鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗和它的制备方法。疫苗的主要成分是由鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌五种细菌的灭活菌体混合而成。它的制备方法是将上述五种细菌分别制成109～1010cfu/mL的菌悬液经福尔马林灭活后按1∶1∶1∶1∶1比例等体积混合制成鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液，然后将鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与浓度为15～35mg/mL的黄芪多糖佐剂原液按1∶1的比例均匀混合后制成。本发明具有多重的免疫效果，一次接种后可以有效预防鲆鲽鱼类五种细菌性病原菌的感染，为海水鱼类多联灭活疫苗的研发提供了依据。

说明书

技术领域：

本发明属于海水鱼类疫苗的制备技术，是通过增加疫苗中灭活的鱼类病原菌种类和添加黄芪多糖来增强疫苗免疫效果的一种技术方法。

背景技术：

鲆鲽鱼类是我国北方工厂化海水养殖的主要品种，对我国沿海地区的渔业经济发展做出了重要贡献。近几年，随着鲆鲽类养殖产业规模和产量的迅速扩大，疾病成为养殖生产面临的主要问题之一。疾病频繁的发生，对养殖的成活率形成直接威胁，造成的经济损失已经在一定程度上制约了产业的健康平稳发展。

中国水产科学研究院黄海水产研究所已对我国的养殖鲆鲽类进行了全面、系统的疾病流行病学研究，发现了鲆鲽类20余种典型的疾病症状，并对它们的病原进行了细致、深入的研究。研究发现鲆鲽类的大多数疾病是由细菌性病原引起的，而鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌是鲆鲽类养殖过程中最为常见的五种病原菌，可以造成烂鳍、腹水、肠炎、红体、肌肉脓肿等多种明显的表观症状。因为细菌性疾病是我国养殖鲆鲽类的主要疾病，广大鲆鲽类养殖者在国内没有商业化的鲆鲽类疫苗可用的情况下，主要依赖抗生素和化学类药物来防御疾病。而长期使用抗生素，不仅容易使病原菌产生耐药性，增加后续预防疾病的困难，而且其药残问题也关联到养成商品鱼的食品质量安全。因此，开发鲆鲽类养殖专用疫苗迫在眉睫。

通过注射疫苗来预防病原感染，是具有特异性免疫系统的动物行之有效的无公害疾病防治技术。这一技术方法在海水养殖鱼类中同样适用。在本发明作出之前，国内外有N.Castro等(Development of an effective Edwardsiella tarda vaccine for cultured turbot Scophthalmus maximus.Fish & Shellfish Immunology，Volume 25，Issue 3，September 2008)对大菱鲆的爱德华菌疫苗，曹宏梅等对鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果(中国水产科学，2006年13卷第3期)，朱开玲等对大菱鲆的鳗弧菌灭活疫苗等方面展开了研究(高级技术通讯，2004年第2期)。他们的研究主要集中在用1种或2种大菱鲆的细菌病原制备疫苗，而且没有使用黄芪多糖作为疫苗佐剂，与本发明相比，无论在疫苗组成还是疫苗功能上都存在明显的不同。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗，它具有多重的免疫效果，对鲆鲽鱼类一次接种免疫后可以有效预防5种细菌性病原菌的感染，能够显著降低细菌性疾病的发病率。

本发明采用如下技术方案：

鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗是由灭活的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌的菌悬液等体积混合制成。

所述的鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗，优选的由灭活的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌的菌悬液和黄芪多糖溶液混合制成。

所述的鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗，优选的各成份浓度为：鳗弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，大菱鲆弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，哈维氏弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，溶藻胶弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，迟钝爱德华氏菌10⁸～10⁹cfu/mL，黄芪多糖7.5～17.5mg/mL。

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗的制备方法。

本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案如下：

(1)将能够感染鲆鲽类发病的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌接种到胰蛋白胨大头肉汤培养基(TSB)平板上，28℃培养24h-48h进行复苏；

(2)分别挑取上述5株病原菌到TSB液体培养基中，28℃条件下110～120r/min的转速振荡培养24h，收集培养液在4℃条件下5000rpm离心5分钟，将离心后的沉积菌体用pH＝7.2的PBS缓冲液(成份：NaCl 8.0g/L；KCl0.2g/L；Na₂HPO₄ 1.15g/L；KH₂PO₄ 0.2g/L，去离子水配制。)冲洗3遍后，用灭菌后的1.5％(重量比)的NaCl溶液分别制成10⁹～10¹⁰cfu/mL的菌悬液原液；

(3)将五种病原菌的菌悬液原液分别灭活后，1∶1∶1∶1∶1等体积混合，即为鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液。

