鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201091或CCTCC NO：C201094的杂交瘤细胞分泌。本发明同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，还涉及含有所述单克隆抗体胶体金免疫层析试纸条及其在检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体在检测Pla中的应用、以及含有所述单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条及其在检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫中的应用。

背景技术

鼠疫(Plague)是由耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性烈性传染病。鼠疫免疫检测是鼠疫防治工作中的一个重要环节，其在鼠疫的发现、疫区处理及临床诊断中发挥至关重要的作用。

传统的鼠疫免疫检测，主线是针对F1抗原。F1抗原是由耶尔森氏鼠疫杆菌pMTl质粒上cafl基因编码的一种荚膜蛋白。长期以来，F1抗原被认为是鼠疫杆菌的特异性抗原，基于F1的抗原、抗体检测方法被认为是较可信的鼠疫检测和诊断方法。然而，自然界已发现存在天然缺失F1抗原的鼠疫菌株，加之，F1抗原是一种温度调控表达抗原，在37℃时大量表达，而在28℃时不予表达或微量表达，这也限制了它的应用研究范围。发展除F1抗原外的检测和诊断技术较为必要，是鼠疫防治工作中的一个重要课题。

鼠疫菌纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator，Pla)是鼠疫菌特有的pPCPl质粒编码的细胞表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌从皮下感染扩散到循环系统的重要毒力因子(Sodeinde OA，Subrahmanyam YV，Stark K，et a1.A surface protease and the invasive character of plague[J]Science，1992，258(6)：1004-1007；Goguen JD，Hoe NP，Subrahmanyam YVBK.Proteases and bacterial virulence：a view fromthe trenches[J].Infect Agents Dis，1995，4(1)：47-54)，在鼠疫菌致病过程中发挥重要作用。且Pla的转录、翻译不受温度限制。针对Pla蛋白进行检测，对于鼠疫菌的检测和/或辅助诊断鼠疫，特别是对于F1抗原缺失鼠疫菌株以及非37℃条件生长的鼠疫菌株(特别是鼠疫的传播媒介蚤的检测)具有重要意义。

目前对鼠疫菌Pla的检测主要是采用PCR技术，并取得了较好的检出效果。然而，该方法对技术操作要求比较高，且检测过程需要数小时，时间较长。

另一方面，单克隆抗体相较于多克隆抗体，具有特异性强、敏感性高的优点，可作为相关抗原的生物学功能研究的重要工具，用于Western blot、免疫沉淀、免疫细胞化学等实验，对于抗原的研究、相关疾病的检测、诊断、预后判断等具有重要意义。

但目前未见国内有关于鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，该单克隆抗体对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性。

本发明的另一个目的在于提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一个目的在于提供制备所述单克隆抗体的方法。

本发明的另一个目的在于提供所述单克隆抗体在检测Pla蛋白中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条，它具有检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫作用。该胶体金免疫层析试纸条上含有本发明所述的单克隆抗体。

本发明应用杂交瘤技术制备了鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体。

首先，本发明的一个方面是提供了一种对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性的单克隆抗体。本发明中所述的“抗体的特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，识别抗原的能力就强。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的单克隆抗体对GST(谷胱苷肽转移酶)-Pla融合蛋白、天然Pla蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。在本发明的一个优选的具体实施方案中，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO.C201091或CCTCC NO.C201094的杂交瘤细胞株分泌产生。抗体类型分别属于IgG1和IgG2a。

本发明的另一个方面提供了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，产生本发明单克隆抗体的两株杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一——中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学，邮政编码：430072)，保藏日期：2010年9月16日，保藏编号：CCTCC NO.C201091、CCTCC NO.C201094。

本发明的另一个方面提供了一种制备所述单克隆抗体的方法。

在本发明的实施方案中，是将Pla蛋白与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，以制备获得本发明的单克隆抗体。所述的标签选自谷胱苷肽-S-转移酶标签(GST标签)，在本发明的一个具体实施方案中，采用GST与去除信号肽的Pla蛋白形成的重组蛋白。

制备本发明的单克隆抗体所用的抗原可以按本领域技术人员已知的常规方法制备。例如本发明Pla蛋白可以是重组蛋白，或从鼠疫菌中提取并纯化得到的天然Pla蛋白。

在本发明的一个优选的具体实施方案中，以GST-Pla融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞作为能够产生抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行(Milstein et al.，Mechods Enzymol.，1981，73，3-46)。更具体地说，免疫细胞和骨髓瘤细胞可以按照1∶4～1∶10的比例在培养基中充分混合，在融合促进剂的作用下进行细胞融合，例如将预热至37℃的PEG(分子量1000～6000)溶液以30％～60％(W/V)的比例加入培养基。此外，还可以根据需要适当加入佐剂(如二甲基亚砜)以增强融合效果。用于融合的培养基包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基以及其他可用于此类培养的培养基，并根据需要补加适量的新生小牛血清等物质。

可以用普通的选择培养基筛选杂交瘤细胞，例如用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培养基。在HAT培养基中持续培养足够的时间，以使杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，一般为几天至几周。

然后筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞并进行单克隆化。得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。

从杂交瘤细胞制备本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于获取大量、高效价抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和色谱等方法。

