菊属异色菊耐寒基因DdICE1及其植物表达载体和构建方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，涉及菊属异色菊耐寒基因DdICE1及其表达载体和构建方法。DdICE1基因的序列为SEQ ID NO.1，所述的表达载体是将DdICE1基因插入到gateway入门载体pENTR1A的Sal I和Not I酶切位点之间，重组的pENTR1A-DdICE1质粒Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应得到的。直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐寒新种质，提高植物的耐寒性，可进行植物品种改良。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及菊属异色菊耐寒基因DdICE1及其植物表达载体和构建方法。

背景技术

低温是影响植物地理分布、产量和品质的主要限制因子。因此，有关植物抗寒性的研究一直是植物学研究领域的热点之一。菊花原产我国，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值极高，在花卉生产中占有重要地位。低温是限制菊花周年供应的主要限制因子，为满足市场需求，冬季需借助加温进行生产。然而，昂贵的加温成本和巨大的能源消耗已成为当前菊花产业发展的瓶颈。菊花抗寒育种一直是国内外园艺工作者致力的重要课题之一，鉴于抗寒性是一个多基因控制的数量性状，杂交育种等常规育种方法效率低。已有研究表明，转高效抗寒调控基因的分子育种对提高植物抗寒性有积极作用。

目前，很多抗寒相关基因被克隆，结果显示单独改变某一个或几个功能基因对植株抗寒性的提高并不显著。ICE1基因是已知的低温诱导表达基因分子级联路径最上游的转录激活因子，也是已知的最高效抗寒调控基因(Badawi et al.2008；Chinnusamy et al.2003)。受ICE1基因调控表达的冷调节基因多达数百个，涉及抗寒的各种生理生化代谢途径(Lee et al.2005)。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将抗寒基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐寒特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

参考文献：

Badawi M，Reddy YV，Agharbaoui Z，Tominaga Y，Danyluk J，Sarhan F，Houde M(2008)Structure and functional analysis of wheat ICE(inducer of CBF expression)genes.Plant Cell Physiol 49：1237-1249

Chinnusamy V，Ohta M，Kanrar S，Lee BH，Hong X，Agarwal M，Zhu JK(2003)ICE1：a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis.Genes Dev 17：1043-1054

Earley KW，Haag JR，Pontes O，Opper K，Juehne T，Song K，Pikaard C S(2006)Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.Plant J 45：616-629

Lee BH，Henderson DA，Zhu JK(2005) The Arabidopsis cold-responsive transcriptome and its regulation by ICE1.Plant Cell 17：3155-3175

发明内容

针对背景技术提出的解决提高菊花耐寒性的问题，本发明的目的在于提供一个新的菊属异色菊耐寒基因DdICE1，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

本发明的另一目的在于该耐寒基因DdICE1的植物表达载体。

本发明的又一目的在于提供该耐寒基因DdICE1的植物表达载体的构建方法。

本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制耐寒新种质，可用于植物品种改良。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

菊属异色菊耐寒基因DdICE1，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

菊属异色菊耐寒基因DdICE1的克隆：以提取的异色菊幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增DdICE1基因，

上游引物DdICE1-F：SEQ ID NO.2

下游引物DdICE1-R：SEQ ID NO.3

以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，测定的序列为SEQ ID NO.1。

菊属异色菊耐寒基因DdICE1的植物表达载体，由本发明所述的菊属异色菊耐寒基因DdICE1与载体质粒pEarleyGate103构成。

上述的菊属异色菊耐寒基因DdICE1的植物表达载体，所述的植物表达载体为DdICE1基因插入到gateway入门载体pENTR1A的Sal I和Not I酶切微点之间，重组载体再与pEarleyGate103表达载体质粒进行重组反应得到。

菊属异色菊耐寒基因DdICE1植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1的构建方法如下：

以提取的异色菊幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物以菊属异色菊cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在DdICE1基因的上游和下游分别引入SalI和Not I酶切位点，

上游引物DdICE1-gateway-F：SEQ ID NO.4

下游引物DdICE1-gateway-R：SEQ ID NO.5

PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，由Sal I和Not I双酶切得到的DdICE1片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取阳性质粒经Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证，植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1构建成功。

DdICE1的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物抗寒性，方法如下：(1)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化；(2)拟南芥花序浸染及种子筛选；

(3)PCR鉴定及抗寒评价。

本发明的有益效果：

1.本发明提供的菊属异色菊DdICE1是一个新的耐寒基因，该基因可提高植物耐寒性。

2.本发明构建的菊属异色菊基因DdICE1植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐寒新种质，提高植物的耐寒性，可进行植物品种改良。

