的木霉蛋白酶的方法。

一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，2010年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2010223，地址：中国，武汉，武汉大学。

木霉K9301菌株，能够在以纤维素、半纤维素为碳源、以硫酸铵、豆粕为氮源的培养基中快速生长，并且该木霉菌株高产蛋白酶，该蛋白酶可抑制植物病原真菌的生长，在植物真菌病害的防治中具有很好的应用潜力。

上述木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株在制备木霉蛋白酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)将菌种保藏号为：CCTCC NO：M2010223的木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)经活化培养基活化后，接种至液体培养基进行培养，然后接种至液体发酵罐培养基发酵，制得液体菌种；

(2)按每百重量份浅层固体发酵培养基接种6～8重量份经步骤(1)制得的液体菌种，在25～28℃，空气相对湿度80～85％的条件下，浅层固体发酵3～4天，发酵期间每隔20～30小时翻曲一次，制得木霉蛋白酶发酵培养物；

(3)将步骤(2)制得的木霉蛋白酶发酵培养物按1∶(5～8)的重量比加水浸泡11～12小时，板框过滤，过滤液即为蛋白酶的提取液；

(4)将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液经浓缩后，加入稳定剂，即得。

步骤(1)中的活化培养基、液体培养基、液体发酵罐培养基成分及活化、培养、发酵条件均可采用本领域常用技术，优选方案如下：

活化培养基的制备方法及活化条件如下：

活化培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与4～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得活化培养基；

活化条件：划线接种木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，28～30℃活化25～35h，经与无菌水混合后得菌悬液。

液体培养基的制备方法及培养条件如下：

液体培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与3～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得液体培养基；

培养条件：按3～5％重量百分比的接种量接种经活化后的菌悬液，28～30℃摇床培养25～35h，得菌液。

液体发酵罐培养基的制备方法及发酵条件如下：

液体发酵罐培养基的制备方法：将麸皮10～15重量份与水100重量份，混合，煮沸半小时后，过滤，再加入蛋白胨0.5～0.6重量份、Na₂HPO₄ 0.3～0.5重量份、KH₂PO₄ 0.04～0.05重量份，混匀后灭菌，即得液体发酵罐培养基；

发酵条件：按每百重量份液体发酵罐培养基接种6～8重量份经培养后的菌液，28～30℃通风搅拌，发酵30～36小时，得液体菌种。

所述步骤(2)中的浅层固体发酵培养基按如下步骤制得：

将玉米秸粉或小麦秸粉30～40重量份，麸皮30～40重量份，豆粕20～30重量份，硫酸铵0.5～1.0重量份，混合后，制得原料；然后按原料∶水＝1∶4(重量比)混合，灭菌，冷却后，即得。

所述步骤(2)制得的蛋白酶发酵培养物活性为500～700U/g干曲。

所述步骤(4)中的浓缩，步骤如下：

将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜浓缩，浓缩至原来体积的1/10～1/5，制得高活性液体木霉蛋白酶，其蛋白酶活性为1000～1500U/ml；然后，在高活性液体木霉蛋白酶中加入1～2％(重量百分比)的稳定剂。

所述步骤(4)中的稳定剂为海藻糖。

所述步骤(4)中加入稳定剂操作后，再经质检、包装成品，制得木霉蛋白酶。

有益效果：

(1)本发明公开的木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)可以高产木霉蛋白酶，该酶对于由植物病原真菌Pyrenophora tritici-repentis，Sclerotium cepivorum和Sclerotiniasclerotiorum引起的疾病有显著的防治效果；

(2)本发明以木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)为菌株，采用农作物秸秆、麦麸、豆粕等廉价原料，利用液体深层发酵技术，发酵生产液体菌种，然后应用浅层固体发酵技术，在无菌条件下，发酵生产木霉蛋白酶培养物，提取、浓缩制备液体木霉蛋白酶，应用于防治植物真菌病害，可产生很好的经济和社会效益。

(3)本发明制得的蛋白酶，稳定性好，可高效抑制植物病原真菌，可用于防治植物真菌病害，从而可减少农药的用量，降低农产品中农药的残留，符合目前对无公害农产品生产的迫切需求。

(4)本发明采用农业废弃物作物秸秆为原料，解决了作物秸秆无法高效、资源化利用的难题，不仅节约了资源，而且减少了对环境的污染，在开发利用农作物秸秆的同时，无三废排出，是一条农业废弃物资源化、高值化、生态化利用的有效途径。

附图说明

图1木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)蛋白酶抑菌活性的检测。

图中：1、300μl蛋白酶提取液；2、150μl蛋白酶提取液；3、50μl蛋白酶提取液；4、300μl双蒸水。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，2009年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2010223。

木霉K9301菌株，能够在以纤维素、半纤维素为碳源、以硫酸铵、豆粕为氮源快速生长，并且该木霉菌株高产蛋白酶，该蛋白酶可抑制植物病原真菌的生长，在植物真菌病害的防治中具有很好的应用潜力。

实施例2

上述木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株在制备木霉蛋白酶中的应用，步骤如下：

(1)将菌种保藏号为：CCTCC NO：M2010223的木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)经活化培养基活化后，接种至液体培养基进行培养，然后接种至液体发酵罐培养基发酵，制得液体菌种；