在本发明的一具体实施方案中，所述制备单克隆抗体的方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对天然Pla蛋白有反应性、对谷胱苷肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物产生的腹水中获取单克隆抗体。在该方案中，具体是用纯化的GST-Pla融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠，血清效价达1∶10⁴～10⁵时，将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。HAT选择培养第10天，杂交瘤细胞融合率为65％以上。融合后第10天进行第一次ELISA筛选、亚克隆，此后重复进行ELISA筛选及亚克隆3～4次，直至克隆阳性率100％。该方案中筛选出了3株杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄，该3株杂交瘤细胞株能稳定分泌抗Pla的单克隆抗体。将这些株杂交瘤细胞扩大培养并腹腔注射BALB/c小鼠，能诱导小鼠产生抗Pla的腹水，腹水产量2～10ml/只，其效价达1∶10⁶。这对于将其应用于诊断技术创造了较好条件。

杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄所分泌产生的单克隆抗体(本发明中命名为单克隆抗体15B₈、单克隆抗体19A₄、单克隆抗体14H₄)，具有高度的抗原结合特异性。在本发明的一具体实施方案中，为分析Pla单克隆抗体的特异性，本发明用纯化的GST及GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白进行间接ELISA检测，实验结果表明，3株单克隆抗体与包被的纯化GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白均为强阳性反应，与包被的GST蛋白均为阴性反应。以天然Pla蛋白为抗原，3株单克隆抗体为一抗，HRP-SPA为二抗进行Western blot实验，结果显示3株单克隆抗体能特异性地识别提取天然蛋白中的Pla蛋白。

本发明还提供了本发明的单克隆抗体的用途。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供了所述单克隆抗体在检测Pla蛋白的水平中的应用。本发明还提供了一种检测Pla蛋白的制剂，该制剂含有本发明所述的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体特异性强、纯度高、效价高，可同时应用于ELISA方法，Western Blot杂交，免疫组织化学和细胞免疫化学方法检测Pla蛋白的表达水平。

本发明的另一个方面还提供了所述单克隆抗体在制备检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条中的应用。本发明提供了一种检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条上含有本发明所述的单克隆抗体。该含有本发明所述的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条可用于检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫。

由于本发明的单克隆抗体具有高度的抗原结合特异性，利用本发明的单克隆抗体建立检测技术，可作为鼠疫菌的检测和/或鼠疫的辅助诊断，尤其是对于F1抗原缺失鼠疫菌株及非37℃条件生长的鼠疫菌株的诊断具有重要意义。因此，本发明的另一个方面还提供了本发明的单克隆抗体在制备用于检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫的制剂中的应用。

本发明通过大量的实验研究证实：本发明的单克隆抗体，具有高度的抗原结合特异性，主要的实验证据包括：免疫小鼠应用GST-Pla融合蛋白，而获得的单克隆抗体经ELISA法检测证实，与包被纯化的GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白为强阳性反应，而与包被GST蛋白均为阴性反应，且抗体效价达10^-6。同时，以天然Pla蛋白为抗原，3株单克隆抗体为一抗，HRP-SPA为二抗进行Western blot实验，结果显示3株单克隆抗体能特异性地识别提取天然蛋白中的Pla成分，而与其它成分未发生反应。所以，本发明所制备的Pla单克隆抗体为进一步深入研究Pla的功能及其致病机制奠定了基础，有利于深入探讨Pla的功能，将其用于针对Pla蛋白的检测，对于鼠疫菌的检测和/或辅助诊断，特别是对于F1抗原缺失鼠疫菌株以及非37℃条件生长的鼠疫菌株的诊断具有重要意义。

附图说明

图1显示转化体BL21-rPla诱导表达产物Pla的SDS-PAGE分析结果。图中，1：分子量标准；2：转化体BL21-rPla诱导表达后的菌体裂解后沉淀；3：转化体BL21-rPla诱导表达后的菌体裂解后上清；4：转化体BL21-rPla诱导前全菌蛋白；5：转化体BL21-rPla诱导表达后的菌体裂解后沉淀经初步纯化后的产物。

图2为秋水仙素法检查本发明的杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄的染色体核型分析图形(Giemsa染色，×1000)。

图3为纯化腹水的SDS-PAGE图形。图中，M：分子量标准；1：15B₈a；2：15B₈b；3：19A₄a；4：19A₄b；5：14H₄a；6：14H₄c；7：14H₄d。

图4显示Western blot鉴定所述单抗特异性识别天然Pla蛋白的实验结果。图中，M：预染marker；1：15B₈；2：19A₄；3：14H₄。

图5显示所述单抗的亚类检测实验结果。

图6A显示检测Pla抗原胶体金免疫层析试纸条检测28℃培养EV76菌体实验结果；图6B显示检测F1抗原胶体金免疫层析试纸条检测28℃培养EV76菌体实验结果。用于专利程序的微生物保存：