(4)将上述步骤(3)得到的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液和黄芪多糖佐剂原液按1∶1的体积比混合，振荡均匀后即为含黄芪多糖佐剂的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。

所述的五种病原菌菌悬液的灭活，为分别在哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌菌悬液中添加0.5％(v/v)的福尔马林溶液；在大菱鲆弧菌和鳗弧菌菌悬液中添加1.0％(v/v)的福尔马林溶液；在爱德华氏菌菌悬液中添加1.5％(v/v)的福尔马林溶液，28℃条件下110～120r/min的转速振荡灭活处理48h后，用PH＝7.2的PBS缓冲液洗脱3次去除福尔马林。

所述的黄芪多糖佐剂原液，是将多糖含量≥78.2％的黄芪多糖(APS)原粉用蒸馏水溶解，配制成黄芪多糖浓度为15～35mg/mL的溶液，经115℃高压灭菌10min后，自然冷却制备而成。

本发明与已有技术对比其特点是：

1、本发明的疫苗菌种是经过鲆鲽类流行病学和病原学研究而筛选出来的，菌株的致病力强，具有较强的针对性和代表性，经灭活后可显著提高接种对象的特异和非特异性免疫指标。

2、本发明实现了鲆鲽鱼类疫苗的多重免疫效果，一次接种就可以有效预防鲆鲽类5种重要病原细菌的感染，能够有效降低由这些病原菌引发的疾病的发生率，对鲆鲽鱼类的保护率为30％-71.4％。

3、本发明适用对象多，能够用于现有中国全部养殖鲆鲽类品种的免疫接种。

附图说明：

图1为含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗接种大菱鲆后56天内的抗体效价变化图；

图2为不含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗原液接种大菱鲆后56天内的抗体效价变化图。

具体实施方式：

下面通过实施例详细叙述本发明的材料、使用方法和免疫效果：

本实施案例是按如下技术方案做出的：进行鲆鲽类的流行病学调查，分离纯化细菌性病原并确定用于制备疫苗的重要病原菌株，对菌株进行甲醛灭活实验并优化灭活参数，以大菱鲆为对象接种疫苗并检验免疫指标，通过人工攻毒实验检验免疫保护率等过程。

1、流行病学调查与重要致病原的筛选：

通过对养殖大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等我国主要的鲆鲽鱼类养殖品种9年的流行病学调查和研究，发现烂鳍、腹水、肠炎、鼓眼、疥疮、红体等病症是养殖过程中的常见疾病。经过分离这些疾病的病原，并经过纯化培养和人工攻毒实验，发现鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌这5种细菌都可以导致上述鲆鲽鱼类疾病的多种症状。因此确定这5种细菌为鲆鲽鱼类最具代表性的细菌性病原，并将它们作为制备鲆鲽类五联疫苗的源菌株。

2、菌株的甲醛灭活及疫苗制备：

将低温保存的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌这5株鲆鲽类病原菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)平板培养基上28℃培养24h-48h进行活化复苏。分别挑取复苏后的5株病原菌单菌落接种到TSB液体培养基中，28℃条件下110～120r/min的转速振荡培养24h后，收集培养液在4℃条件下5000rpm离心5分钟，将离心后的沉积菌体用PH＝7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后，用灭菌的1.5％(重量比)的NaCl溶液分别制成10⁹cfu/mL的菌悬液原液。

上述5株菌的菌悬液原液每种取5份，分别加入不同浓度(v/v)的福尔马林溶液，即0.01％、0.03％、0.05％、0.10％、0.15％，28℃条件下110～120r/min的转速振荡灭活数小时。期间每隔4h取0.1mL的菌液涂布于TSB平板，每组2个平行，置于28℃培养一周，观察平板上是否有菌落生长。若无菌落生长则证明菌株已被完全灭活。

多次重复上述实验，最终确定5株病原菌用福尔马林溶液灭活的最佳条件分别为：哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌以0.5％(v/v)终浓度的福尔马林溶液、大菱鲆弧菌和鳗弧菌以1.0％(v/v)终浓度的福尔马林溶液、爱德华氏菌以1.5％(v/v)终浓度的福尔马林溶液处理48h能够达到最佳灭活效果(见表1)。

将五种病原菌的菌悬液原液按上述最佳条件分别灭活后，用PH＝72的PBS缓冲液，洗脱已被完全灭活的菌液3次以去除福尔马林。将洗脱好的5种菌液1∶1∶1∶1∶1等体积混合即为鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液，4℃条件下保存备用。