附图说明

图1为DdICE1琼脂糖凝胶电泳分析。

M：DNA Marker

1：DdICE1；2：pMD 19-T Simple-DdICE1质粒Sal I和Not I双酶切；

3：pEarleyGate103-DdICE1表达载体电泳检测图

图2为植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1图谱。

图3为植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1构建过程示意图。

图4野生型与转基因拟南芥PCR鉴定。

图5野生型与转基因拟南芥抗寒性评价。

具体实施方式

实施例1DdICE1的克隆：

选用菊属异色菊(Dendranthema dichrum)作为材料，选取健康的插条，扦插成活的幼苗(20天)于低温(4℃)连续胁迫处理7天，取0.05g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照拟南芥ICE1序列信息(NCBI登录号：AT3G26744)，经Oligo6.0软件分析设计引物扩增DdICE1；

上游引物DdICE1-F：5′-ATGCTACCGGAAAACGACA-3′(SEQ ID NO.2)

下游引物DdICE1-R：5′-AATGGCACCATGATAACCT-3′(SEQ ID NO.3)

以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，

50μL反应体系：10×RCR Buffer 5.0μL，DdICE1-F、DdICE1-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，Taq DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.8μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，反应33个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T₄DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，序列测定为SEQ ID NO.1；

实施例2植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1的构建

设计引物进行PCR反应，在目的基因DdICE1的上游和下游分别引入酶切位点Sal I和Not I，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，Sal I和Not I双酶切的DdICE1片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应(Invitrogen，USA)，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO.1。上游引物DdICE1-gateway-F：5′-GCGTCGACATGCTACCGGAAAACGACA-3′(SEQ IDNO.4)，下游引物DdICE1-gateway-R：5′-TTGCGGCCGCGAAATGGCACCATGATAACCT-3′(SEQ ID NO.5)。

(1)以菊属异色菊叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR^TM HS DNAPolymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS RCR Buffer 5.0μL，DdICE1-gateway-F、DdICE1-gateway-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.6μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收，连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-TSimple-DdICE1；

(2)取gateway入门载体pENTR1A(Invitrogen，USA)和pMD 19-T Simple-DdICE1用Sal I和Not I双酶切，双酶切体系(50μL)：10×H Buffer 5μL，BSA 5μL，质粒pENTR1A或pMD19-T Simple-DdICE1 15μL，Sal I 2μL，Not I 2μL，ddH₂0 21μL；37℃反应3h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTR1A大片段和pMD19-T Simple-DdICE1小片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10μL)：10×T₄ ligase Buffer 1μL，pENTR1A大片段2μL，pMD19-TSimple-DdICE1小片段6μL，T₄DNA连接酶1μL；16℃过夜连接反应，取5μL连接产物转化TOP10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTR1A-DdICE1。

(3)取质粒pENTR1A-DdICE1用Nsi I单酶切，酶切体系(20μL)：10×RE Buffer 2μL，Acetylated BSA 2μL，质粒pENTR1A-DdICE1 10μL，Nsi I 1μL，ddH₂O 5μL；37℃反应3h，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTR1A-DdICE1大片段。将回收的片段与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，反应体系(5μL)：pENTR1A-DdICE1大片段3μL，pEarleyGate103质粒1μL，LR Clonase^TM II enzyme mix 1μL；25℃反应1h，加入1μL Proteinase K，37℃反应10min；取2μL重组产物转化TOP10感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pEarleyGate103-DdICE1，电泳和测序验证。植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1的构建成功。

实施例3植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1遗传转化拟南芥及其抗寒性鉴定

(1)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。

取10μL pEarleyGate103-DdICE1载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。

(2)拟南芥花序浸染及种子筛选

将阳性单克隆接到50mL的YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200μL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。

种子消毒与播种：将种子放入1.5mL的离心管中，加入1mL 75％酒精，添加0.1％的Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95％的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(1/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。

(3)PCR鉴定及抗寒评价

待抗性苗7～8片叶，提取拟南芥叶片DNA，进行PCR(引物DdICE1-F和DdICE1-R)鉴定(图4)。经PCR鉴定的T₁代转基因苗继续生长，采收T₂代种子。对野生型和T₂代抗性转基因拟南芥进行低温(-5℃、-10℃)处理2h，15天后比较抗寒性，发现转基因拟南芥(DdICE1-13)成活率高于野生型拟南芥(图5)。

综上所述，本发明构建了含有耐寒基因的植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1，其中DdICE1首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的抗寒特性。