(一)分泌本发明单克隆抗体15B₈的杂交瘤细胞株15B₈

保藏日期：2010年9月16日；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；

保藏编号：CCTCC NO：C201091；

分类命名：杂交瘤细胞株15B₈。

(二)分泌本发明单克隆抗体19A₄的杂交瘤细胞株19A₄

保藏日期：2010年9月16日；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；

保藏编号：CCTCC NO：C201094；

分类命名：杂交瘤细胞株19A₄。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下各实施例中，所用原始实验材料、仪器用具及试剂均可商购获得，以下提供主要实验材料、仪器用具及试剂的来源：

1实验材料

1)BALB/c小鼠：购自上海实验动物中心(合格证号SCXK(沪)2007-0005)、

昆明医学院实验动物中心(合格证号SCXK(滇)2005-0008)。

2)小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0：购自云大生物科技有限公司。

3)rPla蛋白：购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

4)鼠疫耶尔森氏菌EV76菌株：购自云南省地方病防治所菌种库。

2实验仪器及用具

  仪器用具名称  厂家  0.22μm一次性滤膜  Millipore  0.45μm一次性滤膜  Millipore  6孔\24孔\96孔细胞培养板  Falcon  细胞冻存管  Falcon  96孔酶标反应板  Coster  细胞计数板  Sigma  Milli-Q超纯水系统  Millipore  pH计  Orion  全自动高压蒸汽灭菌器  Hirayama  超净工作台(HF Safe 1200)  Forma  CO₂细胞培养箱  Forma  电子天平  Sartorius  倒置显微镜  LEICA  普通光学显微镜  Nikon  液氮罐  Forma  普通冰箱  青岛海尔

  超低温冰箱  Revco ULT-1386-3V  洗板机  BIO-RAD 1575  酶标仪  BIO-RAD550型  低速离心机  北京医用离心机厂  AKTA explorer 100，AKTA primer  Amersham Pharmacia  丙烯酰胺凝胶电泳系统  BIO-RAD  电转印转膜系统  BIO-RAD Trans Blot SD

3主要试剂

  试剂名称  厂家  DMSO(二甲基亚砜)  Sigma  HT(50×HT Media Supplement)  Sigma  HAT(50×HAT Media Supplement)  Sigma  BSA(牛血清白蛋白)  Hyclone  FBS(胎牛血清)  Hyclone  FCS(新生牛血清)  Hyclone  青霉素、链霉素  国产  PEG-1500  Fluka  抗体亚类鉴定试剂  HyCult Biotechnology  TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)  BBI  HRP-羊抗鼠IgG  Sigma  台盼蓝  上海生工  Tween-20  上海生工  Giemsa  上海生工

  EDTA  上海生工  SDS  Invirtogen  溶菌酶  上海生工  过硫酸铵，甘氨酸  上海生工  考马斯亮蓝R-250  上海生工  甲醇  上海生工  冰醋酸  上海生工

4主要试剂的配制

4.1细胞培养用溶液

1)DEME不完全培养基(1000ml)：用纯水溶解DMEM干粉13.4g、Na₂CO₃ 3.7g，待完全溶解后加入青霉素、链霉素各20万单位，定容至1000ml，经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。

2)DEME完全培养基(1000ml)：无菌条件下，取1)方法配制的DEME不完全培养基800ml，加入200ml FBS/FCS，轻摇混匀。

3)台盼蓝母液：称取台盼蓝4.0g，用纯水彻底研磨，过滤去除杂质，室温保存。使用时用1.8％生理盐水与母液按1∶1比例混合为工作液，工作液与细胞培养悬液等体积混合进行活细胞计数。

4.2ELISA实验用溶液

1)包被缓冲液(pH 9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃    1.59克

NaHCO₃    2.93克

加蒸馏水至1000ml，将pH值调至9.6，4℃保存。

2)洗涤缓冲液PBS-T(pH7.4 0.15M)

KH₂PO₄            0.2克

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9克

NaCl              8.0克

KCl               0.2克

Tween-20          0.5ml

加蒸馏水至1000ml，将pH值调至7.4，4℃保存。

3)封闭液

牛血清白蛋白(BSA)  1.0克

加洗涤缓冲液至100ml；

或用牛血清与洗涤液配成5～10％使用，4℃保存。

4)底物液A

0.1M柠檬酸(19.2g/L)      24.3ml

0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)    25.7ml

加蒸馏水至50ml。将pH值调至9.6，4℃保存。

5)底物液B

柠檬酸                  10.52g

EDTA                    1.86g

甘油                    50ml

加蒸馏水至2000ml，将pH值调至9.6，4℃保存。

6)TMB工作液

DMSO                    2ml

TMB                     5mg

4℃保存。

7)终止液

2mol/L H₂SO₄，室温保存。

4.3细胞核型分析用溶液

1)秋水仙素母液

秋水仙碱                1.0mg

生理盐水                50ml

4℃保存。

2)PBS(1000ml，Giemsa染液缓冲液)

KH₂PO₄                  1.82克

Na₂HPO₄·12H₂O          19.10克

将pH值调至6.8，4℃保存。

3)Giemsa染液母液

Giemsa                  0.8g

甲醇                    50ml

甘油                    50ml

于甘油中研磨Giemsa粉末，56℃恒温水浴90min，再加入甲醇，充分搅拌，过滤后置棕色瓶中保存，使用时用PBS稀释10倍。

4)低渗处理液(100ml)称取KCl 0.559g，加蒸馏水至100ml，室温保存。

4.4SDS-PAGE电泳试剂：

1)30％丙烯酰胺溶液(100ml)