将多糖含量≥78.2％的黄芪多糖(APS)原粉用蒸馏水溶解，配制成浓度为25mg/mL的黄芪多糖佐剂原液，以115℃高压灭菌10min，自然冷却后放置于4℃条件下保存备用。

将上述鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与灭菌的黄芪多糖佐剂原液以1∶1的体积比混合均匀，即为含黄芪多糖的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。

表1五株病原菌的福尔马林灭活效果

注：实验在28℃条件下进行。+表示TSB培养基上有菌落生长；-表示TSB培养基上无菌落生长；+(-)表示有两种实验结果。

3、接种大菱鲆并检验免疫指标：

取180条平均体重为50g的大菱鲆作为实验用鱼，按每组60条鱼分为3组，每组分别注射含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗、不含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗原液和灭菌的1.5％(重量比)NaCl溶液。其中注射含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗组为实验组1，注射不含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗原液组为实验组2，注射1.5％(重量比)NaCl溶液为对照组。每尾大菱鲆的注射剂量为0.2ml(体重的4‰)，首次注射7d后用同样方法加强注射一次，共注射2次。

实验进行过程中的第7、14、21、28、35、42、56d分别采血一次，测定受免大菱鲆的抗体效价和各项免疫指标。结果显示实验组1和实验组2的大菱鲆对哈维氏弧菌、鳗弧菌、爱德华氏菌、溶藻胶弧菌、大菱鲆弧菌的特异性抗体在初次免疫后第7天开始上升，在第28天达到最大，然后缓慢下降。其中实验组1的受免大菱鲆在第28天抗体效价哈维氏弧菌、鳗弧菌、爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻弧菌分别为2^7.25、2^6.75、2^8.5、2^8.75、2^6.25(附图1)，实验组2上述数据分别为2⁶、2^5.75、2^6.75、2^7.5、2⁵(附图2)。本实验跟踪实验组1和实验组2抗体效价到第56天，结果显示各组仍然具有比对照组高的抗体效价。

溶菌酶结果(表2)显示，实验组1和实验组2的大菱鲆血清中的溶菌酶活力从注射后第14天开始明显升高，并都在第28天达到最大值，此后开始逐渐下降，但到56d时仍然保持比对照组高的活力，显著高于对照组。而对照组在整个实验中没有明显变化。

表2受免大菱鲆血清溶菌酶活力

注：上标英文小写字母不同，代表同一列各数据差异显著；下标大写字母不同，代表同一行数据差异显著。

SOD(超氧化物歧化酶)测定结果(表2)显示，在五联灭活疫苗中添加黄芪多糖佐剂有利于进一步提高大菱鲆血清中SOD活力。2个实验组与对照组相比都表现了更高的活力(P＜0.05)，第28天实验组1和实验组2的SOD活力同时达到最高值，并且实验组1显著高于实验组2(P＜0.05)；第56d实验组1仍显著高于免实验组2(P＜0.05)，结果证实实验组1的SOD活力相对于实验组2更为稳定而且持久。

表3免疫大菱鲆血清SOD活力的比较

注：上标英文小写字母不同，代表同一列各数据差异显著；下标大写字母不同，代表同一行数据差异显著。

3、大菱鲆免疫保护率测定：

对上述2组实验组和1组对照组大菱鲆进行人工攻毒实验，以测定免疫保护率。在首次接种后的第56天，分别从实验组1、实验组2和对照组各取50尾大菱鲆，将每组的50条大菱鲆再随机分为5个平行组，每组10尾。分别以50倍的半致死浓度(LC₅₀)的哈维氏弧菌、鳗弧菌、爱德华氏菌、溶藻胶弧菌、大菱鲆弧菌活菌悬液进行腹腔注射，每尾注射0.2mL，对照组腹腔注射0.2mL无菌的1.5％浓度(重量比)的NaCl溶液。根据公式计算疫苗的免疫保护率(RPS)，计算公式为：

人工攻毒实验共进行了7天。实验结果显示实验组1和实验组2的大菱鲆都产生了一定的免疫保护率。其中实验组1对哈维氏弧菌、鳗弧菌、爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻弧菌5种菌的免疫保护率分别为50.0％、50.0％、71.4％、62.5％、44.4％；实验组2这5种菌的免疫保护率分别为37.5％、30.0％、57.1％、50％、33.3％；而对照组注射这五种菌的死亡率分别为90％、100％、70％、80％、80％。

以上实验结果证明本发明能够提升大菱鲆特异性免疫和非特异性免疫指标，在有病原菌感染的情况下明显提高了大菱鲆的相对免疫保护力。