活化培养基的制备方法及活化条件如下：

活化培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与5重量份的水混合，80℃浸泡1小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1.5份，琼脂1.5份，自然pH值，8磅灭菌，即得活化培养基；

活化条件：划线接种木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，28～30℃活化30h，经与水混合后得菌悬液。

液体培养基的制备方法及培养条件如下：

液体培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与4重量份的水混合，80℃浸泡1小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1.5份，自然pH值，8磅灭菌，即得液体培养基；

培养条件：按3％重量百分比的接种量接种经活化后的菌悬液，28～30℃摇床培养30h，得菌液。

液体发酵罐培养基的制备方法及发酵条件如下：

液体发酵罐培养基的制备方法：将麸皮10重量份与水100重量份，混合，煮沸半小时后，过滤，再加入蛋白胨0.5重量份、Na₂HPO₄ 0.4重量份、KH₂PO₄ 0.04重量份，混匀后灭菌，即得液体发酵罐培养基；

发酵条件：按每百重量份液体发酵罐培养基接种6重量份经培养后的菌液，26～28℃通 风搅拌，发酵30小时，得液体菌种；

(2)按每百重量份浅层固体发酵培养基接种6重量份经步骤(1)制得的液体菌种，在26～28℃，空气相对湿度80～85％的条件下，浅层固体发酵发酵4天，发酵期间每隔25小时翻曲一次，制得木霉蛋白酶发酵培养物，蛋白酶发酵培养物活性为600U/g干曲；

所述的浅层固体发酵培养基按如下步骤制得：

将小麦秸粉30重量份，麸皮30重量份，豆粕30重量份，硫酸铵0.5重量份，混合后，制得原料；然后按原料∶水＝1∶4(重量比)混合，灭菌，冷却后，即得；

(3)将步骤(2)制得的木霉蛋白酶发酵培养物按1∶6的重量比加水浸泡11小时，板框过滤，过滤液即为蛋白酶的提取液；

(4)将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液经浓缩后，加入海藻糖，即得；

所述步骤(4)中的浓缩，步骤如下：

将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜浓缩，浓缩至原来体积的1/5，制得高活性液体木霉蛋白酶，其蛋白酶活性为1500U/ml；然后，在高活性液体木霉蛋白酶中加入1.5％(重量百分比)的海藻糖，再经质检、包装成品，制得木霉蛋白酶。

实施例3

实施例2中所制得的木霉蛋白酶的抑菌活性分析，步骤如下：

(1)双层培养基平板的制备，底层采用2％的琼脂培养基，在每个培养皿(直径90mm)中加入10ml底层培养基。上层采用含有指示菌的琼脂培养基，指示菌为植物病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schlecht ACCC3037)，将5ml冷却至45℃的上层培养基倒入已凝固的底层培养基表面，冷却后即为双层培养基平板。

琼脂培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与4～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得琼脂培养基；

(2)在步骤(1)中制得的双层培养基平板上轻轻放置无菌牛津杯(内径6.0mm，外径7.8mm，高度10.0mm)，每皿放置4个，牛津杯之间距离相等。然后在3个牛津杯中分别加入300μl、150μl和50μl实施例2中制得的木霉蛋白酶提取液，第4个杯中加入300μl无菌水作为对照。

(3)将步骤(2)中加入了木霉蛋白酶提取液的双层培养基平板置于28℃的恒温培养箱中进行培养，24h后测定抑菌圈直径。150μl木霉蛋白酶提取液的抑菌直径为2.0±0.4cm，300μl木霉蛋白酶提取液的抑菌直径为3.3±0.5cm，对照孔中的300μl无菌水对尖孢镰刀菌的菌丝生长有影响。这表明实施例2中制得的木霉蛋白酶提取液对植物病原菌尖孢镰刀菌具有明显的抑制作用。实验结果如图1所示。

实施例4

如实施例2所述的应用，不同之处在于：

液体培养基的制备方法及培养条件：

液体培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与6重量份的水混合，80℃浸泡1小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1份，自然pH值，8磅灭菌，即 得液体培养基；

培养条件：按3％重量百分比的接种量接种经活化后的菌悬液，28℃摇床培养30h，得菌液。

液体发酵罐培养基的制备方法及发酵条件如下：

液体发酵罐培养基的制备方法：将麸皮15重量份与水100重量份，混合，煮沸半小时后，过滤，再加入蛋白胨0.5重量份、Na₂HPO₄ 0.5重量份、KH₂PO₄ 0.05重量份，混匀后灭菌，即得液体发酵罐培养基；

发酵条件：按每百重量份液体发酵罐培养基接种6重量份经培养后的菌液，28℃通风搅拌，发酵35小时，得液体菌种。

实施例5

如实施例2所述的应用，不同之处在于：

浅层固体发酵培养基及培养方法：

浅层固体发酵培养基按如下步骤制得：

将玉米秸粉40重量份，麸皮35重量份，豆粕20重量份，硫酸铵0.5重量份，混合后，制得原料；然后按原料∶水＝1∶4(重量比)混合，灭菌，冷却后，即得；

培养方法：

按每百重量份浅层固体发酵培养基接种6重量份经步骤(1)制得的液体菌种，在28℃，空气相对湿度80～85％的条件下，浅层固体发酵发酵4天，发酵期间每隔24小时翻曲一次，制得木霉蛋白酶发酵培养物，蛋白酶发酵培养物活性为600U/g干曲。