丙烯酰胺                                29.0g

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺                 1.0g

配制时需于60ml去离子水中加入以上试剂，充分搅拌至彻底溶解，再定容至100ml，4℃保存。由于丙烯酰胺是强神经毒素，配制时要避免气流，同时做好保护措施。

2)1.5mol/L Tris-Cl溶液(pH 8.8 100ml)

将18.2g Tris溶解于80ml去离子水中充分溶解，用浓盐酸调整pH值至8.8，再定容至100ml，4℃保存。

3)1.0mol/L Tris-Cl溶液(pH 6.8 100ml)

将12.1g Tris溶解于80ml去离子水中充分溶解，用浓盐酸调整pH值至6.8，再定容至100ml，4℃保存。

4)10％SDS溶液(pH 6.8 100ml)

将10g SDS溶解于80ml去离子水中，充分搅拌溶解，用浓盐酸调整pH值至6.8，再定容至100ml，室温保存。使用前需确定是否因室温过低有SDS析出。

5)10％过硫酸铵溶液(1.0ml)(Ap)

将0.1g过硫酸铵溶解于1.0ml去离子水中，盛于棕色瓶内4℃保存。最多可储存10天，过期需重新配制。

6)浓缩胶(10％)

30％丙烯酰胺                       3.35ml

10％SDS                            25ul

0.5mol/L Tris-C1溶液(pH 6.8)       6.25ml

TEMED                              3ul

10％Ap                             25ul

超纯水                             1.5ml

7)分离胶(4％)

30％丙烯酰胺                       2.5ml

10％SDS                            0.06ml

1.5mol/L Tris-Cl溶液(pH 8.8)       1.5ml

TEMED                              2ul

10％Ap                             30ul

超纯水                             1.92ml

8)5×SDS-PAGE电极缓冲液(储存液，1000ml)

Tris                               15.1g

甘氨酸                             94.0g

SDS                            5.0g

将以上试剂溶解于800ml去离子水中，搅拌至充分溶解，定容至1000ml后室温保存。电泳工作液为1×SDS-PAGE电泳缓冲液，使用时进行5倍稀释即可。

9)5×SDS-PAGE Loading Buffer(5.0ml)

1M Tris-Cl(pH 6.8)                    1.25ml

SDS                                   0.5g

溴酚蓝                                30.0mg

甘油                                  2.5ml

2-ME                                  0.25ml

于10ml试管中混合上述试剂，用振荡器充分混匀，室温保存。

10)考马斯亮蓝染色液(1000ml)

考马斯亮蓝R-250                       1.0g

甲醇                                  250ml

冰醋酸                                100ml

将以上试剂混合后定容至1000ml，室温保存。

11)脱色液(1000ml)

冰醋酸                                100ml

甲醇                                  250ml

去离子水                              850ml

4.5Western blot实验用试剂

电泳试剂同上所述。

1)10×转膜缓冲液(100ml)

Tris-base                             30.3g

Glycine                               144g

甲醇                                  200ml

4℃保存，使用前1∶10稀释。

2)TBS-T(1000ml)

1mol/L Tris-HCl(pH 7.4)               10.0ml

4mol/L NaCl                           37.5ml

50％Tween 20                          1.0ml

室温保存。

3)显色液按DAB 6mg、H₂O 2ul、PBS(0.01M，pH 7.4)10ml配制。

4)封闭液

于100ml TBS-T洗涤液中加入5.0g脱脂奶粉，轻轻搅拌使之完全溶解。

实施例1鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

1抗原

重组Pla蛋白：购自中国疾病预防控制中心传染病所，其是按照现有技术记载的方法制备，根据鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)Pla基因序列(NCBI：GeneID：1149148)，并去除其信号肽编码序列(第1～63位核苷酸)及终止密码子(第934～936位核苷酸TGA)，设计5’端正义引物Pla-s和3’端反义引物Pla-a，在引物的5’端人工加上酶切位点序列及保护碱基，具体为，Pla-s：5’CCGGAATTCTCATCTCAGTTAATACCAAAT-3’(SEQ IDNo.：1，下划线部分序列为EcoRI酶切位点)，Pla-a：5’ATTTGCGGCCGCGAAGCGATATTGCAGAC-3’(SEQ ID No.：2，下划线部分序列为NotI酶切位点)，引物委托上海生工合成。将去掉信号肽编码序列的Pla基因片段与质粒pGEX4t-1通过EcoRI和NotI双酶切位点进行连接，将重组质粒(Pla-pGEX4t-1)转化入E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，含有重组质粒Pla-pGEX4t-1的BL21菌，经诱导产生了分子量约为58.6kD的rPla融合蛋白，表达包涵体产物(rPla)经反复洗涤进行纯化。样品经SDS-PAGE分析，实验结果采用TotalLab 1.0软件分析，其纯度约为85％(SDS-PAGE分析结果参见图1)。

天然Pla蛋白：按照常规方法提取制备，具体操作如下：鼠疫EV76菌接种于LB培养基，28℃孵育48h，用PBS洗涤菌体两次，加入4倍体积-40℃预先低温的丙酮，充分混匀，置-40℃过夜后，4000r/min，10min离心，弃上清，再用预冷丙酮洗涤菌体3次，弃尽丙酮，37℃温箱过夜制成菌粉。菌粉经超声破碎、0～10％硫酸铵沉淀，8000r/min，30min离心，收集沉淀。

重组GST蛋白：购自云大生物科技有限公司。

2间接ELISA检测方法的建立

间接ELISA检测方法的建立按常规方法进行，以rPla蛋白、天然Pla蛋白及重组GST分别包被酶标板，HRP-羊抗鼠(购自Sigma)为酶标二抗。采用方阵滴定法确定最佳抗原包被量和酶标二抗工作浓度。根据实验结果，3种抗原的包被浓度分别为：天然Pla蛋白5μg/ml、重组pla蛋白10μg/ml，GST 2μg/ml；酶标二抗最适工作浓度1∶8000。具体操作步骤如下：

(1)包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释后，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤。

(2)封闭：每孔加0.2ml 1％牛血清白蛋白或5～10％牛血清进行封闭。，4℃过夜，洗板。

(3)加样：加入经过一定稀释的待测样品0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

(4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入最适工作浓度的酶标第二抗体0.1ml，37℃孵育45～60min，洗涤。

(5)加底物液显色：于各反应孔中加入临用时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30min。

(6)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05ml。

结果判定：在酶标检测仪上检测A₄₅₀值，无论何种包被抗原，以大于阴性对照值的2.1倍为阳性。以rPla和天然Pla检测均为阳性才能确认为阳性杂交瘤。

3BALB/c小鼠的免疫

选择4～6周龄、体质量16～20g、雌性BALB/c小鼠16只，随机分为4组(A～D组)，每组4只进行免疫(免疫抗原为前述购自中国疾病预防控制中心传染病所的重组Pla蛋白)。共进行4次免疫，采用鼠背部皮下多点注射和腹腔注射，初次免疫用完全佐剂与等量抗原充分乳化，以后用不完全佐剂，每两次免疫间隔时间为3周。免疫后10～14天采尾血检测血清抗体效价。检测结果表明A、B两组小鼠血清效价均达到了1∶10⁴～10⁵，可以用于进行细胞融合。

选择抗体效价高的小鼠，在融合前3天进行加强免疫，免疫剂量为每只小鼠200μg，腹腔注射。基础免疫情况见下表：

4杂交瘤细胞株的建立

4.1融合前细胞的制备

1)骨髓瘤细胞的制备

融合前1周，取液氮中保存的Sp2/0骨髓瘤细胞，37℃水浴迅速解冻，以DEME培养液悬浮细胞，1000r/min离心10min，弃上清。以含20％牛血清DEME培养液重悬细胞，置5％CO₂、37℃孵箱中培养。当细胞生长至对数生长期时，按1∶3～1∶10的比例稀释进行传代培养。融合前2～3天调整细胞密度，使其在融合时处于生长旺盛、状态良好。进行融合的当天，将骨髓瘤细胞吹下，制成悬液以1000r/min离心10min，弃上清，用适量的不完全培养液重悬细胞，进行细胞计数。

2)饲养细胞的制备

进行融合前一天或进行再克隆时，取BALB/c小鼠脱颈处死，75％酒精浸泡、消毒处理。无菌条件下剪开腹部皮肤，将4～5ml不完全培养液注入小鼠腹腔内，轻轻进行按摩，再用注射器抽出培养液，重复2～3次。取得的细胞悬液1000r/min离心10min，弃上清，用DEME完全培养液重悬细胞，调整细胞密度，将其滴加96孔细胞培养板或培养瓶，37℃、5％CO₂培养箱培养过夜后使用。

3)免疫小鼠脾细胞的制备

进行细胞融合的当天，将已经加强免疫的BALB/c小鼠取眼血后脱颈处死，75％酒精浸泡消毒约10min。无菌条件下剪开皮肤、腹膜，取出脾脏，置于盛有适量DMEM不完全培养液的平皿内，剔除脂肪和结缔组织等，在不锈钢筛网中用注射器芯挤压脾脏，使脾细胞进入培养液中，收集细胞悬液、1000r/min离心10min，弃上清。用不完全培养液重悬细胞，进行计数，备用。

4.2细胞融合及筛选

加强免疫3天后，无菌手术取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。具体操作：

1)将已计数的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞按1∶4～10的比例混合，置于锥形离心管中，1200r/min离心10min，弃上清，轻轻震动离心管，使细胞分散均匀，置37℃水浴保温。

2)边搅拌细胞边加入1.0ml预温至37℃的50％PEG-1500溶液，1min内滴加完。

3)轻轻滴加10ml DMEM不完全培养液，3min内加完，1000r/min、10min离心，弃上清。

4)轻轻震动离心管，使细胞分散均匀，加入40ml HAT-DMEM-20％FBS培养液，悬浮细胞，将其滴加入前一日已制备饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔0.1ml。每孔补加培养液至八成满。

5)将培养板放5％CO₂、37℃培养箱内培养。

6)每天仔细观察和记录融合细胞生长情况，每3天更换一次半量HAT完全培养液，连续培养7～14天，更换为HT-DMEM-20％FBS完全培养液。

7)待细胞长至孔底的1/2～1/3，取细胞培养上清，采用间接ELISA法进行抗体效价检测，筛选阳性克隆细胞株，选取对rPla和天然Pla蛋白有交叉反应、对重组GST无结合的细胞株。

本实施例中，选择了血清抗体检测结果较稳定、效价高的四只小鼠(编号为A2、A4、B2、B4)进行了4次细胞融合实验，各次实验参数如下表：

融合后的细胞在HAT-DMEM-20％FBS培养液中选择性培养时，培养液中仅有脾细胞与Sp2/0-骨髓瘤细胞发生融合的细胞才能生存，未融合的细胞5～7天后自然死亡。在融合后约10天左右、细胞长至孔底的1/2～2/3时，取细胞上清采用间接ELISA法检测抗体效价。结果见下表：

本实施例中，细胞融合率和阳性率请参见下表(融合率：表示融合得到的杂交瘤细胞在所有检测孔中占的比例，反映融合操作的成功率，一般与融合技术、血清、培养基的应用等有关。阳性率：指在间接ELISA法检测中A₄₅₀值＞阴性对照2.1倍的杂交瘤细胞在总的杂交瘤细胞中所占的比例，反映小鼠的免疫效果)：

  小鼠编号  有克隆生长孔数  融合率  阳性率  备注  A2  768  100％  99.86％  板号1-8  A4  457  79.34％  99.78％  板号9～14  B2  576  100％  99.65％  板号15～20  B4  380  65.97％  100％  板号21～26

4.3杂交瘤细胞的单克隆化

1)转板培养：在上述筛选出的阳性克隆孔中共选择156孔，从96孔培养板转至24孔培养板中，于DEME完全培养液中培养3～4天。

2)复测：待24孔板上克隆长至孔底约1/2时，取细胞上清进行ELISA复测，复测共获得36株阳性株。即GST(-)、rPla(+)、天然Pla(+)。(说明大部分瘤株在筛选过程中已丧失分泌能力，这也是新融合产生的杂交瘤常见的问题，所以需经过多次反复筛选，才能得到具有稳定分泌能力的细胞株)。挑选复测时与天然Pla抗原包被孔A₄₅₀值较高、与GST包被抗原呈阴性反应且生长状态好的21株瘤株进行单克隆化，其余阳性株冻存。

3)采用有限稀释法(Limiting dilution method)进行杂交瘤细胞的克隆化。具体操作如下：

a.将待进行克隆化的杂交瘤细胞制成悬液，台盼蓝染色计数活细胞数。

b.用DEME不完全培养液进行连续倍数稀释，使其成为每ml含10000个、1000个、100个、10个的细胞的悬液，最后一次稀释使用含20％FCS的完全培养液。

c.按前面所述方法制备饲养细胞，按每孔100μl加入96孔细胞培养板，含10个/ml的待克隆细胞悬液每孔加入100μl，使其理论上每孔加入了1个细胞。

d.培养1周后，镜检培养孔的每一视野，挑选出只有1个克隆生长的孔并标记，待克隆长至孔底的1/3～1/2时，取上清用间接ELISA法检测抗体效价。

e.挑选与天然Pla反应A₄₅₀值较高、与GST无反应、生长状态良好的细胞株，转24孔板培养并复测上清效价，按上述步骤进行下一次克隆化和冻存保种。

f.2～3个月后，复苏冻存的杂交瘤株，按上述步骤进行二次克隆化。

本实施例中，共进行3次克隆化(3株阳性株结果请参见下表，其余细胞株在克隆化过程中丧失分泌能力)，最终筛选得到3株能稳定分泌抗天然Pla蛋白的杂交瘤细胞株，本实施例中分别命名为杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄。将这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别命名为单克隆抗体15B₈、单克隆抗体19A₄、单克隆抗体14H₄。

从上表结果可以看出，本实施例中，在第3次克隆化后，本发明的杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄的阳性率均达到100％。

本发明中，已将所述的杂交瘤细胞株15B₈和杂交瘤细胞株19A₄保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉市武汉大学，邮政编码：430072)，其中，分泌本发明单克隆抗体15B₈的杂交瘤细胞株15B₈保藏日期：2010年9月16日，保藏编号：CCTCCNO：C201091，分类命名：杂交瘤细胞株15B₈；分泌本发明单克隆抗体19A₄的杂交瘤细胞株19A₄保藏日期：2010年9月16日，保藏编号：CCTCC NO：C201094，分类命名：杂交瘤细胞株19A₄。

5杂交瘤细胞染色体核型分析

检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下：

1)在加秋水仙素前48～36h将杂交瘤细胞传代。

2)秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素(100μg/ml，除菌，-20℃保存)，使最终浓度为0.1～0.4μg/ml。37℃继续培养4～6h，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清。

3)低渗处理：轻轻叩击离心管底部，使细胞混匀。加入已预温至37℃的0.075mol/LKCl溶液5.0ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴低渗处理25min。

4)预固定：向悬液中加入新鲜配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)1.0ml，逐滴加入，用吸管吹打混匀，室温固定20min。

5)固定：1000r/min离心10min，弃上清，轻轻叩击离心管底部，使细胞与残存溶液混匀，沿管壁缓慢加入新鲜配制的固定液2～5ml，室温静置30min，1000r/min离心10min，弃上清。于细胞沉淀中加入10～15倍细胞沉淀体积的新鲜固定液，吹打均匀。

6)制片：取出离心管，轻轻吸弃上清液，根据细胞压积多少而留下0.5～1.0ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1～2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。

7)染片：用新配制的10％Giemsa染液染色15～20min，用自来水洗去染液，自然干燥。

8)镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

本实施中，秋水仙素法检查杂交瘤细胞染色体分析结果表明(参见图2)，本发明的杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄的染色体数均在95～108条间，数目基本接近脾细胞和Sp2/0的染色体数目之和。从染色体的形态上分析，具有杂交瘤细胞株的特点：既有小鼠脾细胞的端着丝点染色体，又有骨髓瘤细胞的中着丝点染色体。

6杂交瘤细胞株的冻存与复苏

6.1杂交瘤细胞的冻存

1)将待冻存的细胞悬液1200r/min离心10min，弃上清液。

2)加入细胞冻存液(新生牛血清、DMEM培养液、DMSO按5∶4∶1配制)，混匀成细胞悬液分装于冻存管中，置于隔离盒内。

3)采用慢速冷冻法，放置于-20℃冰箱1～2h，-70℃低温冰箱内过夜，再移入液氮(-196℃)内，可长期保存。

6.2杂交瘤细胞的复苏

复苏时，从液氮中取出冻存管，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。用5～10ml完全培养液稀释，1000r/min离心10min，弃上清，再悬浮于适量完全培养液中，转入培养瓶或24孔板中，置37℃、5％CO₂培养。转入时可先加入饲养细胞。

7腹水的制备

按照常规方法，将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔中以诱导产生腹水，具体操作如下：

1)每只BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。

2)将杂交瘤细胞扩大培养生长至对数期，吹下细胞制成悬液，调整细胞密度至1.3×10⁶～1.4×10⁶个/ml。

3)注射液体石蜡7～14天后，每只BALB/c小鼠腹腔注射上述细胞悬液0.5ml，每株杂交瘤细胞注射数只小鼠。

4)7～10天后，小鼠腹部明显膨胀时1～2天抽取1次腹水，。将收集的腹水12000r/min离心10min，弃除底部沉淀及上层的脂肪等成分，纯化或低温保存待用。

8单克隆抗体的纯化

按照以下操作对所收集的含单克隆抗体的腹水进行纯化：

1)按HiTrap Protein G预装柱(1.0m1)所附说明书操作。用至少5倍柱体积的上样缓冲液Binging buffer A平衡柱，使柱中溶液环境稳定，并使纯化仪所示的OD₂₈₀吸光度基线为0并保持稳定。

2)将腹水以12000r/min离心10min，去除脂肪层和沉淀，用上样缓冲液Bingingbuffer A等体积稀释，以0.45μm滤膜过滤除去气泡。

3)将以上处理的腹水样品加入上样器，用上样缓冲液Binging bufferA以1.0ml/min的流速上样。

4)用上样缓冲液Binging buffer A按2.0ml/min的流速洗柱，直至纯化仪所示的OD₂₈₀吸光度基线为0并保持稳定。

5)用Elution buffer B按2.0ml/min的流速洗柱，直至纯化仪所示的OD₂₈₀吸光度基线为0并保持稳定。收集各个洗脱峰。

6)用上样缓冲液Binging buffer A洗柱，使柱中溶液环境稳定，直至纯化仪所示的OD₂₈₀吸光度基线为0并保持稳定。

7)SDS-PAGE电泳检测各个洗脱峰。

8)将所得抗体用25mmol/L Tris-C1 pH8.0透析48h以上，其间更换3次缓冲液，缓冲液体积至少为抗体体积的20倍。短期使用4℃保存，长期则小量分装-20℃保存。3株杂交瘤株共7个亚株腹水经Protein G纯化，SDS-PAGE分析纯化效果，结果见图3。经软件分析计算，纯度均达95％以上。腹水纯化前和纯化后效价检测见下表。

腹水纯化前、纯化后效价检测结果

  细胞株编号  纯化前(1：)  纯化后(1：)  14H4a  3.2×10⁶  10⁴  14H4c  3.2×10⁶  10⁴  14H4d  3.2×10⁶  10⁴  19A4a  1.6×10⁶  10⁴  19A4b  1.6×10⁶  10⁴  15B8a  1.6×10⁶  10⁴  15B8b  1.6×10⁶  10⁴

9单克隆抗体的初步鉴定

9.1抗体效价测定

用间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养72h上清及腹水中抗体效价，包被浓度天然Pla 5μg/ml，HRP-羊抗鼠工作浓度1∶8000。

结果见下表(瘤株号后的小写字母代表亚株编号)。

  瘤株号  上清(1：)  腹水(1：)  15B8a  25600  1.6×10⁶  15B8b  12800  1.6×10⁶  19A4a  25600  1.6×10⁶  19A4b  25600  1.6×10⁶  14H4a  25600  3.2×10⁶  14H4c  25600  3.2×10⁶  14H4d  25600  3.2×10⁶

9.2抗体特异性鉴定

1)间接ELISA法检测抗体特异性

由于本发明中所得杂交瘤株免疫用抗原为重组Pla(rPla)抗原，该蛋白是与纯化标签GST结合的融合蛋白，所以在筛选时，分别用rPla、天然Pla、GST三种蛋白作为包被抗原来检测。

对本发明的杂交瘤细胞株15B₈、杂交瘤细胞株19A₄、杂交瘤细胞株14H₄培养上清，采用间接ELISA法，以3种抗原包被进行检测，结果均为：天然Pla(+)、rPla(+)、rGST(-)。

2)Western Blotting鉴定抗体特异性

a、SDS-PAGE：将天然Pla蛋白按常规方法进行SDS-PAGE；

b、膜处理：预先裁剪好与胶块同样大小的PVDF膜，浸入甲醇中40s进行活化，取出后置入转膜液中；

c：平衡：电泳结束后将胶条割至合适的大小，放入转膜液中，同时将裁好的滤纸片也放入，缓慢震摇20min；

d：转膜：按自下而上依次放置滤纸片、PVDF膜、凝胶、滤纸片的顺序放置于转膜仪中，滤纸片、凝胶与PVDF膜精确对齐(或自下而上逐渐减少)，每一步用玻璃棒去除气泡，并将多余的液体吸干，安装好转膜仪，接通电源，恒压25V，转移1h.；

e、封闭：将PVDF膜从转膜仪中取出，放置于膜封闭液中，室温下摇床封闭过夜；

f、用洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；

g、以稀释缓冲液按1∶1000稀释己纯化的4℃保存腹水，将洗好的膜放入，液体需覆盖膜的全部，37℃摇床摇动1h；

h、弃腹水稀释液，以洗涤缓冲液分别洗膜3次，每次5min；

i、将HRP-SPA以稀释液稀释至工作浓度(1∶40000)，加入上述洗好的膜，37℃摇床摇动1h；

j、弃HRP-SPA工作液，用洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；

k、将膜加入DAB显色液中显色5min，取出膜ddH₂O冲洗，凉干后扫描仪扫描结果。

本实施例中，以小鼠腹水为一抗，HRP-SPA为二抗进行Western blot鉴定；结果显示，3株杂交瘤所获单克隆抗体能特异性地识别提取天然Pla蛋白的两条分子量带。结果见图4(因Pla有三种形式：α-Pla、β-Pla、γ-Pla，相对分子质量(Mr)分别为37000、35000、31000。本实验应用的天然Pla蛋白经质谱分析(4700型飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF-MS，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，在相对分子质量(Mr)约为31000、35000的条带中含有Pla，因而本实验出现两条显色带)。

3)抗体亚类鉴定

应用购自Hyult biotechnology b.v.的鼠单克隆抗体亚型测定试剂盒进行单克隆抗体亚类鉴定。具体方法：当杂交瘤细胞在DMEM-20％FCS培养液中生长至约培养面一半时，逐渐换为ADCF无蛋白细胞培养液(ADCF培养液全称为Animal Derived Component Free.是Hyclone公司生产的无血清细胞培养系列产品之一。本实验采用的是SH3034.02产品，该培养液含4.6mM谷氨酰胺，1.0g/L Pluronic F-68，不含酚红)进行培养，3～4天后收集上清，1000r/min离心10min，去沉渣。用该细胞上清按试剂盒要求加入反应管中，摇动直至两个显色点出现，即抗体亚型和轻链型别。亚类测定结果见下表及图5。因14H₄、19A₄两株杂交瘤株属于不同亚类，且在多次检测中该两株单抗效价稳定(该两株杂交瘤株经连续多次传代及1个月、3个月液氮冻存细胞株复苏后培养上清的检测，抗体效价一致，表明均具有良好的分泌稳定性)，具有良好应用前景。

杂交瘤细胞产生的抗体亚类检测结果

  瘤株编号  抗体亚类  轻链类型  14H₄  IgG2a  K  15B₈  IgG2a  K  19A₄  IgGl  K

实施例2Pla单克隆抗体的应用

应用本发明建立的能分泌抗鼠疫Pla蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，按常规方法，制备腹水，腹水经纯化后，制备胶体金免疫层析检测试纸条，进行实验室测试。

鼠疫EV76菌株复苏后，传代培养，制备经28℃培养的菌悬液，比浊法确定菌液浓度，以碳酸盐缓冲液(pH7.4)稀释为不同浓度进行检测。并与F1抗原检测试纸条作并列对比实验。

结果请参见下表及图6A和图6B，Pla抗原检测胶体金免疫层析试纸条能检出28℃培养、菌浓度1×10⁶个菌/ml的鼠疫EV76菌(图6A)，而F1抗原检测胶体金试纸条仅能检测至7×10⁸个菌/ml的鼠疫EV76菌(图6B)。这说明对于非37℃生长的鼠疫菌，因F1抗原不表达或较少表达，按常规方法检测时会造成假阴性，有可能漏诊，但Pla可被检出，该方法有作为鼠疫的辅助诊断的可能。